CN105002192B - 一种苹果酸酶基因rkme1及其重组表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中高效表达，表达产物具有苹果酸酶功能。

Description

一种苹果酸酶基因RKME1及其重组表达载体

技术领域

本发明涉及一种苹果酸酶（Malic enzyme）基因及其重组表达载体，具体涉及以红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸酶（ME）的基因RKME1，将其连接至表达载体，进一步转化至大肠杆菌BL21中，诱导表达，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行了酶活测定。属于微生物基因工程和酶工程领域。

背景技术

苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧为丙酮酸和CO₂，同时伴随着NAD(P)⁺的还原；苹果酸酶普遍存在于生物体内；根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malic enzyme；NAD-ME；EC1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-苹果酸酶（ NADP-Malicenzyme；NADP-ME；EC 1.1.1.40。本发明主要是针对NADP- 苹果酸酶）基因进行研究。

通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C₄植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME 参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH 调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C₃光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C₃增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）: 200-204.)。

苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新基因苹果酸酶MI3410ME1，与pET-32a(+)质粒进行重组，并实现在E.coli BL21中表达。为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的苹果酸酶基因RKME1及该基因编码的氨基酸，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1623bp（碱基），其中1-1623为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸酶基因RKME1的重组表达载体pET32aRKME1，该重组表达载体是将SEQ ID NO:1所示基因直接与载体pET32a（+）所构建的重组表达载体。

本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸酶基因RKME1或上述的重组表达载体的宿主表达细胞。

本发明提供的核苷酸序列SEQ ID NO:1是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，将其与表达载体连接后转化至宿主细胞内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受季节、气候的影响，可以通过利用转化至不同的宿主细胞来开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建苹果酸酶重组表达载体pET32a RKME1，将其转化至大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明苹果酸酶基因RKME1构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32a RKME1图谱；

图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aRKME1的酶切分析图:其中：1为DNAMarker；2为pET32a（+）酶切后条带；3为pET32aRKME1酶切后条带；4为苹果酸酶基因RKME1的PCR扩增产物；

图3为本发明的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图：其中：1为转化了pET32a（+）并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；2为转化了pET32aRKME1并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为纯化的目的蛋白条带；4为蛋白电泳Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：红冬孢酵母YM25235苹果酸酶基因RKME1的克隆

采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中提取总RNA，用反转录试剂盒Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1μl cDNA为模板进行聚合酶链式反应；设计引物（引物1和引物2）进行PCR 扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：RKME1-F：5`-CGCGGATCCATGACCTACAACTTCAGCCCC-3`（SEQ ID NO:3）

引物2：RKME1-R：5`-CCCGAAGCTACTCTTCGTTGAGCAGCGGGT-3` SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

模板cDNA 1μL

RKME1F（10μmol/L） 1μL

RKME1R（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 40s、53.0℃ 40s、72℃ 1min30s进行30个循环，最后72℃ 10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含有氨苄青霉素（AMP⁺）的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1623bp长的序列，命名为RKME1，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：重组表达质粒pET32a RKME1的构建

采用实施例1中cDNA为模板进行PCR扩增，反应所以引物组合、反应组分和扩增条件如下：

引物1：RKME1-F：5`-CGCGGATCCATGACCTACAACTTCAGCCCC-3`（SEQ ID NO:3）

引物2：RKME1-R：5`-CCCGAAGCTACTCTTCGTTGAGCAGCGGGT-3`（ SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

模板cDNA 1μL

RKME1F（10μmol/L） 1μL

RKME1R（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 40s、53.0℃ 40s、72℃ 1min30s进行30个循环，最后72℃ 10min；

将上述PCR获得的基因片段和表达载体pET-32a（+）用BamHⅠ和Hind Ⅲ核酸内切酶进行双酶切，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，同时进一步对转化子进行双酶切验证分析，结果显示，如图2第3泳道所示，用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道4中该基因的PCR产物大小一致，大分子条带与泳道2中用相同酶切质粒pET-32a（+）后产生的条带大小一致，这表明所构建的重组质粒正确，进一步测序分析也证明这一点；将重组表达质粒命名为pET32aRKME1，该质粒图谱如图1所示。

实施例3：苹果酸酶基因RKME1在大肠杆菌BL21中的诱导表达

为了验证该基因编码蛋白的活性，将1μg重组质粒加入50μl E.coli BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42℃热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950μl LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡孵育1h；孵育结束后于2000×g离心3~5min，留下约50μl上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mL LB(含100μg/mL氨苄霉素)培养基中，37 ℃振荡培养至OD ₆₀₀达到0.6左右，按1%比例接种到1L LB液体培养基中，于37℃，160rpm培养至OD ₆₀₀值约为0.8；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃恒温摇床80 rpm诱导培养12小时，12000 rpm离心10min收集菌体。SDS-PAGE分析显示，重组表达质粒pET32a RKME1转化的大肠杆菌中表达了出一条分子量约为65kD的蛋白（见图3泳道2），但在空质粒pET-32a（+）转化的大肠杆菌中没有（见图3泳道1）。菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD₆₀₀≈20）30 mM的咪唑缓冲液，冰上超声破碎细胞，4℃，14 000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μm的微型滤膜过滤，滤液上样于已用3 0mM咪唑缓冲液平衡好的HisTrap HP柱（1 ml， GE Healthcare），用250mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一条纯蛋白条带（见图3泳道3）。

