CN104321424A

CN104321424A - 在转基因耶氏酵母属中表达胞浆苹果酸酶以提高脂质产量

Info

Publication number: CN104321424A
Application number: CN201380017157.9A
Authority: CN
Inventors: D.J.马库尔; Q.Q.朱; Z.薛
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2012-04-03
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-01-28
Also published as: JP2015512643A; AU2013243836A1; WO2013151738A1; EP2834346A1; CA2868424A1; US8916365B2; US20130260427A1

Abstract

本文公开了转基因耶氏酵母属(Yarrowia)菌种，其包含编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸、所述耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35重量％的脂质含量、和经工程化的多不饱和脂肪酸(PUFA)生物合成途径，其中所述胞浆苹果酸酶的过表达提高脂质含量。

Description

在转基因耶氏酵母属中表达胞浆苹果酸酶以提高脂质产量

本申请要求2012年4月3日提交的美国临时申请61/619,574的权益，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及过表达胞浆苹果酸酶以提高脂质含量的转基因耶氏酵母属(Yarrowia)菌种。

背景技术

研究已经涉及了解脂质和脂肪酸(FA)生物合成途径，并且已经使用基因工程将这些生物合成途径导入宿主生物。例如包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主正被研究旨在用于商业化多不饱和脂肪酸(PUFA)生产。基因工程已表明，一些宿主(即使那些天然限于亚麻酸(LA，18：2ω-6)或α-亚麻酸(ALA，18：3ω-3脂肪酸生产的宿主)可进行实质上的改造以产生对多种长链ω-3/ω-6 PUFA的高水平生产。

尽管文献报道了负责EPA的生产的ω-3/ω-6 PUFA生物合成途径的多个部分在其中被引入植物和非含油酵母的许多最近的例子，主要努力已经集中在含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(美国专利7,238,482；美国专利7,932,077；美国专利申请公布2009-0093543-A1；美国专利申请公布2010-0317072-A1)。含油酵母被定义为天然地能够合成和积聚油的那些酵母(其中油的积聚为细胞干重的至少25％)，或经过遗传工程改造，使得它们变得能够合成和积聚油的那些酵母(其中油的积聚为细胞干重的至少25％)。

对提高真菌中的脂质积聚仍保持相当大的兴趣。苹果酸酶在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞浆中的表达已经显示提高NADPH产量(2004，dos Santos等人，Metabol.Engineering 6：352-363)。假定NADPH的作用是作为脂肪酸合成中的还原剂，苹果酸酶已经据研究是用于改变脂质产量的可能因素。Zhang等人(2007，Microbiology 153：2013-2025)已经发现在野生型卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中过表达苹果酸酶导致脂质积聚增加2.5倍。与这个发现一致，研究已经表明在卷枝毛霉(M.circinelloides)和高山被孢霉(Mortierella alpina)中表达苹果酸酶与脂质积聚相关联(1999，Wynn等人，Microbiology 145：1911-1917；2002，Ratledge，Biochem.Soc.Trans.30：1047-1050)。另外，缺乏苹果酸酶活性的突变型构巢曲霉(Aspergillus nidulans)分离物显示积聚的脂质为具有苹果酸酶的构巢曲霉(A.nidulans)菌株产生脂质的一半(1997，Wynn等人，Microbiology 143：253-257)。

然而，对野生型解脂耶氏酵母的研究表明苹果酸酶可能在脂质生产中不起到大的作用。Beopoulos等人(2011，Appl.Microbiol.Biotechnol.，90：1193-1206)简要报道了过表达线粒体形式的苹果酸酶不影响解脂耶氏酵母中的脂质积聚。

尽管存在前述公开，令人惊讶地是，已发现包含经工程化的多不饱和脂肪酸生物合成途径并具有耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35重量％脂质含量的转基因耶氏酵母属菌种的脂质含量可通过过表达胞浆苹果酸酶得到提高。

发明内容

在一个实施例中，本发明涉及一种转基因耶氏酵母属菌种，其包含(i)编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸，(ii)耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35重量％的脂质含量，和(iii)经工程化的多不饱和脂肪酸(PUFA)生物合成途径，其中胞浆苹果酸酶的过表达提高脂质含量。

在第二实施例中，由多核苷酸编码的胞浆苹果酸酶包含功能障碍的线粒体靶向序列。在第三实施例中，胞浆苹果酸酶缺乏线粒体靶向序列。

在第四实施例中，由多核苷酸编码的胞浆苹果酸酶包含与SEQ IDNO：5具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞浆苹果酸酶具有苹果酸酶活性。

在第五实施例中，转基因耶氏酵母属菌种具有耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约50重量％的脂质含量。

在第六实施例中，转基因耶氏酵母属菌种包含的经工程化的PUFA生物合成途径产生至少一种PUFA，诸如亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。优选地，经工程化的PUFA生物合成途径产生二十碳五烯酸。

在第七实施例中，转基因耶氏酵母属菌种是解脂耶氏酵母。

在第八实施例中，本发明涉及用于提高转基因耶氏酵母属菌种的脂质含量的方法，所述方法包括：

a)培养本发明的转基因耶氏酵母属菌种，其中产生包含至少一种PUFA的微生物油，以及

b)任选地，回收步骤(a)的微生物油。

关于该方法，胞浆苹果酸酶可包含功能障碍的线粒体靶向序列或者胞浆苹果酸酶并不包含线粒体靶向序列。此外，所述胞浆苹果酸酶可包含与SEQ ID NO：5具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞浆苹果酸酶具有苹果酸酶活性。

在该方法的另一方面，耶氏酵母属菌种的脂质含量为耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约50重量％。

在该方法的又一方面，经工程化的PUFA生物合成途径产生至少一种选自下列的PUFA：亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。优选地，所产生的至少一种PUFA是二十碳五烯酸。

附图和序列简述

图1：示出由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(ScME)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(SpME)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(YlME)表达的ME氨基酸序列的比对。在示出的YlME序列中用下划线标示的氨基酸表示预测的线粒体靶向序列(MTS)。

图2：示出用于解脂耶氏酵母ME异位表达的质粒。构建体pME(A)包含用于过表达全长(天然的)解脂耶氏酵母ME(YlME)的盒(FBAIN：：YlME：：PEX20)，而构建体pMET2(B)包含用于过表达截短(胞浆)解脂耶氏酵母ME(YlME-T2)的盒(FBAIN：：YlME-T2：：PEX20)。构建体pBlue-YURA3(C)用于对照目的。

图3：示出YlME和YlME-T2的氨基酸序列比对。这种型式的YlME与图1所示的解脂耶氏酵母中天然表达的ME相比有一个残基(第二个氨基酸)不同。

图4：示出耶氏酵母属中用于产生ω-3和ω-6脂肪酸的生物合成途径。

图5：示出破坏基因组中的ME基因座的一般方案。简而言之，已经靶向ME缺失构建体的转化体选择Ura⁺表型，然后通过5-氟乳清酸(5-FOA)选择Ura^-表型。随后筛选Ura^-克隆，其中ME基因已经与URA3基因一起重组出基因组。

图6：示出的是用于敲除解脂耶氏酵母中的ME基因的质粒pME-KO。

表1：基因和蛋白质序列号汇总

具体实施方式

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式将其全文并入本文。

提供了如下定义。

“二十碳五烯酸”缩写为“EPA”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“细胞干重”缩写为“DCW”。

“重量百分比”缩写为“重量％”。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。

术语“苹果酸酶”是指(S)-苹果酸：NADP⁺氧化还原酶(脱羧)、丙酮酸苹果酸羧化酶、NADP⁺-特异性苹果酸酶、或NADP⁺-苹果酸酶。苹果酸酶不可逆地将苹果酸脱羧成丙酮酸，同时由NADP⁺形成NADPH。苹果酸酶具有国际酶学委员会(Enzyme Commission)编号EC 1.1.1.39和EC1.1.1.40。术语“胞浆苹果酸酶”是指靶向细胞内的胞浆(细胞质)的苹果酸酶。如果苹果酸酶缺乏线粒体靶向序列或具有功能障碍的线粒体靶向序列，胞浆靶向可发生。术语“苹果酸酶”和“ME”本文互换使用。

术语“线粒体靶向序列”是指将蛋白质导向定位于线粒体的氨基酸序列。术语“线粒体靶向序列”、“MTS”、和“线粒体信号肽”本文互换使用。MTS一般位于蛋白质N-末端并包含一个或多个两亲螺旋，它们具有交替的疏水性氨基酸和带正电的氨基酸。MTS的结构允许蛋白质与线粒体表面受体相互作用并且随后通过内部和外部线粒体膜层转移到线粒体基质中，其中MTS随后裂解。MTS长度一般为二十至八十个氨基酸。生理学上已经描述了线粒体靶向序列(例如Molecular Biology of the Cell，Alberts等人，第4版，Garland Science：NY(2002)。

术语“功能障碍的线粒体靶向序列”是指不具有线粒体靶向功能的MTS。MTS可因为包含改变MTS结构特征的缺失、插入、和/或氨基酸改变、使得MTS不与线粒体表面受体相互作用或不允许线粒体膜转移而发生功能障碍。例如，功能障碍的MTS可由去除或结构上减弱MTS的一个或多个两亲螺旋导致。

