CN105349557B - 一种苹果酸酶基因rkme2及其重组表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中高效表达，表达产物具有苹果酸酶功能。

Description

一种苹果酸酶基因RKME2及其重组表达载体

技术领域

本发明涉及一种苹果酸酶（Malic enzyme）基因及其重组表达载体，具体涉及以红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸酶（ME）的基因RKME2，将其连接至表达载体，进一步转化至大肠杆菌BL21中，诱导表达，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行了酶活测定。属于微生物基因工程和酶工程领域。

背景技术

苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧为丙酮酸和CO₂，同时伴随着NAD(P)⁺的还原；苹果酸酶普遍存在于生物体内；根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malic enzyme；NAD-ME；EC1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-苹果酸酶（ NADP-Malicenzyme；NADP-ME；EC 1.1.1.40。本发明主要是针对NADP- 苹果酸酶）基因进行研究。

通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C₄植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters，2001，490:1-6.4；Martinoia E， Rentsch D，Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME 参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH 调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C₃光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C₃增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）: 200-204.)。

苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新基因苹果酸酶MI3410ME1，与pET-32a(+)质粒进行重组，并实现在E.coli BL21中表达。为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的苹果酸酶基因RKME2及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1911bp（碱基），其中1-1911为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸酶基因RKME2的重组表达载体pET32aRKME2，该重组表达载体是将SEQ ID NO:1所示基因直接与载体pET32a（+）所构建的重组表达载体。

本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸酶基因RKME2或上述的重组表达载体的宿主表达细胞，比如大肠杆菌BL21菌株。

本发明提供的核苷酸序列SEQ ID NO:1是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，将其与表达载体连接后转化至宿主细胞内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受季节、气候的影响，可以通过利用转化至不同的宿主细胞来开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建苹果酸酶重组表达载体pET32a RKME2，将其转化至大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明苹果酸酶基因RKME2构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32a RKME2图谱；

图2为本发明的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图：其中：1为蛋白电泳Marker；2为转化了pET32a（+）并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了pET32aRKME2并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：红冬孢酵母YM25235苹果酸酶基因RKME2的克隆

采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A Fungal RNA Kit从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中提取总RNA，用反转录试剂盒Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1μl cDNA为模板进行聚合酶链式反应；设计引物（引物1和引物2）进行PCR 扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：RKME2-F1：5`- ATGCCCGCCCCGACGACGCTCCTCGGCGCT-3`（SEQ ID NO:3）

引物2：RKME2-R1：5`- TCAGACGTCAACGAGCTCGAGGGGGCGGTA-3` SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

模板cDNA 1μL

RKME2F（10μmol/L） 1μL

RKME2R（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 40s、58.0℃ 40s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含有氨苄青霉素（AMP⁺）的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序；测序结果显示，获得一段1911bp长的序列，命名为RKME2，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：重组表达质粒pET32a RKME2的构建