实施例4：苹果酸酶RKME1的酶活测定

苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH。由于ME的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH在30℃时浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大；以苹果酸和NAD（+）为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活；标准反应体系包括以80mM KH₂PO₄/KOH为缓冲液（PH7.5），每1ml反应液里含有25mM L-苹果酸、3mM MgCl₂和0.6mM NADP⁺；反应从加入L-苹果酸开始，一个酶活力单位是指30℃时每分钟生成1μmolNADPH所需的酶量。

苹果酸酶RKME1酶活按如下公式计算：

E=[V/(ε×D×P×V)] ×[Δe/Δt] ×1000

=[2/(6.220×1×0.436×0.5)] ×[(1.975-0.774)/10min] ×1000

=177.14 u/mg

V-----反应溶液最终体积(ml)

ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度（6.220）

D-----光路长（1cm）（比色皿直径）

V-----酶液体积（ml）

P-----蛋白质浓度（mg/ml）

Δe/Δt----单位时间内吸光度的变化

结果显示，所纯化的苹果酸酶RKME1的酶活为177.14 u/mg，表明重组表达质粒pET32a RKME1在大肠杆菌BL21中诱导表达出来的苹果酸酶RKME1具有苹果酸酶的活性。

序 列 表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种苹果酸酶基因RKME1及其重组表达载体

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA

<213> Rhodosporidium kratochvilovaeYM25235

<400> 1

atgacctaca acttcagccc ctcggccgcc caccccggcg gcgccgcccc cgccatgctc 60

ggcacaaagc ccctctgcgt cgagcgcgcc ctcgcccgcc tccgctccat ccccgacccg 120

ctctcgcagt acgcctacct cgcaggcctc cgcgcccgca acgcagacgt cttctacggc 180

ctcgtcggcg gcaacatgaa ggagtgctgc cccatcatct acacgcccat catcggcctc 240

gcgtgccaga actggtcgct catccacccg ccgccgcctc agaacgacga cacgatccac 300

tcgctctacc tctcctacgc cgacctgccc cgcctccccg agatcctcgc aaacctcaag 360

accaacctcc cccatgacca gatggcgatc tcggttgtga cggacggctc gcgcgtcctc 420

gggctcggag acctcggcgt cggcggcatg ggcatctcgc agggcaagct atcgctgtat 480

gtcgccgcgg gcggcgtcaa tcctaaggcg gccctcccga tcgcgatcga ctttggcacg 540

gacaacgaga agctgctcgc ggacccgctc tacgtcggcc tgcgccagcg ccgcctcgcc 600

gacgacaagt gcgaggagtt catggaggtc ttcatgcgcg agatgcacaa gacgttcccg 660

aatatgatca ttcaattcga ggactggccg acgctcgcgt tcccgctcct gcataagaat 720

cgcgacatct acccctgctt caatgacgac atccagggca cgggcgccgt cgtcctcgca 780

ggcgcggtcc gcgcgttcgc gctcaacggc gtcccgctca aggaccagaa gatcctcttc 840

tttggcgcgg gctcgagcgg cgtcggcgtc gccgagacca tctgcaagta ctttgagcac 900

cagggctgca cggagcagga ggccaaggac aagttttggc tcgtcgactc gaagggcctc 960

gtcgcgcaca accgcggcga caagctcccg atccacaagc actacctcgc gcgctcagag 1020

cccgacgcgc ccaagctccg cacgctccag gaggtcgtcg agcacgtgcg gccgacggcg 1080

ctcctcggcc tgtcgaccgt cggcgggacg ttcaccaagg agatcctcaa cctgatggcg 1140

acgtacaaca agcgcccgat cgtctttgcg ctgtcgaacc cggtcgcgca ggccgagtgc 1200

accttcgagg aggcggtcga gggtaccgac ggccgcgtcc tctttgcgag tggctcgccg 1260

ttcgaccccg tcagctacaa gggcaagcgg tacgagcctg gtcaggggaa caacatgtac 1320

atcttccctt ctctgggcct cggcgccatc ctcgcccgcg tcaagaccat cccggaagag 1380

ctcgtccacg cgtgctcgct cggcctcgcg tcgtcgctca cgcccgacga gctcgaccgc 1440

aacctcctct accccgacat tgagcgcatc cgcgaggtct cgatcaagat tgcggtcgcc 1500

gtcgtccgca aggcgcagga gctcaagatt gaccgcgcgg agaacctgcg cgagctggac 1560

gacgctcagc tcgaggacca catccgcagg cagagctacc acccgctgct caacgaagag 1620

tag 1623

