CN116034164A

CN116034164A - 工程改造含油微生物的方法

Info

Publication number: CN116034164A
Application number: CN202180024251.1A
Authority: CN
Inventors: P·布兰达尔迪; R·D·迪罗伦佐
Original assignee: Pirelli Tyre SpA
Current assignee: Pirelli Tyre SpA
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-04-28
Also published as: EP4127201A1; WO2021198904A1

Abstract

本发明涉及工程改造含油微生物的方法，由这种方法获得的工程化含油微生物，以及通过在含生物质的培养基中培养来生产从这种工程化的含油微生物中获得的增塑油的方法。

Description

工程改造含油微生物的方法

技术领域

本发明涉及工程改造含油微生物的方法、获自这种方法的工程化含油微生物以及通过在含生物质的培养基中培养来生产从这种工程化的含油微生物获得的增塑油的方法。

现有技术

增塑油或加工油用于工业，例如轮胎工业。增塑油是石化衍生产品，与日常生活中的其它产品诸如燃料、塑料、合成纤维、溶剂、肥料、精细化学品和药物制剂的成分一样。

这些油根据链烷烃、环烷烃和芳烃的含量进一步分类。

增塑油包括温和萃取溶剂(MES)矿物油、处理过的馏出芳烃提取物(treateddistillate aromatic extracts,TDAE)、环烷油(NAP)、残留芳烃提取物(RAE)(改编自SUCHIVA,Krisda“Introduction to Process oils”，Research and Development Centrefor Thai Rubber Industry,Mahidol University)。

与矿物油相关的问题与原材料的不可再生性有关(在与其消耗相容的时间内)。

新的生物经济趋势基于通过具有减小的环境影响的可持续过程进行的新合成的生物质的开发和增强。

这种生物质代表生物炼制的原材料，其中该术语意指生产系统，其能够在与其用途相容的时间内将可再生基质转化为一系列产品，所述产品可包括生物能源、生物燃料和生物材料，这现在可以从石油开始。生物炼制的核心通常是生物过程，或由活生物体进行的转化，或源自它们的酶促活性，伴随着可持续的化学过程。在这种技术中，可以使用均质且容易转化的底物，诸如单体形式的糖或淀粉：在这种情况下，生物炼制被定义为第一代。或者，第二代生物炼制提供了使用残余生物质作为原料的可能性，所述生物质通常具有不均一的性质，诸如木质纤维素。

第一代生物炼制构成了增塑油的替代来源，如专利(WO2012012133；US 8,969,454B2；WO2012085014；WO2013189917；Wo2012085012)中所述，其中由甘油三酯混合物组成的植物油用作用于轮胎配方的填充(和/或增塑)油。如先前介绍的，原料或起始底物引起了实际和伦理问题：事实上，可食用生物质的使用与农业和食物链重叠，因此与农业和食物链竞争，其可用性受季节性和气候可变性的影响。

可以使用微生物将残余的生物质转化成目标化合物，包括油。在微生物中，酵母构成了开发生物过程的有效平台，因为它们中的许多是可遗传处理的且稳定，易于生长，使用安全(事实上很少有酵母因其对人、植物或动物的致病性而为人所知，不遭受噬菌体攻击)。

特别地，各种酵母物种被描述为含油的，即特征在于油含量高于干生物质的20％。此外，通过适当改变生长条件，它们的积累能力上升到70％以上(如在Thevenieau,F.等人“Microorganisms as sources of oils.”Ocl 20.6(2013):D603中所描述的)。

通过非穷尽性的描述，由油微生物生产的油可以用于各种应用，诸如(i)生物柴油工业中，其中使用获自红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)和小球藻属某些种(Chlorella spp.)的微藻的微生物油(如X.Zhao等人，“Effects of some inhibitors onthe growth and lipid accumulation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides and preparation of biodiesel by enzymatic transesterification ofthe lipid”,Bioprocess Biosyst.Eng.,35(2012)；Li,Yecong等人“Characterization ofa microalga Chlorella sp.well adapted to highly concentrated municipalwastewater for nutrient removal and biodiesel production.”Bioresourcetechnology 102.8(2011):5138-5144中所描述的)以及(ii)在生物燃料工业和食品工业中作为多不饱和脂肪酸的替代来源，其中使用由含油酵母斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)产生的油(如Angerbauer,Christoph，等人“Conversion of sewage sludgeinto lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production.”Bioresourcetechnology 99.8(2008):3051-3056中；以及Blomqvist,Johanna，等人“Oleaginous yeastas a component in fish feed.”Scientific reports 8.1(2018):15945中所描述的)。

因此，在第二代生物炼制中，使用来自其它工业过程的残余生物质和/或不与食物链竞争的生物质(如Naik,S.N等人“Production of first and second generationbiofuels:a comprehensive review.”Renewable and sustainable energy reviews14.2(2010):578-597中；和Stichnothe,H.等人“Development of Second-GenerationBiorefineries.”Developing the Global Bioeconomy.2016.11-40中所描述的)。

此外，在工程改造含油微生物后获得的应用的进一步实例在文献中有报道：由于Δ-9去饱和酶酶促活性的部分阻断而突变的酵母Criptococcus curvatus，允许获得具有类似于可可脂的组成的油(如Hassan,Mainul等人“Production of cocoa butterequivalents from prickly-pear juice fermentation by an unsaturated fatty acidauxotroph of Cryptococcus curvatus grown in batch culture.”ProcessBiochemistry 30.7(1995):629-634中所描述的)；并且红冬孢酵母的野生型和突变型菌株已经被用作产油者，用于生产生物柴油和含油化学品的油(如WO2016/185073和Koutinas,Apostolis A.等人，“Design and techno-economic evaluation of microbial oilproduction as a renewable resource for biodiesel and oleochemicalproduction”，Fuel 116(2014):566-577中所描述的)。

发明内容

鉴于本领域已知的内容，本申请人还开发了一种工程方法，其允许获得过表达编码参与脂肪酸生物合成过程的酶促活性、特别是(i)Δ-9去饱和酶和(ii)Δ-12去饱和酶的内源基因组合的含油酵母。

本申请人令人惊奇地观察到，从如此工程化的含油酵母中获得的油特别富含单不饱和脂肪酸，与预期富含多不饱和脂肪酸不同。

因此，本发明的第一方面在于一种工程改造含油微生物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供含油微生物；

(b)将编码Δ-9去饱和酶的基因插入到所述含油微生物中；

(c)将编码Δ-12去饱和酶的基因插入到所述含油微生物中；

(d)选择所得的工程化微生物。

根据本发明的第一方面的一个实施方案，所述微生物是包含隐球菌属(Cryptococcus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)的组中的含油酵母。

根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，所述微生物属于以下物种的菌株：弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、发酵丝孢酵母(Trichosporon fermentans)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，更优选圆红冬孢酵母和斯达氏油脂酵母。

根据本发明的第一方面的一个替代实施方案，所述微生物是由以下组成的组的微藻：椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、杜氏藻属的某一种(Dunaliella sp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、Neochloris oleabundans、新颖拟绿球藻属的某一种(Pseudochlorococcum sp.)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、周氏扁藻(Tetraselmischui)、扁藻属的某一种(Tetraselmis sp.)、四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)、钙质角毛藻(Chaetoceros calcitrans)CS 178、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟勒氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、微小菱形藻(Nitzschia cf.pusilla)YSR02、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)F&M-M40、骨条藻属的某一种(Skeletonema sp.)CS 252、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)CS 173、寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、等鞭金藻属的某一种(Isochrysis sp.)、等鞭金藻的某一种(Isochrysis sp.)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)、眼点微拟绿球藻(Nannochloropsisoculate)、眼点微拟绿球藻(Nannochloropsis oculata)NCTU-3、微拟绿球藻属的某一种(Nannochloropsis sp.)、盐生巴夫藻(Pavlova salina)CS 49、红胞藻属的某一种(Rhodomonas sp.)和威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)。