术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。美国专利申请公布2009-0093543-A1中提供了对脂质的一般综述(参见其中的表2)。

术语“油”是指在25℃时为液体的脂质物质；油在有机溶剂中是疏水的和可溶解的。在含油生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但还可包含其他中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的脂肪酸浓度的升高或降低将对应于油中的脂肪酸浓度的升高或降低，反之亦然。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸。

术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是生物质或油。因此总脂肪酸包括来自中性脂质级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)和极性脂质级分(包括，例如，磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占细胞干重[“DCW”]的百分比的形式表示，不过总脂质含量能够近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME％DCW”]量度。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。

本文将总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA的重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非本文另外具体声明，给定脂肪酸对总脂质或油的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度(例如总脂质或油的％EPA等同于EPA％TFA)。

在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占细胞干重的重量百分比[“％DCW”]是有用的。因此，例如，EPA产率[“EPA％DCW”]的测量将按照下列算式确定：(EPA％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，以例如EPA的脂肪酸占细胞干重的重量百分比[“％DCW”]表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：(EPA％TFA)*(FAME％DCW)]/100。

术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分中，例如在总脂质或油中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以TFA的重量％形式表示。混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。

如某些实施例所用，术语“含油”描述倾向于以脂质的形式贮存它们的能源的那些生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。含油微生物可包含、或者可积聚或生产其细胞干重的约25％或更多的油(即，≥25 TFA％DCW)。

术语“含油酵母”指那些产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的例子包括例如以下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂-C₂₂(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X：Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)、以及“w-6脂肪酸”(ω-6或n-6)对“w-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。

表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表2的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。

表2：多不饱和脂肪酸及其前体的命名

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。这一过程描述于文献中(例如美国专利7,932,077；美国专利申请公布2009-0093543-A1)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码这些酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和/或C_20/22延伸酶。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序及类似的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用如下的单字母名称指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”是包含多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的足够用于推断地鉴定该多肽和基因的序列的部分，如美国专利申请公布2010-0317072-A1中所描述的，所述鉴定是通过人工评估，或使用例如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

如某些实施例所用，术语“分离的”是指已经从其天然来源全部或部分纯化的多核苷酸或多肽分子。在一些情况下，分离的多核苷酸或多肽分子是较大组合物、缓冲体系或试剂混合物的一部分。例如，分离的多核苷酸或多肽分子可以异源方式包含在细胞或生物内。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，并且其可以指单独的编码区或可以包含所述编码区上游和/或下游的调控序列(例如，所述编码区的转录起始位点上游的5′非翻译区、3′非编码区)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”指在生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因是指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”是指位于所述编码序列的转录起始位点上游的核苷酸序列5′非翻译区以及3′非编码区，并且其可影响转录、RNA加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎-环结构和基因表达调控涉及的其它元件。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，启动子序列位于编码序列的5′上游。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的细胞生长和/或发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。引起基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”、“转录终止子”和“终止子”指位于编码序列3′下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′端。所述3’区能够影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。

在某些实施例中术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“重组”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现人工合成。术语“重组的”、“转基因的”、“转化的”、“工程化的”或“修饰用于外源基因表达的”本文互换使用。

如本文所用，术语“表达”是指有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还包括mRNA至多肽的翻译。

如某些实施例所有，术语“提高的”是指具有更大的数量，例如仅略大于初始数量的数量，或例如与初始数量相比过大的数量，并且包括介于二者之间的所有数量。作为另外一种选择，“提高的”可指该数量或活性与和它相比较的数量或活性相比，高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。术语“提高的”、“大于”、和“改善的”本文互换使用。术语“提高的”可用于表征编码蛋白质的多核苷酸的表达，例如，其中“提高的表达”也可意指“过表达”。

“转化”指将核酸分子转移进宿主生物内。核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”、“重组”或“转化的”生物或“转化体”。

“稳定转化”是指将核酸片段转移进宿主生物的基因组中(既包括核基因组也包括细胞器基因组)，导致基因稳定遗传(即，该核酸片段被“稳定地整合”)。相反“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中央代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以具有源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，并且可以是线性的或环状的、单链或双链DNA或RNA的，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”是指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由以下序列构成：1)启动子；2)编码序列(即，ORF)；和，3)在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点的终止子。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。典型的序列分析软件包括例如：1)GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)SEQUENCHER(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)；和，5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，召开年份：1992，111-120，编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

在某些实施例中，在核酸或多肽序列上下文中“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。因此，“序列同一性百分比”或“百分比同一性”指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中在与参考序列(其不包含添加或缺失)进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)以实现两个序列的最佳比对。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。

用于测定“百分比同一性”和“百分比相似性”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。百分比同一性和百分比相似性能够容易地通过已知方法计算出来，所述方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和，5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

序列比对和百分比同一性或相似性的计算可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，wI)的MegAlign^TM程序。作为另外一种选择，“BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的算法，采用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，采用默认参数比较蛋白质序列。

本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且被描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

本文公开了多种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列作为本公开发明的某些实施例的特征。这些序列的变体与本文公开的序列有至少约70-85％、85-90％、或90％-95％相同，它们可用于某些实施例。作为另外一种选择，在某些实施例中变体氨基酸序列或多核苷酸序列与本文公开的序列可具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与公开序列相同的功能，或者具有公开序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的功能。

如下文例子所示，在线粒体或胞浆中过表达苹果酸酶，对野生型解脂耶氏酵母中的脂质产量有较少影响或无影响。

令人惊讶地并且意外地是，已发现过表达胞浆苹果酸能够提高转基因耶氏酵母属菌种中的脂质产量，其包含：

(i)编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸；

(ii)耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35％的脂质含量；和

(iii)经工程化的多不饱和脂肪酸(PUFA)生物合成途径。

具体地，本发明的转基因耶氏酵母属菌种包含，特别是，非天然的胞浆苹果酸酶(ME)-编码多核苷酸。从这种意义上说，编码ME的多核苷酸可为耶氏酵母属菌种异位的或异源的。

编码胞浆ME的多核苷酸可为DNA或RNA聚合物，并且可为单链或双链的。多核苷酸可包含由耶氏酵母属菌种产生的核苷酸，其包含多核苷酸、或合成的、非天然的或改性的核苷酸(例如核苷酸碱基类似物)。多核苷酸可为线性片段形式或为较大核苷酸构建体(例如质粒、载体、线性或环状构建体)的组分。多核苷酸或包含多核苷酸的构建体可为染色体或附加体。作为另外一种选择，多核苷酸可表征为基因、基因序列、核酸序列、DNA序列、互补DNA(cDNA)序列、或RNA序列。

多核苷酸可含有编码胞浆ME的开放阅读框(ORF)(即，胞浆ME编码序列)，以及调控胞浆ME ORF表达的元件。作为另外一种选择，多核苷酸可具有包含一个或多个内含子的氨基酸编码序列，所述内含子可经由基因剪接而被去除(例如胞浆ME基因的基因组拷贝)。调控元件可包括启动子和/或3’转录终止序列(即，终止子序列)。其它元件可包括翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎-环结构和/或基因表达调控涉及的其它元件。

上述调控元件可操作地连接至胞浆ME编码区，使得ME表达功能上受到该元件的调控。从这种意义上说，该元件在耶氏酵母属菌种中是活性的或可操作的。另外，可认为多核苷酸是可表达的或能够在耶氏酵母属菌种中表达。启动子活性可为组成型的(对于胞浆ME过表达)或对特定环境刺激具有特异性活性(即，可诱导的)。调控元件是包含该多核苷酸的耶氏酵母属菌种天然的或异源的。异源胞浆ME基因盒具有一个或多个非苹果酸酶基因调控元件和/或非-耶氏酵母属-来源的调控元件，它可表征为嵌合的。可使用的启动子和终止子序列的例子在下文例子部分提供，并且还公开在美国专利申请公布2006/0035351A1和2010/0068789A1中，二者均以引用方式并入本文。

与在将多核苷酸导入其中之前的耶氏酵母属菌种(即，对照耶氏酵母属)中已经存在的表达水平相比，在耶氏酵母属菌种中编码胞浆ME的多核苷酸的氨基酸编码序列的表达可表征为上调的、增强的、增加的、提高的、或过表达的。因为据信耶氏酵母属菌种不具有天然胞浆ME基因，来自该多核苷酸的胞浆ME的任何水平的外源表达可表征为上调的或过表达的，例如与在其经修饰以包含胞浆ME编码的多核苷酸之前的耶氏酵母属菌种(或者与一些其它合适的对照相比，例如野生型耶氏酵母属或包含但不表达胞浆ME编码的多核苷酸的转化耶氏酵母属等等)相比。然而，在经修饰以包含所述多核苷酸的耶氏酵母属菌种中提高的胞浆ME表达水平可表征为与在其经修饰以包含胞浆ME编码的多核苷酸之前的耶氏酵母属菌种(或相应的耶氏酵母属对照)中的胞浆ME表达水平高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、500％、或1000％。