采用实施例1中获得的cDNA片段作为模板进行PCR扩增，反应所以引物组合、反应组分和扩增条件如下：

引物1：RKME2-F2：5`- ACTGGATCCATGCCCGCCCCGACGA-3`（SEQ ID NO:5）

引物2：RKME2-R2：5`- ACGCAAGCTTGACGTCAACGAGCTCGA-3` SEQ ID NO:6）；

PCR扩增体系（50μL）组成如下：

5×Fast Pfu Buffer 10μL

dNTP（2.5μmol/L） 5μL

模板cDNA 1μL

RKME2F（10μmol/L） 1μL

RKME2R（10μmol/L） 1μL

Fast Pfu DNA polymerase（5U/μL） 1μL

无菌ddH₂O 补足至50μL；

扩增条件：94℃变性4min，再用94℃ 40s、58.0℃ 40s、72℃ 2min进行30个循环，最后72℃ 10min；取纯化的PCR产物和质粒pET32a分别用BamH I和Hind III酶切过夜，50μLPCR产物双酶切体系：PCR产物25μl，10×Tango Buffer 10ul，BamH I 2ul和Xho I 1.5 μL，用灭菌的双蒸水补齐，37℃酶切过夜。50 µL质粒pET-32a双酶切体系：质粒pET-32a 15μl，10×Tango Buffer 10μl，BamH I 2µL和Xho I1.5μL，用灭菌的双蒸水补齐，37℃酶切过夜。用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。再将回收片段进行连接，连接体系（10μL）：纯化的PCR产物和表达载体pET-32a（+）按5:1的比例用0.5μL的T4 DNA连接酶，T4 Buffer 1μL，16℃连接过夜；连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；37℃振荡培养1h后，涂布在含氨苄的LB培养基平板，37℃培养箱中培养12h，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aRKME2，该质粒图谱如图1所示，进一步酶切分析和测序分析也证明重组质粒的正确性。

实施例3：苹果酸酶基因RKME2在大肠杆菌BL21中的诱导表达

为了验证该基因编码蛋白的活性，将1μg重组质粒加入50μl E.coli BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42℃热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950μl LB液体培养基中，37℃、100rpm振荡孵育1h；孵育结束后于2000×g离心3~5min，留下约50μl上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mL LB(含100μg/mL氨苄霉素)培养基中，37 ℃振荡培养至OD ₆₀₀达到0.6左右，按1%比例接种到1L LB液体培养基中，于37℃，160rpm培养至OD ₆₀₀值约为0.8；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃恒温摇床80 rpm诱导培养12小时，12000 rpm离心10min收集菌体。SDS-PAGE分析显示，重组表达质粒pET32a RKME2转化的大肠杆菌中表达了出一条分子量约为65kD的蛋白（见图2泳道3），但在空质粒pET-32a（+）转化的大肠杆菌中没有（见图2泳道2）。菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD₆₀₀≈20）30 mM的咪唑缓冲液，冰上超声破碎细胞，4℃，14 000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μm的微型滤膜过滤，滤液上样于已用3 0mM咪唑缓冲液平衡好的HisTrap HP柱（1 ml， GE Healthcare），用250mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一条纯蛋白条带（见图2泳道4）。

实施例4：苹果酸酶RKME2的酶活测定

苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO₂和NADPH。由于ME的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH在30℃时浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大；以苹果酸和NAD（+）为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活；标准反应体系包括以80mM KH₂PO₄/KOH为缓冲液（PH7.5），每1ml反应液里含有25mM L-苹果酸、3mM MgCl₂和0.6mM NADP⁺；反应从加入L-苹果酸开始，一个酶活力单位是指30℃时每分钟生成1μmolNADPH所需的酶量。

苹果酸酶RKME2酶活按如下公式计算：

E=[V/(ε×D×P×V)] ×[Δe/Δt] ×1000

=[2/(6.220×1×0.436×0.5)] ×[(1.975-0.774)/10min] ×1000

=177.14μ/mg

V-----反应溶液最终体积(ml)

ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度（6.220）

D-----光路长（1cm）（比色皿直径）

V-----酶液体积（ml）

P-----蛋白质浓度（mg/ml）

Δe/Δt----单位时间内吸光度的变化

结果显示，所纯化的苹果酸酶RKME2的酶活为295.35 u/mg，表明重组表达质粒pET32aRKME2在大肠杆菌BL21中诱导表达出来的苹果酸酶RKME2具有苹果酸酶的活性。