根据本发明的第一方面的一个替代实施方案，所述微生物选自由以下组成的组：真菌和原生生物，例如土曲霉(Aspergullus terreus)、紫色麦角菌(Clavicepspurpurea)、亚团黑粉菌属(Tolyposporium)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、裂殖壶菌(Schizochitrium limacynum)。

根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，编码在酵母中过表达的Δ-9去饱和酶的基因是具有序列(SEQ ID NO:1)的斯达氏油脂酵母的OLE1。

根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，编码在酵母中过表达的Δ-12去饱和酶的基因是具有序列(SEQ ID NO:2)的斯达氏油脂酵母的FAD2。

根据本发明的第一方面的一个优选实施方案，所述含油微生物是斯达氏油脂酵母。

在其第二方面，本发明还涉及用本发明第一方面的方法获得的工程化的含油微生物，其特征在于与野生含油微生物相比，碳流被导向具有改变的脂质分布的油的合成。

用本发明第一方面的方法获得的工程化的含油微生物适用于从生物质开始生产油。

因此，本发明的第三方面涉及包含增塑油的增塑油的生产方法，其包括以下步骤：

(a)在含生物质的培养基中培养通过本发明的第一方面的方法获得的工程化的含油微生物，所述生物质含有5至20的碳氮摩尔比；

(b)通过碳氮摩尔比的值等于或大于30，优选在30与100之间变化而导致不平衡；

(c)从所述培养基中分离工程化的含油微生物；以及

(d)从含油微生物中提取油。

根据本发明的第三方面的一个实施方案，所述生物质包含至少一种选自由以下组成的组中的有机碳源：粗甘油、糖蜜、木质纤维素、甜菜浆、乳清、淀粉残渣、废水、废油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖、乙酸酯和/或其组合。

具体实施方式

出于非限制性说明的目的，现在将根据本发明的优选实施方案，特别参考附图来描述本发明，其中：

图1显示了圆红冬孢酵母在生物反应器中的发酵曲线，其中主要参数与获得微生物油1(OIL 1)相关；

图2显示了斯达氏油脂酵母在生物反应器中的发酵曲线，其中主要参数与获得微生物油2(OIL 2)相关；

图3显示了重组载体pLS01的图谱，所述载体携带来源于质粒pZ₅的nurseotricin抗性(NrsR)基因的表达盒(Branduardi等人，“Biosynthesis of vitamin C by yeastleads to increased stress resistance.”PLoS One,2,e1092,2007)；

图4显示了重组载体pLS02的图谱，所述重组载体来源于pLS01并携带多克隆位点(MCS)；

图5显示了重组载体pLS02-OLE1的图谱，所述载体来源于pLS02并携带(在MCS中)编码斯达氏油脂酵母DSM70295的Δ-9去饱和酶的推定内源基因的表达盒；

图6显示了来源于pLS02-OLE1的片段，其包含携带编码Δ-9去饱和酶(OLE1)的推定基因和nurseotricin抗性(NrsR)基因的表达盒：这种表达盒优选在同源末端整合；

图7显示了重组载体pLS03的图谱，所述重组载体pLS03携带来源于质粒pZ₄的潮霉素B抗性基因(HygR)的表达盒(Branduardi等人，“The yeast Zygosaccharomyces bailii:a new host for heterologous protein production,secretion and for metabolicengineering applications.”FEMS yeast research 4.4-5(2004):493-504)；

图8显示了重组载体pLS04的图谱，所述重组载体来源于pLS03并携带多克隆位点(MCS)；

图9显示了重组载体pLS04-FAD2的图谱，所述重组载体来源于pLS03并携带(在MCS中)编码源自斯达氏油脂酵母DSM70295的Δ-12去饱和酶的内源基因的表达盒；

图10显示了来源于pLS04-FAD2的片段，所述片段包含携带编码Δ-12去饱和酶(FAD2)的基因和潮霉素B抗性(HygR)基因的表达盒：这种表达盒优选在同源末端整合；

图11显示了与电泳运行相关的图像，所述电泳运行的进行是为了确认携带编码Δ-9去饱和酶的推定基因(OLE1)和nurseotricin抗性基因(NrsR)的表达盒的成功整合(照片A)，以及证实携带编码Δ-12去饱和酶的基因(FAD2)和潮霉素B抗性基因(HygR)的表达盒的成功整合(照片B)，其中1代表PCR阴性对照(水)，2代表整合阴性对照(DNA斯达氏油脂酵母)，3代表整合阳性对照pLS04-OLE1(照片A)或pLS04-FAD2(照片B)，4代表工程化菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2；

图12显示了工程化菌株和赋予单位值的野生型对照菌株中每细胞的OLE1基因拷贝数(图A)和FAD2基因拷贝数(图B)的图；

图13显示了工程化菌株和赋予单位值的野生型对照菌株中编码Δ-9去饱和酶活性的推定基因(OLE1-图A)的表达水平和编码Δ-12去饱和酶活性的基因(FAD2-图B)的表达水平的图；

图14显示了表示与所提供的底物(甘油100g/L)的消耗相比，用于生产OIL 3的工程化菌株的生长和油性生物质的产量随时间推移的趋势的图；

图15显示了生物反应器中工程化斯达氏油脂酵母的发酵曲线，其中主要参数与获得微生物油(OIL 3)相关，其中不平衡期在图中用虚线显示；

图16显示了表示与OIL 2的组成相比，与OIL 3相关的脂肪酸组成的直方图。在图16中，星号表示根据学生氏t检验，OIL 2和OIL 3之间脂质组成差异的统计显著性(＊p<0.05,＊＊p<0.005和＊＊＊p<0.0005)；

图17显示了表示在赋予单位值的野生型对照菌株相比，相应工程化菌株中OLE1基因拷贝数(图A)和FAD2基因拷贝数(图B)的图；

图18显示了相对于赋予单位值的野生型对照菌株，相应的工程化菌株中编码Δ-9去饱和酶活性的推定基因(OLE1-图A)的表达水平和编码Δ-12去饱和酶活性的基因(FAD2-图B)的表达水平的代表性图；

图19显示了表示与OIL 3的组成相比，与OIL 8相关的脂肪酸组成的直方图。在图19中，星号表示根据学生氏t检验,OIL 8与OIL 3之间脂质组成差异的统计学显著性(＊p<0.05,＊＊p<0.005和＊＊＊p<0.0005)；

图20显示了表示与OIL 3的组成相比，与OIL 9相关的脂肪酸组成的直方图。在图20中，星号表示根据学生氏t检验的OIL 9与OIL 3之间脂质组成差异的统计学显著性(＊p<0.05,＊＊p<0.005和＊＊＊p<0.0005)。

为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则所有表示数量、数值、百分比等的数字在所有情况下都必须解释为由术语“约”修饰。此外，所有范围包括所描述的最大值和最小值点的任何组合，并且包括任何中间范围，其可能已经或可能没有在本文中具体列出。

术语“生物质”定义了任何具有有机性质的物质，其可在与其消耗相适应的时间内再生，可用于生物能源、生物燃料和生物材料的生产。这与化石生物质形成对比，化石生物质的再生时间超过消耗时间许多数量级。

术语“表达载体”定义了DNA构建体，其包含与能够导致所述DNA在合适的宿主中表达的控制序列连接的DNA序列。在本发明中，所用的典型质粒表达载体具有：a)允许质粒实际复制的复制起点，使得在所选宿主的每个细胞中有1-2或数十个拷贝的质粒载体，或允许质粒载体整合到所选宿主每个细胞的染色体中的DNA序列；b)选择标记，使得可以选择用质粒载体正确转化的细胞；c)包含限制性内切酶切割位点的DNA序列，以便能够通过称为连接的过程将外源DNA引入质粒载体。如现有技术中普遍报道的，为了达到插入宿主细胞的基因的高水平表达，编码序列必须正确地和功能性地连接到转录的调控元件，在选择的表达宿主中起作用。