术语“对照细胞”和“合适的对照细胞”互换使用并且可指其中已经进行了特定修饰的细胞(例如过表达的多核苷酸、下调的多核苷酸)(即，“实验细胞”)。对照细胞可为不具有或不表达实验细胞的特定修饰的任何细胞。因此，对照细胞可为未转化的野生型细胞或可为经基因转化但不表达基因转化的细胞。例如，对照细胞可为实验细胞的直系亲本，该直系亲本细胞不具有实验相比中的特定修饰。作为另外一种选择，对照细胞可为通过一代或多代去除的实验细胞的亲本。作为另外一种选择，对照细胞可为实验细胞的同胞细胞，该同胞细胞不包含存在于实验细胞中的特定修饰。可用作对照细胞的同胞细胞可为其中插入用于蛋白质过表达的质粒，但是在同胞细胞中不表达该质粒的细胞，而该质粒在实验细胞中表达。本领域的技术人员熟知如何确定细胞是否可为对照细胞。

编码胞浆ME的多核苷酸的氨基酸编码序列可经优化以被其中置入所述多核苷酸的耶氏酵母属菌种的蛋白质翻译机制识别。例如，胞浆MEORF可来源于耶氏酵母属之外的菌种，但是其经密码子优化以在耶氏酵母属中表达。这种方式的密码子优化可按照美国专利7,125,672中提供的解脂耶氏酵母密码子使用谱进行。

作为外源多核苷酸表达的替代形式，编码胞浆ME的多核苷酸可在耶氏酵母属中从天然ME基因座自身表达，但是其已经进行了合适的修饰。因为耶氏酵母属中的天然ME基因编码线粒体ME，这一基因将必须使用基因靶向技术进行修饰(例如序列敲除)以去除在天然耶氏酵母属ME ORF的5’-端编码的全部或部分线粒体靶向序列。在天然耶氏酵母属ME基因座处的其它修饰可包括添加组成型启动子、用于过表达修饰基因的附加调控元件、和/或修饰翻译起始位点使得修饰基因将产生定位在细胞质中的ME。

由所述多核苷酸编码的胞浆ME可表征为包含胞浆ME的氨基酸序列的多肽。胞浆ME也可表征为胞浆(S)-苹果酸：NADP⁺氧化还原酶(脱羧)、丙酮酸-苹果酸羧化酶、NADP⁺-特异性苹果酸酶、或NADP⁺-苹果酸酶(国际酶学委员会(Enzyme Commission)编号EC 1.1.1.39和EC1.1.1.40)。

苹果酸酶在活生物中产生多种必需的生理功能。ME反应的最终产物(丙酮酸、CO₂、NAD(P)H；见下文)给料于多种生物途径，诸如TCA循环和还原生物合成过程。ME的某些NADP-依赖型异构体存在于细菌、酵母、真菌、鸟类和哺乳动物中，并且主要在生物合成反应如脂质生物合成和通过供给NADPH的去饱和中起作用。NADP-依赖型ME的几种异构体通过翻译后修饰作用(部分蛋白水解裂解、磷酸化或去磷酸化)存在于真菌中(Saayman等人，2006，S.Afr.J.Enol.Vitic.27：113-122)。

苹果酸酶活性催化以下反应：

苹果酸+NADP⁺→丙酮酸+CO₂+NADPH，

其也可表示为：

这个反应导致L-苹果酸氧化脱羧成丙酮酸和CO₂。L-苹果酸也可称为(S)-苹果酸。胞浆ME活性可为NADP⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)-依赖的；从这种意义上说，由所述多核苷酸编码的胞浆ME也可表征为例如NADP⁺-依赖型ME、NADP⁺-依赖型胞浆ME、或NADPH-生成ME。用于测量胞浆ME活性的方法是本领域熟知的(例如Pongratz等人，2009，Methods.Enzymol.457：425-450；Geer等人，1980，Comp.Biochem.Physiol.65B：25-34；Fukuda等人，2005，Archaea.1：293-301)。

ME催化一般以三步进行：脱氢苹果酸以产生草酰乙酸、脱羧草酰乙酸以产生烯醇丙酮酸、以及互变异构烯醇丙酮酸以产生丙酮酸。ME的活性位点残基可大概分成四类：(1)二价阳离子结合残基；(2)底物结合残基；(3)NAD(P)⁺辅因子结合残基；和(4)催化残基。金属离子用作将苹果酸正确定位在活性位点的桥(Saayman等人，2006，S.Afr.J.Enol.Vitic.27：113-122)。

在本发明的一个实施例中，由所述多核苷酸编码的胞浆苹果酸酶不包含线粒体靶向序列(MTS)。胞浆ME可来源于从其中已经去除了MTS的线粒体ME。因为胞浆ME缺乏MTS一因此它不是线粒体ME一这种ME不位于线粒体，而是位于细胞胞浆内。胞浆ME也可表征为细胞质ME或线粒体外ME。作为另外一种选择，胞浆ME可来源于或表示位于它天然形式的胞浆中的苹果酸酶(即，无需进行基因工程或其它修饰以赋予它胞浆定位特性)。

线粒体ME的MTS位于蛋白质N-末端。因此，从线粒体ME中去除MTS将涉及删除来自N-末端的或N-末端内的氨基酸残基。从这种意义上说，通过从线粒体ME中去除MTS获得的胞浆ME可表征为相对于从中获得胞浆ME的线粒体ME氨基截短的或N-末端截短的。

MTS可鉴定为包含交替型式的疏水性氨基酸和带正电氨基酸。一般来讲，MTS具有一个或多个螺旋状序列，其在一个面上包含丰富的正电荷并且在另一面上包含疏水性残基(两亲螺旋)。根椐受操纵的MTS的本性和序列，可去除线粒体ME的N-末端的大约前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、或80个氨基酸以提供胞浆ME，或者可去除线粒体ME的MTS内的约5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、或80个连续氨基酸的片段以提供胞浆ME。作为另外一种选择，MTS亚结构的氨基酸(参见Neupert，1997，Ann.Rev.Biochem.66：863-917，以引用的方式并入本文)可被改变、缺失、或通过插入破坏。

在本发明的另一个实施例中，由所述多核苷酸编码的胞浆苹果酸酶包含功能障碍的线粒体靶向序列。例如，胞浆ME可能由于以下原因缺乏功能MTS：(i)缺乏全部或部分MTS，(ii)包含抑制MTS功能的一个或多个氨基酸改变(例如由基因突变或改变导致的改变)，和/或(iii)向细胞提供、或在细胞中表达抑制苹果酸酶MTS功能的因子(例如小分子、抗体、抗原结合抗体片段、核酸配体等等)。胞浆ME的一个例子是解脂耶氏酵母线粒体ME，其缺乏功能MTS(例如解脂耶氏酵母线粒体ME，其缺乏MTS的任何或全部氨基酸)。

MTS可使用算法如Emanuelsson等人(2000，J.Mol.Biol.300：1005-1016)描述的算法进行鉴定。用于鉴定蛋白质中的MTS的其它算法包括例如MitoProt(Claros等人，1996，Eur.J.Biochem.241：779-786)、Predotar(Small等人，2004，Proteomics 4：1581-1590)、和pTARGET(Guda等人，2005，Bioinformatics 21：3963-3969)。作为另外一种选择，MTS可通过比对查询序列与已经在其它蛋白质中表征的一个或多个MTS氨基酸序列进行鉴定。

一般来讲，MTS通过首先经由通过MTS疏水性表面的相互作用结合到外线粒体膜上的受体(外膜转运蛋白，或“Tom”)上行使功能(Roise等人，1988，J.Biol.Chem.263：4509-4511)。随后MTS通过它的带正电表面转移到另一个Tom受体复合物上(Brix等人，1997，J.Biol.Chem.272：20730-20735)，该复合物包含通道。在通过Tom通道转移进入线粒体内膜空间后，MTS的碱性残基介导与高酸性复合物(内膜转运蛋白，或“Tim”)的相互作用，其介导包含MTS的蛋白质进入线粒体基质(Abe等人，2000，Cell 100：551-560)。一旦转移完成，MTS通常从蛋白质裂解(Neupert，1997，Ann.Rev.Biochem.66：863-917)。

苹果酸酶的MTS可相对于任何这些分子相互作用被鉴定和/或制备成功能障碍的。例如，可进行结合分析以测定是否推定MTS的某些ME N-末端氨基酸结合到线粒体外膜和内膜的上述受体-通道复合物上。去除和/或改变介导ME与这些因子结合的那些氨基酸中的一个或多个可防止MTS将ME靶向线粒体。

编码胞浆ME的多核苷酸可来源于编码来自耶氏酵母属菌种或不同生物的ME的多核苷酸。苹果酸酶广泛分布在自然界中并且已经被报道存在于酵母裂殖酵母(S.pombe)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、拜耳接合酵母(Z.bailii)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和产朊假丝酵母(C.utilis)中。酿酒酵母(S.cerevisiae)、产朊假丝酵母(C.utilis)和裂殖酵母(S.pombe)ME是双官能的并且能够与苹果酸和草酰乙酸反应。酿酒酵母(S.cerevisiae)ME可利用NAD⁺和NADP⁺作为电子受体，优选NAD⁺。产朊假丝酵母(C.utilis)ME利用NAD⁺或NADP⁺用于草酰乙酸的脱羧，但是仅利用NADP⁺用于L-苹果酸的脱羧。酵母ME显示相对于它们的底物亲和力和金属需求的不同。裂殖酵母(S.pombe)ME具有非常高的底物亲和力(K_m＝3.2mM)，这与酿酒酵母(S.cerevisiae)的ME相反(K_m＝50mM)。产朊假丝酵母(C.utilis)和裂殖酵母(S.pombe)的胞浆ME活性需要二价阳离子Mn²⁺或Mg²⁺，相比之下线粒体酿酒酵母(S.cerevisiae)ME优选Mn²⁺(Saayman等人，2006，S.Afr.J.Enol.Vitic.27：113-122)。