<210> 2

<211> 540

<212> PRT

<213> Rhodosporidium kratochvilovaeYM25235

<400> 2

Met Thr Tyr Asn Phe Ser Pro Ser Ala Ala His Pro Gly Gly Ala Ala Pro Ala Met Leu

1 10 20

Gly Thr Lys Pro Leu Cys Val Glu Arg Ala Leu Ala Arg Leu Arg Ser Ile Pro Asp Pro

30 40

Leu Ser Gln Tyr Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Arg Ala Arg Asn Ala Asp Val Phe Tyr Gly

50 60

Leu Val Gly Gly Asn MET Lys Glu Cys Cys Pro Ile Ile Tyr Thr Pro Ile Ile Gly Leu

70 80

Ala Cys Gln Asn Trp Ser Leu Ile His Pro Pro Pro Pro Gln Asn Asp Asp Thr Ile His

90 100

Ser Leu Tyr Leu Ser Tyr Ala Asp Leu Pro Arg Leu Pro Glu Ile Leu Ala Asn Leu Lys

110 120

Thr Asn Leu Pro His Asp Gln Met Ala Ile Ser Val Val Thr Asp Gly Ser Arg Val Leu

130 140

Gly Leu Gly Asp Leu Gly Val Gly Gly Met Gly Ile Ser Gln Gly Lys Leu Ser Leu Tyr

150 160

Val Ala Ala Gly Gly Val Asn Pro Lys Ala Ala Leu Pro Ile Ala Ile Asp Phe Gly Thr

170 180

Asp Asn Glu Lys Leu Leu Ala Asp Pro Leu Tyr Val Gly Leu Arg Gln Arg Arg Leu Ala

190 200

Asp Asp Lys Cys Glu Glu Phe Met Glu Val Phe Met Arg Glu Met His Lys Thr Phe Pro

210 220

Asn MET Ile Ile Gln Phe Glu Asp Trp Pro Thr Leu Ala Phe Pro Leu Leu His Lys Asn

230 240

Arg Asp Ile Tyr Pro Cys Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ala Val Val Leu Ala

250 260

Gly Ala Val Arg Ala Phe Ala Leu Asn Gly Val Pro Leu Lys Asp Gln Lys Ile Leu Phe

270 280

Phe Gly Ala Gly Ser Ser Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Ile Cys Lys Tyr Phe Glu His

290 300

Gln Gly Cys Thr Glu Gln Glu Ala Lys Asp Lys Phe Trp Leu Val Asp Ser Lys Gly Leu

310 320

Val Ala His Asn Arg Gly Asp Lys Leu Pro Ile His Lys His Tyr Leu Ala Arg Ser Glu

330 340

Pro Asp Ala Pro Lys Leu Arg Thr Leu Gln Glu Val Val Glu His Val Arg Pro Thr Ala

350 360

Leu Leu Gly Leu Ser Thr Val Gly Gly Thr Phe Thr Lys Glu Ile Leu Asn Leu MET Ala

370 380

Thr Tyr Asn Lys Arg Pro Ile Val Phe Ala Leu Ser Asn Pro Val Ala Gln Ala Glu Cys

390 400

Thr Phe Glu Glu Ala Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Val Leu Phe Ala Ser Gly Ser Pro

410 420

Phe Asp Pro Val Ser Tyr Lys Gly Lys Arg Tyr Glu Pro Gly Gln Gly Asn Asn MET Tyr

430 440

Ile Phe Pro Ser Leu Gly Leu Gly Ala Ile Leu Ala Arg Val Lys Thr Ile Pro Glu Glu

450 460

Leu Val His Ala Cys Ser Leu Gly Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Asp Glu Leu Asp Arg

470 480

Asn Leu Leu Tyr Pro Asp Ile Glu Arg Ile Arg Glu Val Ser Ile Lys Ile Ala Val Ala

490 500

Val Val Arg Lys Ala Gln Glu Leu Lys Ile Asp Arg Ala Glu Asn Leu Arg Glu Leu Asp

510 520

Asp Ala Gln Leu Glu Asp His Ile Arg Arg Gln Ser Tyr His Pro Leu Leu Asn Glu Glu

530 540

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgacctacaa cttcagcccc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccgaagcta ctcttcgttg agcagcgggt 30

Claims (2)

1.一种苹果酸酶基因RKME1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种含有权利要求1所述的苹果酸酶基因RKME1的重组表达载体。