本文使用的术语“转化”意指DNA一旦被导入细胞，就可以在染色体外复制或作为染色体的一部分复制。

术语“脂质体”是指存在于动物、植物、真菌和甚至细菌中的细胞内隔室，专门用于以中性脂质诸如甘油三酯和甾醇酯的形式积聚能量。

术语“含油微生物”是指能够积累相对于其干重至少20％的脂质的微生物。

术语“Δ-9去饱和酶”是指属于酶EC 1.14.19.1家族的多肽，其催化在脂肪酸链的Δ-9位置引入双键。这种反应以棕榈酸和/或硬脂酸作为其主要底物，分别产生棕榈油酸和/或油酸。

术语“Δ-12去饱和酶”是指属于酶EC 1.14.19.6家族的多肽，其催化在脂肪酸链的Δ-12位置引入双键。这种反应以油酸为其主要底物，产生亚油酸。

作为本发明的非限制性实施例，给出了以下实施例，以支持和证明由本发明的发明人开发的用于生产改性油的代谢途径。

实施例1

根据下述程序生产具有增塑作用的微生物油(OIL 1和OIL 2)。

下表1显示了与OIL 1和OIL 2相关的脂肪酸组成，以最终时重量百分比(％w/w)表示。

表1

	OIL 1	OIL 2
			C16:0:棕榈酸	30	30.6
C16:1:棕榈油酸	1	4.2
			C18:0:硬脂酸	10	6.6
C18:1:油酸	37	53.7
			C18:2:亚油酸	16	2.9
SFAs:饱和脂肪酸	42	38.9
			MUFAs:单不饱和脂肪酸	38	58
PUFAs:多不饱和脂肪酸	20	3.1

A)通过发酵过程在含油酵母圆红冬孢酵母DSM4444中生产具有增塑作用的微生物油(OIL 1)

将含油酵母菌株圆红冬孢酵母DSM4444的细胞预接种到具有以下组成的培养基中：存在甘油(15g/L)作为能源和碳源，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，浓缩100倍的富含矿物质的原液(其每升溶液含有4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升H₂SO₄ 18M)。该浓度允许获得10:1的C:N比，这被定义为经平衡以支持酵母生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的1L烧瓶中的200mL培养基中进行预接种。生长72小时后，将细胞接种在2L生物反应器中，初始DO₆₆₀约为1。与预培养所用相同的培养基的操作体积相当于在约40g/L甘油存在下的1000mL。

在适于指数生长期的发展的发酵时间后，不平衡期开始，其中向培养基中加入粗甘油以达到约50g/L的终浓度。因此，C:N摩尔比转换至约30:1的值，导致朝向以细胞分裂为代价，在所谓的脂质体中积累微生物油的代谢变化，由于氮源的缺乏，细胞分裂不能进行。

发酵参数要求生物反应器保持25℃的恒温；在1vvm(每体积培养基的空气体积)的空气流量下，溶解氧的量大于25％；pH保持在5.5，如果需要，加入4M NaOH和25％(v/v)的H₃PO₄；搅拌取决于培养中溶解氧的百分比。

接种264小时后，通过离心回收细胞，并进行酸裂解(2M HCl)以破碎细胞本身，并用2:1的氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在恒定搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1的氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层相，并向悬浮液中加入10mL 100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱[SAVI LABORATORI&SERVICES.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图1显示了圆红冬孢酵母的关于随时间推移的生物质趋势(符号●)和相应的底物消耗(符号▲)的发酵曲线，其中不平衡期在图中用虚线显示，带符号▲的线代表甘油浓度的趋势，带符号●的线代表生物量的趋势。

B)通过发酵过程在含油酵母斯达氏油脂酵母DSM70295中生产具有增塑作用的微生物油(OIL 2)。

将含油酵母菌株斯达氏油脂酵母DSM70295的细胞预接种至具有以下组成的培养基中：存在甘油(15g/L)作为能源和碳源，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，100倍浓缩的矿物质原液(其每升溶液含4gCaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升H₂SO₄ 18M)。该浓度允许获得10:1的C:N摩尔比，这被定义为经平衡以支持酵母的生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的1L烧瓶中的200mL培养基中进行预接种。将细胞接种在2L生物反应器中，初始DO₆₆₀为3。与预培养所用相同的培养基的操作体积相当于在约60g/L甘油存在下的1000mL。

在适于指数生长期发展的发酵时间后，不平衡期开始，其中将粗甘油加入培养基中以达到60g/L的终浓度。因此，C:N摩尔比转换至约40:1的值，导致朝向以细胞分裂为代价、在所谓的脂质体中积累微生物油的代谢变化，由于氮源的缺乏，细胞分裂不能进行。

发酵参数要求生物反应器保持25℃的恒温；在1vvm(每体积培养基的空气体积)的空气流量下，溶解氧的量大于25％；pH保持在5.5，如果需要，加入4M NaOH和25％(v/v)的H₃PO₄；搅拌取决于培养基中溶解氧的百分比。

接种后约160小时，通过离心回收细胞并进行酸裂解(HCl 2M),以破碎细胞本身，并用2:1的氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在恒定搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层氯仿相，并向悬浮液中加入10mL 100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱[SAVI LABORATORI&SERVICES.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图2显示了斯达氏油脂酵母的生物质趋势随时间推移(符号●)和相应的底物消耗(符号▲)的发酵曲线，其中不平衡期在图中用虚线显示，带符号▲的线代表甘油浓度的趋势，带符号●的线代表生物量的趋势。

实施例2

本实施例描述了制备表达盒的方法，所述表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-9去饱和酶活性的推定序列以及对nurseotricin NsrR的抗性盒。

A)重组表达载体pLS01的构建，该重组表达载体具有编码能够对抗生素 nurseotricin产生抗性的nurseotricin N-乙酰转移酶(NrsR)的序列。

使用斯达氏油脂酵母DSM70295的基因组DNA(作为模板)和特异性寡核苷酸(SEQID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6)，通过PCR扩增斯达氏油脂酵母的pURA3启动子和tGAL1终止子的序列。使用质粒pZ₅(作为模板)和特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8)，通过PCR扩增编码对nurseotricin的抗性的NAT基因。用于两种扩增的程序如下：在98℃变性30秒后，35个循环(在98℃变性10秒，在64℃配对30秒，在72℃延伸30秒)，然后在72℃最终延伸2分钟。将PCR产物加载到0.8％琼脂糖凝胶上，通过切取回收目标片段，并用NucleoSpin凝胶和PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)进行纯化。通过使用Gibson assembly cloning试剂盒(New England Biolab，NEB)进行克隆，将由质粒pZ₅扩增的NrsR基因和由斯达氏油脂酵母的基因组DNA扩增的pURA3和tGAL1插入到pStblue-1载体中，并通过转化大肠杆菌(Escherichia coli)扩增产物。一旦从大肠杆菌中提取质粒，就通过在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳运行来显现所述质粒，通过用限制性内切酶HheI和SphI进行的分析消化测试证实了pURA3、NAT、tGAL1片段在pSTBlue质粒中的正确插入。使用NucleoSpin Gel and PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)在柱上纯化命名为pLS01-NrsR的载体，并使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10)对其进行测序。