胞浆ME可来源于例如以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ IDNO：3(图1)、或GenBank登录号NP_012896、ABL67725、XP_504112、XP_001683592.1、AAF54860.1、AAF54859.1、NP_731739.1、NP_524880.2、EHQ58305.1、AEY64427.1、EHP69692.1、EHP69535.1、AEX51047.1、ZP_09413940.1 EHM12738.1、EHM10701.1、AEV69826.1、AEV24956.1、AEV24553.1、ZP_09201798.1、AEV29176.1、AEV33715.1、ACU98038.1、EAZ89719.1、AET68238.1、AET65914.1、EH148436.1、YP_003543293.1、YP_003134865.1、ADE35429.1、ACL02315.1、ZP_08187924.1、ZP_08182502.1、ZP_08177630.1、EGD19865.1、EGD14411.1、ZP_01730858.1、AAB07709.1、AAA41563.1、XP_001913406.1、ADX74453.1、ACZ23235.1、ACU98385.1、YP_003316069.1、YP_003148857.1、YP_003154265.1、ZP_09629862.1、ACR47743.1、EHP37708.1、AEX51358.1、YP_004063227.1、ADR27874.1、ADN70279.1、ADN63267.1、NP_439983.1、YP_004076148.1、ZP_09517186.1、EHN27331.1、ZP_09329416.1、EHL58360.1、ADT98313.1、ZP_09289264.1、ZP_09285866.1、ZP_09267857.1、BAL27832.1、YP_001655800.1、EHK74844.1、YP_004510107.1、YP_003142912.1、EHJ97543.1、EBA14945.1、ZP_09091420.1、ZP_08429361.1、ABV78885.1、ZP_05120299.1、EGJ31523.1、ADJ15331.1、AD189962.1、EGJ23089.1、ZP_08663698.1、ZP_05586166.1、ZP_04466958.1、ABM45933.1、ZP_06862982.1、ZP_03833419.1、ZP_03513851.1、ZP_02331708.1、ZP_07448622.1、ZP_02153123.1、ZP_02151206.1、ZP_01916022.1、ZP_01883625.1、ZP_01870789.1、AAC47396.1、BAE47514.1、EHQ60523.1、NP_838014.1、YP_001019404.1、YP_984283.1、AAF37577.1、CAA39690.1、CCC74376.1、BAB76295.1、YP_647281.1、NP_422343.1、NP_244034.1、YP_001239856.1、XP_002283814.1、AEW62565.1、YP_001232212.1、YP_001235403.1、YP_001002607.1、EEU87611.1、NP_002386.1、NP_001155058.1、EFG91746.1、AAF54860.1、NP_524880.2、AEC06242.1、NP_001105383.1、AAA41563.1、EAT42717.1、AAK97531.1、XP_002572611.1、NP_001138325.1、NP_001015690.1、NP_001128692.1、NP_001231187.1、NP_001082582.1、NP_001003627.2、XP_532217.3、XP_848770.1、XP_001499853.2、XP_001499424.2、XP_518610.3、ADK56109.1、EDN59877.1、ABL67725.1、GAA86393.1、XP_001267753.1、ABM30154.1、CAX41101.1、XP_001825515.1、EHA55338.1、XP_001395105.2、XP_001390670.2、XP_003236013.1、EEA25978.1、XP_002548578.1、EGU77660.1、或XP_448858.1提供的任何多肽。利用这些ME多肽中的任何一个，定位于线粒体的那些可经适当修饰(参见上文)以靶向或定位于胞浆。可使用这些多肽中任一个的变体，但是应具有ME酶活性(例如参见上文)和胞浆定位。这一变体可包含与参考ME的氨基酸序列至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。优选地，变体ME包含与参考ME至少约90％相同的氨基酸序列。其中这些参考ME之一是线粒体，应当理解其位于胞浆中的变体可在MTS中包含突变、缺失、和/或插入，这干扰MTS靶向活性(参见上文)。

由所述多核苷酸编码的胞浆ME可为原核或真核的，并且可来自细菌、真菌、酵母、植物、动物、原生动物、或藻类。耶氏酵母属菌种可含有1、2、3、4、5、6、7、8、或更多个编码相同或不同胞浆ME多肽组合的多核苷酸。

由所述多核苷酸编码的胞浆ME多肽可包含SEQ ID NO：5(图3)。SEQ ID NO：5表示耶氏酵母属线粒体ME，从其中已经去除了前53个氨基酸。作为另外一种选择，这种胞浆ME的变体可包含与SEQ ID NO：5至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。这个变体应具有ME酶活性(例如参见上文)和胞浆定位。在本发明的一个实施例中，胞浆苹果酸酶包含具有与SEQ ID NO：5至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有苹果酸酶活性。

由所述多核苷酸编码的胞浆ME多肽可包含与SEQ ID NO：7(图3)至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列；这个变体应定位于胞浆并且具有ME酶活性(例如参见上文)。假定SEQ IDNO：7表示线粒体ME，应当理解其位于胞浆中的变体具有在MTS中的突变、缺失、和/或插入，这干扰MTS靶向活性(参见上文)。

编码胞浆ME的多核苷酸序列的一个例子是包含编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：4的一个多核苷酸。作为另外一种选择，给定遗传密码子的简并性，多核苷酸可包含编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：4的一个变体。例如，这个变体多核苷酸可与编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：4至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。另一个多核苷酸可具有编码上述变体耶氏酵母属ME多肽的序列。

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站在线可用的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)算法可用于计算本文所公开的两个或更多个多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之间的百分比同一性。作为另外一种选择，序列间的百分比同一性可使用Clustal算法(例如ClustalW或ClustalV)进行计算。对于使用Clustal比对方法的多重比对，默认值可相当于GAP PENALTY＝10、以及GAPLENGTH PENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数可为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALSSAVED＝4。

在细胞环境中，胞浆ME作为另外一种选择能够通过改变(例如氨基酸突变、缺失、或插入)与线粒体ME的MTS相互作用的蛋白质、从而影响线粒体转运来提供。此种改变可抑制MTS相互作用蛋白质与MTS结构域的结合，从而防止ME的线粒体转运。因此，由于不再靶向线粒体，“线粒体ME”可变为胞浆ME。在为上述目的可改变的ME线粒体靶向中起作用的MTS相互作用蛋白质的例子由Neupert公开(1997，Ann.Rev.Biochem.66：863-917)。

由包括其任何变体(例如同源物、突变体、缺失体等等)在内的所述多核苷酸编码的胞浆ME具有苹果酸酶活性(参见上文)。其中变体具有比它的参考ME(例如天然ME、野生型ME、未改变的ME、内源ME等等)更低的活性，变体ME的活性应具有至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的参考ME活性。

由所述多核苷酸编码的胞浆ME的氨基酸序列可包含添加的蛋白质标记或表位，使得ME表达为可被较容易地检测或分离的标记蛋白(即，融合蛋白)。标记或表位应不干扰ME酶活性(例如参见上文)和胞浆靶向。

用于实施本发明的优选耶氏酵母属菌种是解脂耶氏酵母。可用于制备本文提供的转基因耶氏酵母属菌种的解脂耶氏酵母菌株的例子购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)：菌株名称ATCC#20362、#8862、#8661、#8662、#9773、#15586、#16617、#16618、#18942、#18943、#18944、#18945、#20114、#20177、#20182、#20225、#20226、#20228、#20327、#20255、#20287、#20297、#20315、#20320、#20324、#20336、#20341、#20346、#20348、#20363、#20364、#20372、#20373、#20383、#20390、#20400、#20460、#20461、#20462、#20496、#20510、#20628、#20688、#20774、#20775、#20776、#20777、#20778、#20779、#20780、#20781、#20794、#20795、#20875、#20241、#20422、#20423、#32338、#32339、#32340、#32341、#34342、#32343、#32935、#34017、#34018、#34088、#34922、#34922、#38295、#42281、#44601、#46025、#46026、#46027、#46028、#46067、#46068、#46069、#46070、#46330、#46482、#46483、#46484、#46436、#60594、#62385、#64042、#74234、#76598、#76861、#76862、#76982、#90716、#90811、#90812、#90813、#90814、#90903、#90904、#90905、#96028、#201241、#201242、#201243、#201244、#201245、#201246、#201247、#201249、或#201847。

除了编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸之外，本发明的转基因耶氏酵母属菌种还可包含经工程化的PUFA生物合成途径。

例如其中油酸转化成EPA的代谢过程涉及通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如下所述存在多个用于EPA生产的替代途径。

具体地讲，图4描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一个ω-6脂肪酸)。然后，使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并以LA作底物，如下所述来形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C_20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。

Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径还能够使用α-亚麻酸[ALA]作为底物，产生长链ω-3脂肪酸如下：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C_20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，可将ω-6脂肪酸转化成ω-3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。就本文目的而言，有利的是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产不含显著量的γ-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。

ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C_18/20延伸酶，即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地，LA和ALA可以通过Δ6去饱和酶分别被转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C_18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。

EPA在重组耶氏酵母种(Yarrowia sp.)宿主细胞中的经济的商业生产需要考虑多种变量，包括EPA浓度[“EPA％TFA”]和总脂质含量[“TFA％DCW”]。此外，还希望在最终的油产物中减少中间体脂肪酸和副产物脂肪酸的产生，以使所期望的脂肪酸即EPA的生产最大化。

中间体脂肪酸是能够通过其他代谢途径的酶的作用被进一步转化为EPA的那些脂肪酸(例如，油酸、LA、ALA、EDA、DGLA、ETA)。与此相对，副产物脂肪酸(例如，金松烯酸、杜松烯酸)是指所产生的既不是EPA也不是能被进一步转化为EPA的中间体脂肪酸的任何脂肪酸。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了具有生产微生物油的能力的优化的重组解脂耶氏酵母菌株，其中所述微生物油包含至少约43.3 EPA％TFA，同时具有少于约23.6 LA％TFA(EPA：LA比率为1.83)。优选的菌株是Y4305，其最高产量为55.6 EPA％TFA，具有3.03的EPA：LA比率。一般来讲，美国专利申请公布2009-0093543-A1的EPA菌株包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的下列基因：

a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因；

b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因；

c)至少一种编码Δ5去饱和酶的基因；

d)至少一种编码Δ17去饱和酶的基因；

e)至少一种编码Δ12去饱和酶的基因；

f)至少一种编码C_16/18延伸酶的基因；以及

g)任选地，至少一种编码二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT1)的基因。

具有上述酶学功能的优选的基因的例子列于表3中(尽管这些基因不应视为对本发明的限制)。

从前述讨论中本领域技术人员将会知道，上述PUFA生物合成途径酶中的一种或多种可来源于耶氏酵母属和/或来源于一种或多种含油生物。此类其它含油生物可表征为含油微生物、酵母、霉菌、真菌、卵菌、细菌、藻类、原生藻菌、或原生生物(例如类眼虫)。含油酵母的例子，除耶氏酵母属(Yarrowia)之外还包括假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的菌种。含油真菌的例子包括镰孢属(Fusarium)(例如砖红镰孢菌(Fusarium lateritium))、被孢霉属(Mortierella)(例如高山被孢霉(Mortierella alpina))和毛霉属(Mucor)(例如鲁氏毛霉(Mucorrouxii)和卷枝毛霉(Mucor circinelloides))的菌种，它们均为丝状真菌。含油藻类的例子包括虫霉属(Entomophthora)、腐霉属(Pythium)和紫球藻(Porphyridium)的菌种。

在本发明的一个实施例中，经工程化的PUFA生物合成途径产生至少一种选自下列的PUFA：亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸和ω-6二十二碳五烯酸。优选地，所产生的PUFA是二十碳五烯酸。

除了(i)编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸和(ii)经工程化的多不饱和脂肪酸(PUFA)生物合成途径之外，本发明的转基因耶氏酵母属菌种还包含所述耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35重量％的脂质含量。

此类高脂质含量转基因耶氏酵母属菌株的例子是Z1978、L250、L258、Z5565、Z5567、Z5575、Z5576、Z5620、Z5623、Z5625、Z5581、Z5582、Z5583、Z5584、Z5570、Z5571、Z5572、Z5574、Z5585和Z5627，它们全部公开在美国专利申请公布2012/0052537 A1中，其公开内容以引用的方式并入本文。可用于实施本发明的高脂质含量转基因耶氏酵母属菌株的其它例子公开在美国专利申请公布2010/0317072 A1中(例如菌株Y8647、Y9028、Y9029、Y9031、Y9481、Y9502、Y9508和Y9510)，它们全部以引用方式并入本文。所有这些示例性耶氏酵母属菌株能够产生相应菌株细胞干重的大于约35重量％的脂质含量。

转基因耶氏酵母属菌种可具有按重量计至少约35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、或65％的耶氏酵母属菌种DCW脂质含量(即，总脂质或油)。在本发明一个优选的实施例中，脂质含量为耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约50重量％。

由转基因耶氏酵母属菌种产生的总脂质或油的含量(TFA％DCW)相对于插入编码胞浆ME的多核苷酸之前的耶氏酵母属菌种(或相对于另一种合适对照诸如野生型耶氏酵母属或包含但不表达编码胞浆ME的多核苷酸的转化耶氏酵母属等等)的总脂质/油含量可提高至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％。

包含受关注的基因的构建体或载体，可以通过任何标准技术被导入宿主细胞。这些技术包括转化(例如，醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、基因枪轰击(impact)、电穿孔、显微注射或将所关注的基因导入宿主细胞中的任何其他方法。例如，美国专利4,880,741和5,071,764，和Chen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))描述了基于DNA的线性化片段的用于解脂耶氏酵母的整合技术。

为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的耶氏酵母属细胞在本文中称为“转化的”、“工程化的”、“转化体”、或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达盒，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合进基因组内还是存在于具有多拷贝的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过多种选择技术来鉴定，如例如美国专利7,238,482和美国专利7,259,255所述。

用于本文的优选选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在备选的实施例中，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)被用于选择酵母尿嘧啶-突变体(美国专利申请公布2009-0093543-A1)，或者可利用赋予磺酰尿类除草剂抗性的天然乙酰羟酸合酶(或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)(国际专利申请公布WO 2006/052870)进行对转化体的选择。美国专利申请公布2009-0093543-A1中还教导了一种独特的方法，该方法通过使用位点特异性重组酶体系，“循环利用”一对优选的选择标记，用于连续进行的多重转化中。

可能有利的是调控控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质定位、氧限制和宿主细胞分泌等多个方面的多个不同的遗传因子。更具体地，在某些实施例中基因表达可通过改变以下进行控制：相关启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数；所述基因是质粒携带的或整合到宿主细胞基因组中去的；所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；在宿主生物中的翻译效率；所克隆基因的蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些过表达方法中的多种将在下文中被讨论，并且在对重组微生物宿主细胞的遗传学操作中作为过表达基因的方法是有用的。

对于驱动异源基因在微生物宿主细胞中的表达有用的启动子有很多，并且是本领域的技术人员已知的。表达能以诱导型或组成型完成。诱导型表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。事实上，能够指导基因表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)都是适合的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。

终止子通常能够来源于启动子从其获得的基因的3呕或来自不同的基因。大量的终止子是已知的，并且在用于与它们所源自的属和物种相同的和不同的属和物种时，在多种宿主中令人满意地起作用。终止子的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，终止子来源于酵母基因。终止子还能够是合成的，本领域的技术人员能够利用可利用的信息来设计和合成终止子。终止子可以是非必需的，但它是高度优选的。

尽管不旨在进行限制，用于耶氏酵母的重组微生物宿主细胞中的优选的启动子和终止子是美国专利申请公布2009-0093543-A1、美国专利申请公布2010-0068789-A1、美国专利公布2011-0059496-A1、美国临时专利申请61/469,933、美国临时专利申请61/470,539、美国临时专利申请61/471,736、和美国临时专利申请61/472,742中提出的那些，上述每个专利申请的公开内容以引用方式并入本文。

PUFA生物合成途径去饱和酶、延伸酶等基因的附加的拷贝(即，多于-个的拷贝)可以被引入重组微生物宿主细胞中，以从而提高EPA的产生和积聚。具体地，基因的附加的拷贝可以被克隆在单种表达构建体内；和/或所克隆基因的附加的拷贝可以通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来导入宿主细胞中。

要指出的是，当按照本文的方法制备最优化的重组微生物宿主细胞时，多种去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶等的拷贝数是经常被提及的。例如如果需要2拷贝的Δ9延伸酶，这能够是指：1)针对从单一物种分离的特定Δ9延伸酶的相同编码序列的两个拷贝；或，2)针对从物种“A”分离的Δ9延伸酶的一种编码序列和针对从物种“B”分离的Δ9延伸酶的一种编码序列，因此总共产生两种Δ9延伸酶。

一般来讲，一旦已经获得适用于在重组微生物宿主细胞中表达的DNA盒(例如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，则将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合进宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。虽然不依赖本文，如果构建体靶向内源基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源基因座提供。

在某些实施例中转基因耶氏酵母属菌种还可包含编码苹果酸脱氢酶(MDH)的异源多核苷酸。换句话讲，胞浆ME可与MDH共表达。在某些实施例中MDH是MDH(EC 1.1.1.37)，它是一种利用NAD⁺还原成NADH可逆催化苹果酸氧化成草酰乙酸的酶。因为MDH(EC 1.1.1.37)也催化这个反应的逆向反应(即，催化草酰乙酸成为苹果酸)，MDH的表达能够增加胞浆ME可利用的苹果酸底物量。当将苹果酸转化成丙酮酸时，这继而能够帮助维持NADPH的胞浆ME生产。MDH和胞浆ME反应的这一交点可如下示出(其中MAE是苹果酸酶并且PYC是丙酮酸羧化酶)：

作为另外一种选择，在某些实施例中MDH是“苹果酸脱氢酶(NADP+)”，其也可称为“(S)-苹果酸：NADP⁺氧化还原酶”。苹果酸脱氢酶(NADP+)(EC 1.1.1.82)是催化化学反应：(S)-苹果酸+NADP⁺à草酰乙酸+NADPH+H⁺的酶。苹果酸脱氢酶(NADP+)属于氧化还原酶家族，具体地，属于那些作用于利用NAD⁺或NADP⁺作为受体的供体的CH-OH基团。由此反应产生的NADPH为脂肪酸合成提供NADPH源。