图3显示了重组载体pLS01-NrsR。

B)携带多克隆位点(MCS)的重组载体pLS02的构建。

用限制性内切酶EcoRV对pLS01载体进行制备型消化以进行线性化。通过从琼脂糖凝胶上取出来回收载体，然后用NucleoSpin Gel and PCR clean-up进行纯化，并用Nanodrop[Euroclone(Spa)]进行定量。在线性化的pLS01质粒中插入斯达氏油脂酵母TDH3的内源基因的组成型强启动子和斯达氏油脂酵母PGK1的内源基因的终止子：使用斯达氏油脂酵母DSM70295的基因组DNA(作为模板)和特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14)，通过PCR扩增这些序列，所述序列散布有五种不同限制酶(BglII、SpeI、EcoRV、BlpI、FseI)的特异性位点，以便在启动子与终止子之间产生MCS。使用Gibson assembly cloning试剂盒(New England Biolab,NEB)再次进行该操作。一旦从大肠杆菌中提取pLS02质粒，就通过0.8％琼脂糖分析凝胶验证其。通过用PstI和PmlI进行的分析消化，证实了pTDH3、tPGK1片段在pLS01-NrsR质粒内的正确插入。使用NucleoSpinGel and PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)在柱上纯化载体pLS02，并使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:15)对其进行测序。

图4显示了载体pLS02。

C)携带编码Δ-9去饱和酶活性的推定基因的重组载体pLS02-OLE1的构建。

编码Δ-9去饱和酶的序列是通过使用BlastP程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Protein)，将酿酒酵母的酵母蛋白的序列与斯达氏油脂酵母的全基因组中存在的编码序列的推定氨基酸序列(www.genome.jgi.doe.gov/Lipst1_1/Lipst1_ 1.home.html)进行比对而获得的。

使用斯达氏油脂酵母DSM70295的基因组DNA(作为模板)和特别设计的寡核苷酸(SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17)，通过PCR扩增编码酶Δ-9去饱和酶的序列。用于扩增的程序如下：在98℃变性30秒后，30个循环(在98℃变性10秒，在72℃配对30秒，在72℃延伸60秒)，然后在72℃最终延伸2分钟。用限制性内切酶SpeI消化PCR产物和靶载体pLS02-MCS，它们的连接导致重组表达载体pLS02-OLE1的获得。将载体pLS02-OLE1从琼脂糖凝胶中取出，并使用NucleoSpin Gel and PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)在柱上纯化，定量和使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:14)对其进行测序。

图5显示了载体pLS02-OLE1。

D)分离编码Δ-9去饱和酶活性和对nurseotricin的抗性的推定基因的表达盒。

用EcoRI-HF限制性内切酶消化pLS02载体。通过从0.8％琼脂糖凝胶中取出来回收对应于表达盒的片段(4556bp)，并用NucleoSpin Gel and PCR clean-up进行纯化。

图6显示了编码Δ-9去饱和酶活性(OLE1)的序列的表达盒。

实施例3

本实施例描述了制备表达盒的程序，所述表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-12去饱和酶活性的序列，以及潮霉素抗性盒HygR。

A)重组载体pLS03的构建，该重组载体携带编码能够产生对抗生素潮霉素的抗性的潮霉素-B 4-O-激酶的序列(HygR)。

使用质粒pZ₄(作为模板)和特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19)，通过PCR扩增编码对潮霉素B的抗性(4-O-激酶)的HygR基因。用于扩增的程序如下：在98℃变性30秒后，35个循环(在98℃变性10秒，在68℃配对30秒，在72℃延伸30秒)，然后在72℃最终延伸2分钟。将PCR产物加载到0.8％琼脂糖凝胶上，通过切取回收目标片段，并用NucleoSpin Gel and PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)进行纯化。通过使用Gibson assembly cloning试剂盒(New England Biolab,NEB)进行克隆，将由质粒pZ₄扩增的hph基因插入到pStblue-1载体中。一旦进行了从大肠杆菌中提取质粒，通过在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳运行来显现质粒，通过用限制性内切酶HheI和Hincll进行的分析消化测试证实了hph片段在pSTBlue质粒中的正确插入。使用上述试剂盒在柱上纯化命名为pLS03-HygR的载体，并使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID No:18)对其进行测序。

图7显示了重组载体pLS03。

B)携带多克隆位点(MCS)的重组载体pLS04的构建。

用限制性内切酶NheI消化目标载体pLS02，以获得线性化的pLS02载体，并移除nurseotricin抗性基因(NrsR)。类似地，使用相同的限制性内切酶NheI，消化pLS03载体以获得HygR基因，该基因赋予对潮霉素-B抗生素的抗性。

通过从琼脂糖凝胶上取出来回收HygR基因和pLS02载体，然后用NucleoSpin Geland PCR clean-up进行纯化，并用Nanodrop[Euroclone(Spa)]进行定量。然后进行连接，这导致获得对抗生素潮霉素B具有抗性的重组表达载体pLS04。通过用SacII进行的分析消化验证了HygR片段在pLS02质粒内的正确插入。

图8显示了重组载体pLS04。

C)携带编码Δ-12去饱和酶活性的基因的重组载体pLS04-FAD2的构建。

编码Δ-12去饱和酶的序列是从Matsuzawa,Tomohiko等人“Identification andcharacterization ofΔ12andΔ12/Δ15bifunctional fatty acid desaturases in theoleaginous yeast Lipomyces starkeyi.”Applied microbiology and biotechnology102.20(2018):8817-8826中描述的鉴定和表征工作中获得的.

使用斯达氏油脂酵母DSM70295的基因组DNA(作为模板)和特异性寡核苷酸(SEQID NO:20；SEQ ID NO:21)，通过PCR扩增编码Δ-12去饱和酶的序列。用于扩增的程序如下：在98℃变性30秒后，10个循环(在98℃变性10秒，在59℃配对30秒，在72℃延伸40秒)，25个循环(在98℃变性10秒，在64℃配对30秒，在72℃延伸40秒)，然后在72℃最终延伸2分钟。用限制性内切酶EcoRV-HF消化靶载体pLS04-MCS，并将其与PCR产物连接，从而获得重组表达载体pLS04-FAD2。使用NucleoSpin Gel and PCR clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)在柱上纯化载体pLS04-FAD2，并使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:14)对其进行测序。

图9显示了载体pLS04-FAD2。

D)分离编码去饱和酶Δ-12活性和对潮霉素B的抗性的基因的表达盒

用限制性内切酶XhoI消化pLS04-FAD2载体。通过从0.8％琼脂糖凝胶中取出来回收对应于表达盒的片段(4765bp)，并用NucleoSpin Gel and PCR clean-up进行纯化。

图10显示了编码Δ-12去饱和酶活性的序列(FAD2)的表达盒。

实施例4

用于改变脂质分布和用于获得微生物油(OIL 3)的来自斯达氏油脂酵母 (DSM70295)的重组菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的构建。

用两个表达盒转化斯达氏油脂酵母DSM70295的实验室菌株，在所述两个表达盒中，(i)一个表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-9去饱和酶活性的推定序列，以及实施例2中所述的针对nurseotricin的抗性盒NsrR，(ii)一个表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-12去饱和酶活性的序列，以及实施例3中所述的潮霉素抗性盒HygR。使用寡核苷酸(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23)，通过PCR验证了两种表达盒的整合(Calvey等人，“An optimized transformation protocolfor Lipomyces starkeyi.”Current genetics 60.3(2014):223-230)(图11)。

实施例5

通过相对定量实时PCR评估插入到斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2基因组中的基因拷贝数。

通过相对定量实时PCR来评估插入到斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2基因组中的基因拷贝数。从由亲代菌株和工程化菌株中提取的基因组DNA开始，定量每个细胞中OLE1和FAD2的拷贝数。使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27)和肌动蛋白作为内部对照(SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29)进行实时PCR(图12)。

实施例6

通过相对定量实时PCR评估在斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2中过表达的编码Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的序列的表达水平。

通过相对定量实时PCR评估编码Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的推定序列的表达水平。

从通过总RNA的逆转录获得的cDNA中定量重组菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2和野生菌株中Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的信使(图13)。