在某些实施例中MDH(EC 1.1.1.37或EC 1.1.1.82)可为原核或真核的，并且可来自细菌、真菌、酵母、植物、动物、原生动物、藻类、或原生藻菌。耶氏酵母属菌种可含有1、2、3、4、5、6、7、8、或更多个编码相同或不同MDH酶的多肽组合的异源多核苷酸。MDH可为例如线粒体MDH、胞浆MDH、或过氧化物酶体MDH。多个MDH酶(EC 1.1.1.37和EC 1.1.1.82)是本领域已知的。

在本发明的某些实施例中，在耶氏酵母属菌种中与胞浆ME共表达的MDH可为耶氏酵母属MDH。此种MDH可使用异源多核苷酸在耶氏酵母属菌种中过表达，计入MDH的天然基因表达。耶氏酵母属MDH可包含例如SEQ ID NO：25。SEQ ID NO：25是线粒体MDH。作为另外一种选择，耶氏酵母属MDH可包含与SEQ ID NO：25至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且具有MDH活性(例如将草酰乙酸转化成苹果酸)。可利用编码任何这些MDH氨基酸序列的多核苷酸，例如SEQ ID NO：24。在某些实施例中，MDH包含SEQ ID NO：30，其与SEQ ID NO：25有一个氨基酸残基不同(在位点2包含一个缬氨酸残基，而不是苯丙氨酸残基)。

在本发明的某些实施例中，耶氏酵母属MDH可包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29。SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29是过氧化物酶体MDH酶。作为另外一种选择，耶氏酵母属MDH可包含与SEQ ID NO：27或SEQID NO：29至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且具有MDH活性(例如将草酰乙酸转化成苹果酸)。可利用编码任何这些MDH氨基酸序列的多核苷酸，例如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28。

相对于工程化的重组解脂耶氏酵母宿主细胞，在该微生物宿主中表达基因的优选的方法是通过将线性DNA片段整合进该宿主的基因组中。当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的优选的基因座包括在美国专利申请公布2009-0093543-A1中提出的那些。

此外，Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化体、受体菌株和所用的靶向平台。因此，技术人员将认识到，特定重组微生物宿主的多个转化体必须被筛选，以获得表现出所期望的表达水平和模式的菌株。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

本发明还涉及用于提高转基因耶氏酵母属菌种的脂质含量的方法，所述方法包括：

b)任选地，回收步骤(a)的微生物油。

在培养耶氏酵母属菌种以产生包含至少一种PUFA的微生物油12、24、36、48、60、72、84、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、或200小时后，油可回收自或获取自转基因耶氏酵母属菌种。

本公开的转基因耶氏酵母属菌种可在优化嵌合基因(例如编码去饱和酶、延伸酶等等)表达的条件下生长并产生最大和最经济产量的一种或多种PUFA。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如，解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基[“YPD”])或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基中(如酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利申请公布2011-0059204-A1所述。尽管预期在本发明中利用的碳源可以涵盖很多种包含碳的源，优选的碳源是糖类(例如，葡萄糖、转化蔗糖、果糖和它们的组合)、甘油和/或脂肪酸(例如，包含介于10-22个碳的那些)。

氮可以由无机源(如(NH₄)₂SO₄)或有机源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合重组微生物宿主细胞生长和促进用于产生EPA的酶途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe⁺2、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²和Mg⁺²)(Nakahara等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页(1992))。

用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基或玉米浆。也可使用其它确定的或合成的生长培养基。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中产生EPA所必需的。这种方法，以及多种适合的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项，描述于美国专利7,238,482中。

美国专利申请公布2009-0093543-A1的实例10还提供了重组解脂耶氏酵母菌株Y4305(其最大的产量是12.1 EPA％DCW[55.6 EPA％TFA，具有3.03的EPA％TFA对LA％TFA比率]，经过了162小时)的2-L发酵所需的参数的详细描述。该公开包括了对用于从冷冻的培养物制备接种物以产生种菌培养物的方法、在促进快速生长至高的细胞浓度的条件下对酵母的初始培养、和随后用于促进脂质和PUFA积聚(通过氮饥饿和持续提供葡萄糖)的对酵母的培养的描述。方法变量包括温度(控制在30-32℃之间)、pH(控制在5-7之间)、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。

在本发明的一些方面，初级产物是重组微生物生物质。同样地，从所述微生物生物质中分离和纯化包含PUFA的油可能是不必要的(即，其中全细胞生物质是产品)。然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要来自所述微生物生物质的部分和/或全部分离/纯化的包含EPA的油，以产生部分纯化的微生物生物质、纯化油、和/或纯化EPA。关于这些方面的更多细节参见美国专利申请公布2010-0317072-A1。

实例

除非本文特别指明，实例中使用以下方法。用于培养解脂耶氏酵母菌株和测量它们的细胞干重、脂质含量和其脂肪酸分布型的方法一般如美国专利申请公布2008/0254191和2009/0093543所述进行，它们以引用的方式并入本文。利用质粒表达载体转化解脂耶氏酵母菌株的方法一般如美国专利申请公布2009/0093543所述进行，该文献以引用的方式并入本文。重组DNA克隆和操纵使用标准分子生物学方法进行。

实例1

用于天然或截短(胞浆)解脂耶氏酵母苹果酸酶过表达的载体构建

分析解脂耶氏酵母苹果酸酶(ME)的氨基酸序列以确定是否其中包含线粒体靶向序列(MTS)。在鉴定推定MTS后，构建用于全长(线粒体)ME和截短(胞浆)ME表达的载体。

苹果酸酶MTS鉴定

解脂耶氏酵母ME序列(YlME，SEQ ID NO：1，GenBank Acc.No.XP_504112)利用TargetP 1.1 Server序列分析预测程序(Center forBiological Sequence Analysis，Technical University of Denmark，Lyngby，Denmark)，如Emanuelsson等人(2000，J.Mol.Biol。300：10051016)所述进行分析以确定是否这种蛋白质可包含任何特定的亚细胞定位序列如MTS。这一分析表明耶氏酵母属ME包含长度为26个氨基酸残基的推定MTS(图1，在YlME序列中用下划线示出)。

据报道酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)苹果酸酶(ScME，SEQID NO：2，GenBank Acc.No.EDN59877)是线粒体苹果酸酶，而裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的苹果酸酶(SpME，SEQ ID NO：3，GenBank Acc.No.NP_587760)是胞浆苹果酸酶(Saayman等人，2006，S.Afr.J.Enol.Vitic.27(2)：113-122)。来自酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)和解脂耶氏酵母的苹果酸酶序列比较显示YlME和ScME的前55个和85个氨基酸分别不具有明显的在SpME中的相应部分(图1)。这表明MTS可与YIME的前55个氨基酸残基一样长，或包含在其内。

构建用于苹果酸酶过表达的载体

全长耶氏酵母属ME(YlME)ORF通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得，该反应利用5’-端引物ME-F(SEQ ID NO：11，包含添加的NcoI位点)和3’-端引物ME-R(SEQ ID NO：12，包含添加的NotI位点)。这些引物扩增从ATG起始密码子至终止密码子的编码区，不同的是第二密码子从TTA(leu)变为GTA(val)，这是为了工程化添加的NcoI位点。PCR反应混合物包含1mL解脂耶氏酵母基因组DNA，1mL各种引物ME-F和ME-R(来自20mM原液)，22mL水，和25mL Ex Taq^TM预混物2X Taq PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Siga，Japan)。扩增如下进行：首先于94℃变性2分钟，然后是30个循环的：94℃变性30秒，55℃退火引物30秒，并且72。C延伸90秒。最后在72℃进行7分钟的延伸，随后在4℃终止反应。通过该反应扩增的DNA片段使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)，根据制造商规程进行纯化。纯化的DNA用NcoI和NotI消化，并克隆进NcoI/NotI-酶切质粒中，该质粒具有基于pZP2的载体主链(参见美国专利申请公布2010/0159558，从而产生pME(SEQ ID NO：13)表达载体(图2A)。

为了构建胞浆型式的耶氏酵母属ME，编码N-末端截短型式YlME的DNA片段通过PCR产生。这种截短去除了YIME的前53个氨基酸；在这个区中预测的MTS因此用这个序列缺失而去除。缺乏N-末端氨基酸1-53的YlME ORF(“YlME-T2”)如下制备。利用上述PCR条件，5’-端引物ME-TN2(SEQ ID NO：8，包含添加的NcoI位点)和3’-端引物ME-T2(SEQ ID NO：9，包含添加的NotI位点)用于扩增YlME-T2 ORF加上来自解脂耶氏酵母基因组DNA的ME基因的3’-非翻译区的203个碱基对。扩增片段如上进行纯化，用NcoI和NotI消化，并克隆进NcoI/NotI-酶切pME载体中以产生pMET2(图2B，SEQ ID NO：10)。

在pME和pMET2中，克隆的编码序列(分别是全长的或截短的YlME)处于解脂耶氏酵母果糖-二磷酸醛缩酶基因的FBAIN启动子(“FBAIN”，参见美国专利7,202,356)的转录控制下。这个启动子允许例如耶氏酵母属菌种中的下游基因序列过表达。另外，两个编码序列在它们的3’-端通过来自解脂耶氏酵母PEX20基因(GenBank Acc.No.AF054613)的终止子序列侧接。pMET2具有YlME基因的203bp的3’非翻译序列，该序列位于ME-T2编码区和PEX20终止子之间。正确连接的构建体通过相应的质粒小量制备和消化分析进行确认。

构建的嵌合基因表达盒可缩略表征为FBAIN：：YlME：：PEX20和FBAIN：：YlME-T2：：PEX20。翻译的YlME和YlME-T2多肽的比对如图3所示。假定解脂耶氏酵母ME基因的编码区不包含内含子，如上所述扩增的序列也可认为是代表cDNA序列。YlME和YlME-T2 ORF的序列分别如SEQ ID NO：6和4所示。

实例2

ME过表达及其对解脂耶氏酵母脂质生产的效应

过表达野生型(全长)或胞浆ME对不同解脂耶氏酵母菌株的脂质含量的效应使用如实例1所述的构建体来确定。

在以下基因过表达研究中，解脂耶氏酵母菌株利用质粒pME或pMET2，分别用FBAIN：：YlME：：PEX20或FBAIN：：YlME-T2：：PEX20嵌合基因表达盒转化，其用BssHII和SphI消化。为转化控制目的，在每个实验中使用的菌株用质粒pBlue-YURA3(图2C，SEQ ID NO：14)转化，该质粒用KpnI和SalI消化。质粒pBlue-YURA3来源于克隆载体(-)(Stratagene，La Jolla，CA)，其经修饰以包含耶氏酵母属URA3基因(GenBank Acc.No.AJ306421)，该基因位于(-)多克隆位点。在缺乏尿嘧啶的平板上选择转化体，因为实验和对照载体赋予Ura⁺表型，否则是Ura^-细胞。在这些分析中使用解脂耶氏酵母菌株Y2224；Y2224是野生型菌株ATCC#20362的Ura^-菌株，并且具有野生型耶氏酵母属的代表性的脂质含量。菌株Y2224的分离描述于美国专利申请公布2008/0254191中，该文献以引用的方式并入本文。

转化体在发酵液体培养基(FM，每升：6.70g酵母氮源，6.00gKH₂PO₄，2.00g K₂HPO₄，1.50g MgSO₄*7H₂O，20g葡萄糖，5.00g酵母提取物[BBL])中生长2天，然后在高葡萄糖培养基(HGM，每升：80g葡萄糖、2.58g KH₂PO₄、5.36g K₂HPO₄，pH7.5[无需调节])中生长5天。在这段培养期后，转化体的脂质含量(TFA％DCW)和脂肪酸分布型通过气相色谱法，如美国专利申请公布2008/0254191所述进行测量。

菌株Y2224中的脂质生产

用pBlue-YURA3(对照)、YlME、或YlME-T2序列转化的耶氏酵母属菌株Y2224的脂质和脂肪酸分布型在表4中列出。分析YlME或YlME-T2过表达的四种不同的(1-4)对照转化体和八种(1-8)不同的转化体。检测到的脂肪酸包括16：0(棕榈酸)、16：1(棕榈油酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(油酸)和18：2(亚油酸)；每种脂肪酸的浓度在表4中表示为TFA的重量百分比(即，“％TFA”)。

表4：在过表达全长或胞浆ME的解脂耶氏酵母菌株Y2224中的脂质含量。

如表4所示，用于YlME和YlME-T2过表达的最多的转化体产生与携带对照质粒pBlue-YURA3的转化体相似量的总脂质。

这些结果共同指示过表达全长ME或胞浆ME基本上不改变具有野生型脂质生产能力的耶氏酵母属菌株的脂质产量。具体地，全长或胞浆ME的过表达在描述的分析条件下不显著提高约15 TFA％DCW的野生型脂质产量基线水平。

菌株Z1978U中的脂质生产

pME和pME-T2过表达载体也用于转化解脂耶氏酵母工程化菌株Z1978U，它是Z1978的Ura^-菌株。Z1978菌株能够产生大于约35 TFA％DCW的脂质含量，为约52 EPA％TFA。有关开发菌株Z1978和Z1978U的详细内容在美国专利申请公布2012/0052537 A1中提供，该文献以引用方式并入本文。Z1978U转化体的脂质和脂肪酸分布型在表5中列出。分析YlME或YlME-T2过表达的四种不同的(1-4)对照转化体和八种(1-8)不同的转化体。在总脂肪酸中检测到的脂肪酸包括18:0、18:1、18:2、二高-γ-亚麻酸(DGLA)和二十碳五烯酸(EPA)。

表5：在过表达全长或胞浆ME的解脂耶氏酵母菌株Z1978U中的脂质含量

如表5所示，大多数pME转化体与对照转化体相比显示脂质含量的适度提高(～5％)。然而，大多数pME-T2转化体与对照转化体相比产生显著更高的脂质含量(＞10％)；具体实例在表中以粗体列出。pME-T2转化体中的EPA含量(EPA％DCW)一般随着总脂质含量的提高而提高。因此胞浆ME的表达使得菌株Z1978U中的脂质产量增加。这个结果与对上文菌株Y2224(具有野生型耶氏酵母属的代表性脂质含量)的观察相反，其平均不表现出随着胞浆ME过表达的脂质产量显著提高。

这些结果共同指示胞浆ME的过表达能够显著提高转基因耶氏酵母属菌株的脂质产量，该菌株具有高于约35 TFA％DCW的脂质生产能力。具体地，这一菌株中胞浆ME的过表达相对于对照将脂质产量提高超过10％。

菌株Z5567U中的脂质生产

上文质粒相似地用于转化解脂耶氏酵母的另一个工程化菌株Z5567U，它是Z5567的Ura^-菌株。Z5567菌株能够产生大于约55.0 TFA％DCW的脂质含量，具有约27.0 EPA％DCW。有关开发菌株Z5567和Z5567U的详细内容在美国专利申请公布2012/0052537 A1中提供，该文献以引用方式并入本文。如表6所示，分析Z5567U中YlME或YlME-T2过表达的四种不同的(1-4)对照转化体(pBlue-YURA3)和十种(1-10)不同的转化体的脂质产量。在总脂肪酸中检测到的脂肪酸包括18:0、18:1、18:2、DGLA和EPA。对照和pME(全长耶氏酵母属ME)Z5567U转化体产生相似含量的总脂质。然而，pMET2(胞浆耶氏酵母属ME)转化体产生比对照和pME转化体显著更多的总脂质。在pMET2转化体中提高的总脂质含量的具体实例在表6中以粗体列出。

表6：在过表达全长或胞浆ME的解脂耶氏酵母菌株Z5567U中的脂质含量。

胞浆ME的表达也使得菌株Z5567U中的脂质产量增加。因此，这些结果还指示胞浆ME的过表达能够显著提高转基因耶氏酵母属菌株的脂质产量，该菌株具有高于约35 TFA％DCW的脂质生产能力。在这种特定情况下，胞浆ME过表达在所述分析条件下提高具有高于50 TFA％DCW的脂质生产能力的菌株中的脂质产量。

利用工程化高脂质菌株获得的结果与对上文菌株Y2224(具有野生型耶氏酵母属的代表性脂质含量)的观察相反，其平均不表现出随着胞浆ME过表达的脂质产量显著提高。另一个差异是由Y2224和Z5567U中的全长ME对胞浆ME诱导的脂质含量的效应。在Y2224中，过表达全长ME和胞浆ME对脂质含量的相应效应与对照相比是相当类似的。然而，在菌株Z5567U中的全长ME过表达与对照相比一般降低脂质含量，而胞浆ME诱导脂质含量提高。然而，在菌株Z1978中，全长ME适度提高脂质含量，而胞浆ME具有对提高脂质含量显著更明显的效应。这些数据共同指示胞浆ME提高耶氏酵母属的高脂质产量菌株的脂质生产能力。

基于这些数据，胞浆ME产生的NADPH还原当量可能是能够产生大约高于35 TFA％DCW的耶氏酵母属菌株中的脂质生物合成的一个因素。由在较低脂质产量的耶氏酵母属菌株中的胞浆ME产生的NADPH看起来在脂质生产中不起到显著作用。这些过程可指示随着菌株中脂质生产能力的提高，由胞浆ME产生的NADPH变为对脂质生物合成更必需的(即，较多的脂质合成可能需要更大的还原能力)。令人感兴趣地是，然而，即使Z5567U产生比Z1978U更多的脂质，胞浆ME过表达对脂质生产的效应在Z1978U中比在Z5567U中更明显。例如，虽然胞浆ME过表达在Z1978U中提高脂质产量超过10％(上文所述)，在Z5567U中的脂质产量比对照提高了超过约3％。