将细胞预接种在5ml培养基中持续24小时，该培养基每升含有：25％的葡萄糖、25％的木糖、1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，100倍浓缩的富含矿物质的原液(每升溶液含有4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升H₂SO₄ 18M)。使用ZR Fungal/Bacterial RNA Miniprep试剂盒(Zymoresearch/The epigenitics公司)对处于指数期的细胞样品进行RNA提取。然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳控制提取。使用iScript cDNA合成(BIORAD)试剂盒获得cDNA。使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:27)和肌动蛋白作为内部对照(SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29)进行实时PCR。

实施例7

为改变从野生菌株获得的微生物油的脂质分布而工程改造的含油酵母斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的烧瓶生产动力学。

将经工程改造用于生产改性脂质油(OIL 3)的含油酵母菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的细胞预接种到具有以下组成的培养基中：存在甘油(15g/L)作为能源和碳源，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，100倍浓缩的富含矿物质的原液(其中每升溶液含4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升的H₂SO₄ 18M)。该浓度允许获得10:1的C:N比，这被定义为经平衡以支持酵母生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的500L烧瓶中的100mL培养基中进行预接种。生长72小时后，将细胞以3的光密度(OD660nm)接种在250mL烧瓶中的50mL培养基中，所述培养基与用于在约100g/L甘油存在的情况下进行的预接种的培养基相同，所述烧瓶被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上。通过定期测量660nm处的OD来监测细胞生长。使用H₂SO₄ 0.01M(作为流动相)和Rezex ROA-Organic(Phenomenex)柱，通过HPLC测定甘油的细胞外浓度。

接种240小时后，通过离心回收细胞并进行酸裂解(HCl 2M),以破碎细胞本身，并用2:1的氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。

根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在恒定搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1的氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层相，并向悬浮液中加入10mL 100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱[SAVI LABORATORI&SERVICE S.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图14显示了斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2关于随时间推移的生物量趋势和相应的底物消耗的斯达基乳酸杆菌-OLE1-FAD2菌株的发酵曲线。下表2显示了与OIL 1和2以及一些植物油，特别是蓖麻油(OIL 4)、向日葵油AP-75(Cargill)(OIL 5)、向日葵油

(Cargill)(OIL 6)的组成相比，与OIL 3相关的脂肪酸组成：

表2

下表3概括了表2的油和作为功能参照的矿物油MES(TUDALEN 4226,H&R Group)(OIL 7)的表征，所述表征使用差示扫描量热法(DSC)进行，从-140℃的温度开始至+60℃，以确定熔化温度和玻璃化转变温度。使用ISO 3961法测定碘值，该方法包括用过量的Wijs溶液处理油。Wijs溶液含有溶解在乙酸中的一氯化碘。一氯化碘与油的不饱和部分反应，未反应的碘通过加入碘化钾以碘的形式释放出来。释放的碘通过用硫代硫酸钠滴定来测定。

表3

实施例8

通过在体积为10升的生物反应器中的发酵过程，在含油酵母斯达氏油脂酵母- OLE1-FAD2中生产具有增塑作用的微生物油(OIL 3)。

将经工程改造用于生产改性脂质油(OIL 3)的含油酵母菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的细胞预接种到具有以下组成的培养基中：存在甘油(15g/L)作为能源和碳源，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，富含矿物质的原液，100倍浓缩，每升溶液含有4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升H₂SO₄ 18M)。该浓度允许获得10:1的C:N比，这被定义为经平衡以支持酵母生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的1000L烧瓶中的200mL培养基中进行预接种。生长约48小时后，将细胞接种在10L生物反应器中，初始DO₆₆₀为0.2。与预培养所用相同的培养基的操作体积相当于5000mL，存在约25g/L甘油。生物反应器中使用的培养基的操作体积为5000mL。

在适于指数生长期的发展的发酵时间后，不平衡期开始，其中向培养基中加入粗甘油以达到约80g/L的终浓度。因此，C:N摩尔比转换至约50:1的值，导致朝向在所谓的脂质体中积累微生物油的代谢变化，以细胞分裂为代价，其由于氮源的缺乏而不能进行。

接种150小时后，通过离心回收细胞并进行酸裂解(HCl 2M),以破碎细胞本身，并用2:1的氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在恒定搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层氯仿相，并向悬浮液中加入10mL 100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱[SAVI LABORATORI&SERVICES.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图15显示了斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的关于生物量随时间推移的趋势和相应的底物消耗的发酵概况。

实施例9

用被工程改造以相对于野生型菌株而言对获得的油的脂质分布进行改变的含油酵母斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2在烧瓶中生产油的动力学。

将经工程改造用于生产改性脂质油(OIL 3)的含油酵母菌株斯达氏油脂酵母-OLE1-FAD2的细胞预接种到具有以下组成的培养基中：在存在甘油(15g/L)作为能源和碳源的情况下，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，富含矿物质的原液，100倍浓缩，其每升溶液含有4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升的H₂SO₄ 18M。该浓度允许获得10:1的C:N比，这被定义为经平衡以支持酵母生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的500L烧瓶中的100mL培养基中进行预接种。生长72小时后，将细胞以3的光密度(OD 660nm)接种在250mL烧瓶中的50mL培养基中，所述培养基与用于预接种的培养基相同，并且存在约100g/L甘油，所述烧瓶被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上。通过定期测量660nm处的OD来监测细胞生长。使用H₂SO4 0.01M(作为流动相)和Rezex ROA-Organic(Phenomenex)柱，通过HPLC测定甘油的细胞外浓度。接种240小时后，通过离心回收细胞并进行酸裂解(HCl 2M)，以破碎细胞本身，并用2:1的氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在持续搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层相，并向悬浮液中加入10mL100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱法[SAVI LABORATORI&SERVICE S.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图16显示了与OIL 2的组成相比，与OIL 3相关的脂肪酸组成。

实施例10

由斯达氏油脂酵母(DSM70295)构建重组菌株斯达氏油脂酵母-OLE1，用于改变脂质分布和用于获得微生物油(OIL 8)。

如实施例2中所述，使用表达盒和nurseotricin NsrR抗性盒转化斯达氏油脂酵母DSM70295的实验室菌株，所述表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-9去饱和酶活性的推定序列。

实施例11

由斯达氏油脂酵母(DSM70295)构建重组菌株斯达氏油脂酵母-FAD2，用于改变脂质分布和用于获得微生物油(OIL 9)。

如实施例3中所述，使用表达盒以及潮霉素HygR抗性盒转化斯达氏油脂酵母DSM70295的实验室菌株，所述表达盒含有在pTDH3启动子和tPGK1终止子控制下的编码Δ-12去饱和酶活性的序列。

实施例12

通过相对定量实时PCR评估插入到斯达氏油脂酵母-OLE1和斯达氏油脂酵母-FAD2 基因组中的基因拷贝数。

如实施例5中所述，通过相对定量实时PCR来评估插入到斯达氏油脂酵母-OLE1和斯达氏油脂酵母-FAD2基因组中的基因拷贝数。从由亲代菌株和工程化的菌株中提取的基因组DNA开始，定量每细胞的OLE1和FAD2拷贝数。使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:24；SEQID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27)和肌动蛋白用作内部对照(SEQ ID NO:28；SEQ IDNO:29)进行实时PCR(图17)。

实施例13

通过相对定量实时PCR评估在斯达氏油脂酵母-OLE1和斯达氏油脂酵母-FAD2菌株中过表达的编码Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的序列的表达水平。

如实施例5所述，通过相对定量实时PCR评估编码酶Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的推定序列的表达水平。