概括地说，上述结果指示胞浆ME的过表达能够显著提高转基因耶氏酵母属菌株的脂质产量，该菌株具有高于约35 TFA％DCW的脂质生产能力。

实例3

删除编码ME的基因及其对解脂耶氏酵母中脂质生产的影响

测量在缺乏天然ME基因的耶氏酵母属中以及在其脂质生产提高的转化体中的脂质生产。提高的脂质生产由二酰基甘油酰基转移酶-2(DGAT2)过表达诱导。

苹果酸酶基因的缺失

构建质粒pME-KO(图6，SEQ ID NO：15)以通过同源重组去除野生型耶氏酵母属中的ME基因。图5示出破坏方法的一般方案。ME基因的5’-和3’-侧接区通过利用以下引物对的PCR进行扩增：YME-5-1(SEQ IDNO：16)/YME-5-2(SEQ ID NO：17)用于5’-侧接区，并且YME-3-1(SEQID NO：18)/YME-3-2(SEQ ID NO：19)用于3’-侧接区。

利用耶氏酵母属基因组DNA作为模板进行PCR扩增。反应混合物包含1mL基因组DNA，1mL各种引物(来自20mM原液)，22mL水，和25mL Ex Taq^TM预混物2X Taq PCR溶液。扩增如下进行：首先于94℃变性2分钟，然后是30个循环的：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒。最后在72℃进行7分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。

在一个三片段连接反应中，在pBlue-YURA3的BamHI和EcoRI位点之间克隆两个PCR产物。5’-侧接区的PCR产物用EcoRI和XhoI消化，并且3’-侧接区的PCR产物用XhoI和BamHI消化。质粒pBlue-YURA3用BamHI和EcoRI消化。将三个DNA片段连接在一起，使得两个PCR产物在XhoI位点接合在一起，并且连接的PCR产物位于载体的BamHI和EcoRI位点之间。所得质粒pME-KO(SEQ ID NO：15)在图6中示出。

解脂耶氏酵母菌株Y2224(Ura^-代表野生型耶氏酵母属，参见上文)用经SphI消化过的pME-KO转化。将转化体置于Ura^-缺失平板上以选择整合构建体。Ura⁺转化体通过菌落PCR筛选，所述PCR利用引物YME-5-confirm-1(SEQ ID NO：20)和YME-5-confirm-2(SEQ ID NO：21)。

反应混合物包含0.5mL各种引物(20mM原液)，14mL水和15mL ExTaq^TM预混物2X Taq PCR溶液。从平板中采集小量细胞并加到反应混合物中。PCR条件为：首先于95℃变性5分钟，然后是35个循环的：94℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸60秒。最后在72℃进行7分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。

如果消化过的质粒在ME基因座处整合进耶氏酵母属基因组，～1-kb的片段将已经通过PCR产生。36个转化体中有三个产生期望的PCR产物。将这三个转化体封接到基本培养基平板中，该平板包含350mg/mL 5-氟乳清酸(5-FOA)(美国专利申请公布2009-0093543)，用于选择就发生第二轮重组以变成Ura^-的细胞。发生第二轮重组的细胞可能已经(i)丧失了野生型ME基因以及缺失构建体，或(ii)仅丧失了缺失构建体，在这种情况下ME基因保持完整(参见图5)。

选择来自5-FOA平板的十六个菌落并通过菌落PCR，利用引物YME-3-confirm-1(SEQ ID NO：22)和YME-3-confirm-2(SEQ ID NO：23)进行测试。如果从菌株中删除ME基因，期望获得～1.3-kb的片段。PCR条件与上文用于确认第一轮重组的PCR相同。两个Ura^-菌株产生PCR产物，其具有正确的大小(～1.3kb)，指示这些转化体包含缺失。两个转化体通过利用引物YME-5-confirm-2和YME-3-confirm-1的PCR进一步确认ME基因缺失。如果敲除了ME基因，这一引物对将扩增250-bp的产物，或者如果ME基因座是野生型，将扩增～1.7-kb的产物。两种Ura^-菌株产生250-bp的PCR片段，从而确认它们是菌株Y2224的ME-缺失衍生物。

在ME-缺失耶氏酵母属中的脂质生产

在ME-缺失菌株中进行脂质测量以确定ME在耶氏酵母属脂质生产中的作用。如下所述，用pBlue-YURA3、pME、或pME-T2转化过的ME-缺失Y2224细胞允许相对于天然脂肪酸合成进行这种评估。

Y2224的Ura^-、ME^-菌株用以下转化：(i)用EcoRI和SalI消化过的pBlue-YURA3，(ii)用BssHII和SphI消化过的pME，或(iii)用BssHII和SphI消化过的pME-T2。转化体(在Ura^-缺失平板上选择)在FM中生长2天，然后在HGM中生长5天。选自pBlue-YURA3、pME和pME-T2各个转化的两个转化体的脂质含量和脂肪酸分布型在下表7中示出；也对野生型耶氏酵母属菌株ATCC#20362的两个单独培养物进行测量。在总脂肪酸中检测到的脂肪酸包括16：0、16：1、18：0、18：1和18：2。

表7：在用pBlue-YURA3、pME、或pME-T2转化过的Y2224-ME ^- 菌株中的脂质含量

ME缺失看起来对野生型耶氏酵母属中的脂质生产和脂肪酸分布型不具有任何效应，因为TFA％DCW和％TFA值在野生型菌株ATCC#20362和Y2224-ME^-+pBlue-YURA3转化体之间是相似的(表7)。考虑到除了ME缺失外，Y2224-ME^-转化体与ATCC#20362仅在URA3基因座处不同并且包含一部分pBlue-YURA3对照载体，这是一个公平的比较。

用pME或pME-T2转化Y2224-ME-菌株允许比较过表达胞浆ME或全长ME对脂质代谢的效应，并且无任何天然全长ME引起的背景效应。符合其中在用pME或pME-T2转化过的菌株Y2224中脂质含量不显著改变的上述结果，当全长ME或胞浆ME在Y2224-ME^-中过表达时，对脂质代谢无明显效应(表7)。

最后，在比较Y2224-ME^-+pBlue-YURA3转化体的脂质特征与Y2224-ME^-+pME或pME-T2转化体的脂质特征时，在Y2224中的ME(胞浆或全长)表达拯救对脂质含量无显著效应。这与以下相符：在ATCC#20362和Y2224-ME^-+pBlue-YURA3之间的脂质代谢中无可识别的差异；即，如果去除ME对脂质生产无效应，则添加ME应同样无任何效应。

本文用菌株Y2224获得的结果共同指示ME，无论是全长ME还是胞浆ME，不显著影响尚未经修饰以提高脂质产量的耶氏酵母属(例如转基因菌株Z1978U和Z5567U)中的脂质代谢。

实例4

编码解脂耶氏酵母中的胞浆苹果酸酶和苹果酸脱氢酶的多核苷酸的异源共表达

这个实例描述了共表达的多核苷酸，它们在解脂耶氏酵母中以异源方式一个编码胞浆ME，另一个编码苹果酸脱氢酶(MDH)。进行这一分析以确定是否MDH表达能够促进当在具有至少约35％细胞干重的脂质含量的解脂耶氏酵母中表达胞浆ME时发生的脂质产量的提高。

引物YMDHl-F(SEQ ID NO：31)和YMDHl-R(SEQ ID NO：32)用于PCR-扩增编码解脂耶氏酵母线粒体MDH(SEQ ID NO：30)的多核苷酸。将这个多核苷酸克隆进载体，使得它被包含在具有用于表达在耶氏酵母属中表达多核苷酸的合适启动子和终止子序列的表达盒内。

实施转化程序以在具有至少约35％细胞干重的脂质含量的解脂耶氏酵母菌株中共表达YlME-T2和耶氏酵母属线粒体MDH。如上所述测量转化体的脂质特征。

Claims

1.一种转基因耶氏酵母属(Yarrowia)菌种，包含：

(i)编码胞浆苹果酸酶的多核苷酸；

(ii)所述耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约35重量％的脂质含量；和

(iii)经工程化的多不饱和脂肪酸(PUFA)生物合成途径，

其中所述胞浆苹果酸酶的过表达提高脂质含量。

2.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，其中所述胞浆苹果酸酶包含功能障碍的线粒体靶向序列。

3.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，其中所述胞浆苹果酸酶并不包含线粒体靶向序列。

4.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，其中所述胞浆苹果酸酶包含与SEQ ID NO：5具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞浆苹果酸酶具有苹果酸酶活性。

5.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，其中所述脂质含量为所述耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约50重量％。

6.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，其中所述经工程化的PUFA生物合成途径产生至少一种选自下列的PUFA：亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。

7.根据权利要求6所述的耶氏酵母属菌种，其中所述经工程化的PUFA生物合成途径产生二十碳五烯酸。

8.根据权利要求1所述的耶氏酵母属菌种，所述耶氏酵母属菌种的菌种是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

9.一种用于提高转基因耶氏酵母属菌种的脂质含量的方法，所述方法包括：

a)培养权利要求1所述的转基因耶氏酵母属菌种，其中产生包含至少一种PUFA的微生物油，以及

b)任选地，回收步骤(a)的微生物油。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述胞浆苹果酸酶包含功能障碍的线粒体靶向序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述胞浆苹果酸酶并不包含线粒体靶向序列。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述胞浆苹果酸酶包含与SEQ IDNO：5具有至少约90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞浆苹果酸酶具有苹果酸酶活性。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述脂质含量为所述耶氏酵母属菌种细胞干重的至少约50重量％。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述经工程化的PUFA生物合成途径产生至少一种选自下列的PUFA：亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述经工程化的PUFA生物合成途径产生二十碳五烯酸。