从对总RNA的逆转录获得的cDNA定量重组菌株斯达氏油脂酵母-OLE1、斯达氏油脂酵母-FAD2和野生型菌株中Δ-9去饱和酶和Δ-12去饱和酶的信使(图18)。

将细胞预接种在5ml培养基中持续24小时，该培养基每升含有：25％的葡萄糖、25％的木糖、1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95 Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，富含矿物质的原液，其每升溶液含4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10gZnSO₄*7H2O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升H₂SO₄ 18M。使用ZR Fungal/Bacterial RNAMiniprep试剂盒(Zymoresearch/The epigenitics公司)对处于指数期的细胞样品进行RNA提取。然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳控制提取。使用iScript cDNA合成(BIORAD)试剂盒获得cDNA。使用特异性寡核苷酸(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27)和肌动蛋白用作内部对照(SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29)进行实时PCR。

实施例14

含油酵母斯达氏油脂酵母-OLE1和斯达氏油脂酵母-FAD2在烧瓶中的油生产动力学，所述酵母经工程改造而相对于野生菌株改变了油的脂质分布。

将经工程改造用于生产具有改变的脂质分布的油(OIL 8和OIL 9)的含油酵母菌株斯达氏油脂酵母-OLE1和斯达氏油脂酵母-FAD2的细胞预接种在具有以下组成的培养基中：存在甘油(15g/L)作为能源和碳源，每升含有1g酵母提取物、1.31g(NH₄)₂SO₄、0.95Na₂HPO₄、2.7g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄*7H₂O，富含矿物质的原液，其浓缩100倍，每升溶液含4g CaCl₂*2H₂O、0.55g FeSO₄*7H₂O、0.52g柠檬酸、0.10g ZnSO₄*7H₂O、0.076g MnSO₄*H₂O、100微升的H₂SO₄ 18M。该浓度允许获得10:1的C:N比，这被定义为经平衡以支持酵母生长和分裂。在被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上的500L烧瓶中的100mL培养基中进行预接种。生长72小时后，将细胞以3的光密度(OD 660nm)接种在250mL烧瓶中的50mL培养基中，所述培养基与用于预接种的培养基相同，存在约100g/L甘油，所述烧瓶被置于25℃、220rpm的轨道式震荡器上。通过定期测量660nm处的OD来监测细胞生长。使用H₂SO4 0.01M(作为流动相)和Rezex ROA-Organic(Phenomenex)柱，通过HPLC测定甘油的细胞外浓度。接种240小时后，通过离心回收细胞并进行酸裂解(HCl 2M)，以破碎细胞本身，并用2:1氯仿:甲醇溶液和100％氯仿处理以分离脂质。根据以下方案进行油的化学提取：将细胞溶解在2M的盐酸溶液中；在恒定搅拌下，将该制剂在95℃的恒温浴中加热60分钟。向悬浮液中加入等体积(1:1v/v)的2:1氯仿:甲醇溶液，然后以10000rpm离心10分钟，直至获得相分离；回收下层相，并向悬浮液中加入10mL 100％氯仿，以回收剩余的脂质。将从化学提取获得的微生物油进行酯交换反应，随后用气相色谱法[SAVI LABORATORI&SERVICE S.r.l.,Roncoferraro(MN),Italy]进行分析。

图19和图20显示了与OIL 3的组成相比，与OIL 8和OIL 9相关的脂肪酸组成。

寡核苷酸序列列表

SEQ ID NO:1 OLE1

ATGACTGCCAGTGCTGAGACAACGTCCGCGCAGCCTGTCGTCGAGTCGGCTCGCGCAAGGCCACCCAGATCAAGCTCAACGTCGCCTTCTCGTTCGGTTGGTAGTGCTGCGTCGACTGCGAAGCAAGCGTCTCCTACATTCGTCCACATCTCCGAGCAACCGTTCACTCTCCAGAACTGGTACAAGCACATCAGCTGGCTCAATGTCACGCTGATCATCTTCATCCCTGTCATTGGCTGCACTACCGCGGTTTTCACTCCTCTGCAATCTAAGACTGCCATCCTTGCCTTTGTCTACTACGCCCTGACGGGCCTCGGTATCACTGCGGGTTATCACCGCCTCTGGTCGCACCGTGCTTACAGTGCCCGTCTTCCTCTCCGTATTCTACTCGCTGCTTTCGGCGGCGGTGCTGTTGAGGGTTCCATTCGCTGGTGGTCCGCTGGTCACCGTGTCCATCACAGATTCACCGATACTGAGAAGGACCCTTACTCTGTCCGCAAGGGTCTGCTCTATTCTCACATGGGCTGGATGGTGTTTCTCCACAACCCCAAGAAGTCCGGCCGGGTCGATATCACCGACTTGAACGCTGACCCTGTCGTCAGATGGCAGCACAAGAACTACATTCTCGTCCTTCTCTTTATGGGTTTCATCTTCCCCATGGTAGTTGCCGGCCTCGGATGGGGTGACTGGAAGGGTGGTCTCATCTGGGCTGGCATTGTCCGTTTGACAGTTGTCCACCATGCCACTTTTTGTGTCAACTCGCTCGCTCACTGGCTCGGTGACCAGCCTTTCGACGACCGCCGCTCTCCGCGTGACCACTTCTTGACTGCCATCGTTACGTTCGGCGAGGGCTATCACAACTTCCACCATGAGTTCCCCTCTGACTACCGTAACGCCATAAGATGGTATCAGTATGATCCCACTAAGTGGCTCATCTGGTTCCTCAAGAAGATCGGCTTTGCTTATGACCTTAAGACCTTCTCTCACAATGCCATCCAGCAAGGCCTCGTCCAGCAGAGGCAGAAAAAGCTCGACAAGTGGCGCGCACGTCTTAACTGGGGTGTTCCTCTCGAGCAGCTCCCGGTCATGGAATTTGAAGAGTACCAGGAGCAGGCCAAGACGCGTGCGCTCGTCCTCATTGCTGGTGTTGTCCACGATGTCACCAACTTTATTGAGCAGCATCCTGGTGGAAAGGCTCTGATCCAGTCAGGTATTGGCAAGGATGCCACCGCTGTCTTCAATGGCGGTGTCTACGACCACTCCAATGCTGCCCACAACCTGCTCGGTACCATGCGTGTTGGTGTCATTCGCGGCGGCATGGAAGTCGAGGTCTGGAAGATGGCTCAGCGAGAGAATAAGGAGTCAACGATCAAGTCCGATTCGAATAATGCCAATATCGTCCGTGCAGGTTCTCAGGCAACCCGGATACAAGCTCCCATCCAGGGCGCTGGTGCCGCTTAG

SEQ ID NO:2 FAD2

ATGTCCACAATAACATACACACAGCGCAGGCCGTCAGTGTCGCTGACTTCGAAGCCCGTCTACAAGGATGCCTTCGGCCACGACTTCGAACCGCCGGAGTACACAATCAAAGATATCCTTGATGCCATCCCCAAGCACTGCTTCGACCGCTCTCTTAGCCACTCTCTCGCCTATGTCGCCCGCGACCTCTTCTACGCCTCCTGCTTGTTCGGCCTAGCGACACAGATCCATAGCATCCCCTATCTACCTGCCCGCGTCGTCGCCTGGGTTCTCTACGGCTTTTGCCAAGGCCTTGTCGGCACAGGCTTGTGGGTCCTCGCCCACGAGTGCGGCCATGGAGCCTTCTCCCCCTACAAGCTCGCCAACGACGTCGTCGGGTGGCTCCTCCACTCCGCCCTCTTTGTGCCGTACCACTCATGGCGGATCACTCACTCCAAGCACCACAAAGCCACCGGCCACCTCACCCGCGATATGGTCTTCGTCCCGCGCGACGTGACCCGTTACAAGCTCTCCCGAAACCTGACTGAGCTCACCGAGGAGGCGCCGATCGCGACCCTCTATTTCCTATTTATCCAGCAGGTCTTTGGTTGGCCCGCGTACCTCGCCTACAATGTCACCGGCCAGAAATACCCTGGTGTGTCCAGCTTCAGACGGTCACATTTTGCGCCGTCCGCGCCCATGTTCGATGTAAAGGACTTCTGGGATATTATAATCTCCGATGTCGGTATACTTGTCGCCGGCACTCTTACCTATCTCGGCATCCAGAAATGGGGTTGGGCTAACTTCGCTCTCTACTACTTTATCCCTTATCTCTGGGTCAACAACTGGTTGGTTTGCATCACGTATCTACAGCACACTGACCCAACTCTACCCCATTACGACGCGAGCGAGTGGAACTTTGCCCGCGGCGCCGCGGCAACAGTAGATCGCGACTTTGGCTTCATCGGCCGCCACCTCTTCCACGAGATCATCGAGACGCATGTCGCGCACCACTACTCGTCGCGAATTCCATTCTACCACGCCGAGGAGGCCACGCAAGCCATCCGCAAGGTCATGGGCAAGCATTACCGTCAGGACAAGACAAACCTCATTCTCGCACTCTGGAAGACCGCGCGGACATGCCATTTTGTGGAGGGCGACGGCGTCAAGATGTACAGAAATGCCAACGGAATCGGTATTCCGCCAAAGGAGGGAAGAAGGGCTCAGTAA

SEQ ID NO:3；pURA3 fw

TCG ATC CAG AAT TCG TGA TTC TAG ACT CGA GAT ATC ATG ATC ACT GAG CGATAG TTC

SEQ ID NO:4；pURA3 rev

TCG TCA AGA GTG GTA CCC ATG TTG AAT TTA GGG ATA TAC TGT AGA AGA C

SEQ ID NO:5；tGAL1 fw

TGA GCA TGC CCT GCC CCT AAA GTT TAG AGA TGT ACA AGG GGT

SEQ ID NO:6；tGAL1 rev

GCT TGT CGA CGA ATT CAG ATT GCC ACG ATA ACT TTG TGC

SEQ ID NO:7；NsrR fw

ATG GGT ACC ACT CTT GAC GAC

SEQ ID NO:8；NsrR rev

TTA GGG GCA GGG CAT GCT CA

SEQ ID NO:9；T7

ATT TAG GTG ACA CTA TAG

SEQ ID NO:10；SP6

TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

SEQ ID NO:11；pTDH3 fw

CGT GAT TCT AGA CTC GAG ATT TAA TTT GCT GAA GCG GTT TGC

SEQ ID NO:12；pTDH3 rev

CGC TTA GCG ATA TCA CTA GTA GAT CTT GCG AAT GTG GAT TAG AGT AAG A

SEQ ID NO:13；p PGK1 fw

ACT AGT GAT ATC GCT AAG CGG CCG GCC CTC CCG TTA ATG TTG GGA TTC

SEQ ID NO:14；t PGK1 rev

TAT CGC TCA GTG ATC ATG ATC CTG TCA ATT ATG CTA CCA CTT G

SEQ ID NO:15；LsTDH3 fw

ATA ATA ATC CGA ACT GCC GC

SEQ ID NO:16；OLE1 fw

TCA GAT ACT AGT ATG ACT GCC AGT GCT GAG ACA ACG TCC

SEQ ID NO:17；OLE1 rev

AGA TAC ACT AGT CTA AGC GGC ACC AGC GCC CT

SEQ ID NO:18；HygR fw

ATG GGT AAAAAG CCT GAA CTC ACC

SEQ ID NO:19；HygR rev

TTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG

SEQ ID NO:20；FAD2 fw

CTA GTA AAC TAG TAT GTC CAC AAT AAC ATA CAC AC

SEQ ID NO:21；FAD2 rev

TAT TCT ACT AGT TTA CTG AGC CCT TCT TCC

SEQ ID NO:22；OLE1 CNT rev

CAA CTA CCA TGG GGA AGA TG

SEQ ID NO:23 FAD2 CNT rev

CAA GTA TAC CGA CAT CGG AGA TTA

SEQ ID NO:24 OLE1 RT fw

CCA CTT CTT GAC TGC CAT GC

SEQ ID NO:25 OLE1 RT rev

GAG GAA CCA GAT GAG CCA CT

SEQ ID NO:26 FAD2 RT fw

GAT CGC GAC TTT GGC TTC AT

SEQ ID NO:27 FAD2 RT rev

GAA TTC GCG ACG AGT AGT GG

SEQ ID NO:28 ACT fw

CAT TGC CGA CAG AAT GCA GA

SEQ ID NO:29 ACT rev

ACG GAG TAC TTA CGC TCA GG

序列表

<110> Pirelli Tyre S.p.A.

<120> 工程化改造含油微生物的方法

<130> PIR1P96WO

<160> 29

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)

<220>

<223> 编码Δ-9去饱和酶的基因

<400> 1

atgactgcca gtgctgagac aacgtccgcg cagcctgtcg tcgagtcggc tcgcgcaagg 60

ccacccagat caagctcaac gtcgccttct cgttcggttg gtagtgctgc gtcgactgcg 120

aagcaagcgt ctcctacatt cgtccacatc tccgagcaac cgttcactct ccagaactgg 180

tacaagcaca tcagctggct caatgtcacg ctgatcatct tcatccctgt cattggctgc 240

actaccgcgg ttttcactcc tctgcaatct aagactgcca tccttgcctt tgtctactac 300

gccctgacgg gcctcggtat cactgcgggt tatcaccgcc tctggtcgca ccgtgcttac 360

agtgcccgtc ttcctctccg tattctactc gctgctttcg gcggcggtgc tgttgagggt 420

tccattcgct ggtggtccgc tggtcaccgt gtccatcaca gattcaccga tactgagaag 480

gacccttact ctgtccgcaa gggtctgctc tattctcaca tgggctggat ggtgtttctc 540

cacaacccca agaagtccgg ccgggtcgat atcaccgact tgaacgctga ccctgtcgtc 600

agatggcagc acaagaacta cattctcgtc cttctcttta tgggtttcat cttccccatg 660

gtagttgccg gcctcggatg gggtgactgg aagggtggtc tcatctgggc tggcattgtc 720

cgtttgacag ttgtccacca tgccactttt tgtgtcaact cgctcgctca ctggctcggt 780

gaccagcctt tcgacgaccg ccgctctccg cgtgaccact tcttgactgc catcgttacg 840

ttcggcgagg gctatcacaa cttccaccat gagttcccct ctgactaccg taacgccata 900

agatggtatc agtatgatcc cactaagtgg ctcatctggt tcctcaagaa gatcggcttt 960

gcttatgacc ttaagacctt ctctcacaat gccatccagc aaggcctcgt ccagcagagg 1020

cagaaaaagc tcgacaagtg gcgcgcacgt cttaactggg gtgttcctct cgagcagctc 1080

ccggtcatgg aatttgaaga gtaccaggag caggccaaga cgcgtgcgct cgtcctcatt 1140

gctggtgttg tccacgatgt caccaacttt attgagcagc atcctggtgg aaaggctctg 1200

atccagtcag gtattggcaa ggatgccacc gctgtcttca atggcggtgt ctacgaccac 1260

tccaatgctg cccacaacct gctcggtacc atgcgtgttg gtgtcattcg cggcggcatg 1320

gaagtcgagg tctggaagat ggctcagcga gagaataagg agtcaacgat caagtccgat 1380

tcgaataatg ccaatatcgt ccgtgcaggt tctcaggcaa cccggataca agctcccatc 1440

cagggcgctg gtgccgctta g 1461

<210> 2

<211> 1209

<212> DNA

<213> 斯达氏油脂酵母

<220>

<223>编码Δ-12去饱和酶的基因

<400> 2

atgtccacaa taacatacac acagcgcagg ccgtcagtgt cgctgacttc gaagcccgtc 60

tacaaggatg ccttcggcca cgacttcgaa ccgccggagt acacaatcaa agatatcctt 120

gatgccatcc ccaagcactg cttcgaccgc tctcttagcc actctctcgc ctatgtcgcc 180

cgcgacctct tctacgcctc ctgcttgttc ggcctagcga cacagatcca tagcatcccc 240

tatctacctg cccgcgtcgt cgcctgggtt ctctacggct tttgccaagg ccttgtcggc 300

acaggcttgt gggtcctcgc ccacgagtgc ggccatggag ccttctcccc ctacaagctc 360

gccaacgacg tcgtcgggtg gctcctccac tccgccctct ttgtgccgta ccactcatgg 420

cggatcactc actccaagca ccacaaagcc accggccacc tcacccgcga tatggtcttc 480

gtcccgcgcg acgtgacccg ttacaagctc tcccgaaacc tgactgagct caccgaggag 540

gcgccgatcg cgaccctcta tttcctattt atccagcagg tctttggttg gcccgcgtac 600

ctcgcctaca atgtcaccgg ccagaaatac cctggtgtgt ccagcttcag acggtcacat 660

tttgcgccgt ccgcgcccat gttcgatgta aaggacttct gggatattat aatctccgat 720

gtcggtatac ttgtcgccgg cactcttacc tatctcggca tccagaaatg gggttgggct 780

aacttcgctc tctactactt tatcccttat ctctgggtca acaactggtt ggtttgcatc 840

acgtatctac agcacactga cccaactcta ccccattacg acgcgagcga gtggaacttt 900

gcccgcggcg ccgcggcaac agtagatcgc gactttggct tcatcggccg ccacctcttc 960

cacgagatca tcgagacgca tgtcgcgcac cactactcgt cgcgaattcc attctaccac 1020

gccgaggagg ccacgcaagc catccgcaag gtcatgggca agcattaccg tcaggacaag 1080

acaaacctca ttctcgcact ctggaagacc gcgcggacat gccattttgt ggagggcgac 1140

ggcgtcaaga tgtacagaaa tgccaacgga atcggtattc cgccaaagga gggaagaagg 1200

gctcagtaa 1209

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸URA3 fw

<400> 3

tcgatccaga attcgtgatt ctagactcga gatatcatga tcactgagcg atagttc 57

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸URA3 rev

<400> 4

tcgtcaagag tggtacccat gttgaattta gggatatact gtagaagac 49

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸tGAL1 fw

<400> 5

tgagcatgcc ctgcccctaa agtttagaga tgtacaaggg gt 42

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸tGAL1 rev

<400> 6

gcttgtcgac gaattcagat tgccacgata actttgtgc 39

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸NsrR fw

<400> 7

atgggtacca ctcttgacga c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸NsrR rev

<400> 8

ttaggggcag ggcatgctca 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 锚定引物T7

<400> 9

atttaggtga cactatag 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子测序引物SP6

<400> 10

taatacgact cactataggg 20

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子TDH3 fw

<400> 11

cgtgattcta gactcgagat ttaatttgct gaagcggttt gc 42

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子TDH3 rev

<400> 12

cgcttagcga tatcactagt agatcttgcg aatgtggatt agagtaaga 49

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子PGK1 fw

<400> 13

actagtgata tcgctaagcg gccggccctc ccgttaatgt tgggattc 48

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子PGK1 rev

<400> 14

tatcgctcag tgatcatgat cctgtcaatt atgctaccac ttg 43

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸LsTDH3 fw

<400> 15

ataataatcc gaactgccgc 20

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OLE1 fw

<400> 16

tcagatacta gtatgactgc cagtgctgag acaacgtcc 39

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OLE1 rev

<400> 17

agatacacta gtctaagcgg caccagcgcc ct 32

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸HygR fw

<400> 18

atgggtaaaa agcctgaact cacc 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸HygR rev

<400> 19

ttattccttt gccctcggac g 21

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸FA2 fw

<400> 20

ctagtaaact agtatgtcca caataacata cacac 35

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸FAD2 rev

<400> 21

tattctacta gtttactgag cccttcttcc 30

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OLE1 CNT rev

<400> 22

caactaccat ggggaagatg 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸FAD2 CNT rev

<400> 23

caagtatacc gacatcggag atta 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OLE1 RT fw

<400> 24

ccacttcttg actgccatgc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸OLE1 RT rev

<400> 25

gaggaaccag atgagccact 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸FAD2 RT fw

<400> 26

gatcgcgact ttggcttcat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸FAD2 RT rev

<400> 27

gaattcgcga cgagtagtgg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸ACT fw

<400> 28

cattgccgac agaatgcaga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸ACT rev

<400> 29

acggagtact tacgctcagg 20

Claims

1.一种工程改造含油微生物的方法，包括以下步骤：

(a)提供含油微生物；

(b)将编码Δ-9去饱和酶的基因插入所述含油微生物中；

(c)将编码Δ-12去饱和酶的基因插入所述含油微生物中；

d)选择所得的工程化微生物。

2.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中所述含油微生物是选自由下述属组成的组中的含油酵母：隐球菌属(Cryptococcus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、毛孢子菌属(Trichosporon)和耶氏酵母属(Yarrowia)。

3.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中所述含油微生物属于弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、发酵丝孢酵母(Trichosporon fermentans)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌株。

4.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中所述含油微生物是斯达氏油脂酵母。

5.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中所述含油微生物是选自由以下组成的组中的微藻：椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、杜氏藻属的某一种(Dunaliellasp.)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、富油新绿藻(Neochloris oleabundans)、新颖拟绿球藻属的某一种(Pseudochlorococcumsp.)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、扁藻属的某一种(Tetraselmis sp.)、四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)、钙质角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)CS 178、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟勒氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、微小菱形藻(Nitzschia cf.pusilla)YSR02、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)F&M-M40、骨条藻属的某一种(Skeletonema sp.)CS 252、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)CS173、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、等鞭金藻属的某一种(Isochrysis sp.)、等鞭金藻属的某一种(Isochrysis sp.)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)、眼点微拟绿球藻(Nannochloropsis oculate)、眼点微拟绿球藻(Nannochloropsis oculata)NCTU-3、微拟绿球藻属的某一种(Nannochloropsissp.)、盐生巴夫藻(Pavlova salina)CS49、红胞藻属的某一种(Rhodomonas sp.)和威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)。

6.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中所述含油微生物选自由以下组成的组：真菌和原生生物，优选土曲霉(Aspergullus terreus)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、亚团黑粉菌属(Tolyposporium)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、深黄被孢霉(Mortierella isabelline)和裂殖壶菌(Schizochitriumlimacynum)。

7.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中在酵母中过表达的编码Δ-9去饱和酶的所述基因是斯达氏油脂酵母的OLE1，具有序列(SEQ ID N:1)。

8.根据权利要求1所述的工程改造含油微生物的方法，其中在酵母中过表达的编码Δ-12去饱和酶的所述基因是斯达氏油脂酵母的FAD2，具有序列(SEQ ID N:2)。

9.一种工程化的含油微生物，其通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得，其中所述工程化的含油微生物包含朝向与野生型含油微生物相比具有经修饰的脂质分布谱的油合成的碳流。

10.一种生产增塑油的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在包含生物质的培养基中培养通过根据权利要求1至8中任一项的方法获得的工程化含油微生物，其中所述生物质含有5与20之间的碳氮摩尔比；

(b)通过将碳氮摩尔比改变为等于或大于30、优选30至100的值而导致不平衡；

(c)从所述培养基中分离工程化的含油微生物；以及

(d)从所述含油微生物中提取油。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物质包含至少一种选自下组的有机碳源：粗甘油、糖蜜、木质纤维素、甜菜浆、乳清、淀粉残渣、废水、废油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖、乙酸酯和/或其组合。