序 列 表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种苹果酸酶基因RKME2及其重组表达载体

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1911

<212> DNA

<213> Rhodosporidium kratochvilovaeYM25235

<400> 1

atgcccgccc cgacgacgct cctgcgcctc gccgcgcgcc gtaccgcacc cgcgatcgca 60

cctcgcgcgc ctgcagcgcc gctgccgacc gcacggcgct tccagtcggc tgcgcaccag 120

gagaacaagc tccgcctgca gggcaaggag gcgcaggagg ccgcggagca cgacacgctc 180

cacgagaaca aggagtacct cgagcacgag aagaacttgc gccccatttg gactgcgctg 240

cgcgggcgcg cgctcctgaa tgagccgtct ctgaacaagg gcgccggctt cacgttcgag 300

gagcgggata cgttcggcct gtttggtctc ctgccgtacg aggtgcactc gctcgagcag 360

caatgcaagc gcgcgtactc gcagctgcaa gagcgcccca gcgcgatcgc caagtacacc 420

ttcctttcct ccctccgcga ccagaacatc gtcctcttct actcgctctg cctccgctac 480

cttaacgagc ttctccccgt catctacacc cccactgtcg gcgaggcgat ccagaagtac 540

tcgacgatct ggcgtcgccc tgatggcctg ttcctgagct accagcaccg gaataagatg 600

agggagatga tgctgcaggc gaagcggcct aaggacgtcg acctcatcgt cgtgaccgac 660

tcggagggca tcctcggcat tggcgaccag ggcgtcggcg gtatcctcat ctcgatgggc 720

aaggccaaca tctacaccct gggcggcggc atcgacccgt cgcgaatcct ccccgtcgtc 780

ctcgacgtcg ggacggacaa ccccgcgctc ctcaacgacc cgctctacct cggcatgcgc 840

cgcaagcgca tccgcgggcc cgagtacgac cagttcgtcg acgcgttctg cgactttgtc 900

cgcgaggagt acccgcaggc gatgcttcac ttcgaggact ttggcgtcaa ctcggcgggc 960

cggctcctgc agaagttccg ccccaagcag tcgtgcttca acgacgacat gcagggcacc 1020

gctgctgtcg tcctctcggc gctcgtctct gccgtcaagg tgacgaagag cgagctgaag 1080

gaccagcgca tcatcatcta cggcctcggc accgcaggtc tcggcatcgc ggacggcatc 1140

cgaagcgcgc tcatgatcga ggctggcctg acctcggagg aagtgcgcaa gctcttctgg 1200

tgcgtcgacc gccccggcct gctcacgagc gagcacgccg cggcgctccg cccggggcag 1260

gagcacttca tccgtgatgc ggaggagtgc gccgactggg agcgcgacgg cgagaagggg 1320

atctcgctcc ttgagacggt gaggagggcc aagccgacga tcatgattgg gtgctcgacg 1380

atgagcggcg cgttcaacga ggaggtcgtg agggagatgg cgaagcacgt cgagcgcccg 1440

atcatcttcc cgctgtccaa cccgaccaag ctcgccgagg ctgacccggc agatgtcaac 1500

gactggacga atggcaaggc gctcatggcg actggctcgc ccttcccgcc cgtgcgcaac 1560

ccgaacggca aggagcacca ggtcgcgatg tgcaataacg ccctcgtcta ccccggcttc 1620

ggcctcggtg ttatcatctc gcgcgcctcg cagctcaccg acaagatgat caccgcgggc 1680

gtcgctgcgc ttgccaagct cgccccggcg ctcgaggacc cggacgagtc gctcctcccg 1740

ggcctgcacg acctgcgcca catcagcgtc aaggtcgcgg tcgcggttgc gaatgcggcg 1800

aaggaggagg gtgtgagcca gatccagcgt gaggacgact acaccgagga ggaggtccgc 1860

aactaccagt gggacccggt ctaccgcccc ctcgagctcg ttgacgtctg a 1911

<210> 2

<211> 636

<212> PRT

<213> Rhodosporidium kratochvilovaeYM25235

<400> 2

MET Pro Ala Pro Thr Thr Leu Leu Arg Leu Ala Ala Arg Arg Thr Ala Pro Ala Ile Ala

10 20

Pro Arg Ala Pro Ala Ala Pro Leu Pro Thr Ala Arg Arg Phe Gln Ser Ala Ala His Gln

30 40

Glu Asn Lys Leu Arg Leu Gln Gly Lys Glu Ala Gln Glu Ala Ala Glu His Asp Thr Leu

50 60

His Glu Asn Lys Glu Tyr Leu Glu His Glu Lys Asn Leu Arg Pro Ile Trp Thr Ala Leu

70 80

Arg Gly Arg Ala Leu Leu Asn Glu Pro Ser Leu Asn Lys Gly Ala Gly Phe Thr Phe Glu

90 100

Glu Arg Asp Thr Phe Gly Leu Phe Gly Leu Leu Pro Tyr Glu Val His Ser Leu Glu Gln

110 120

Gln Cys Lys Arg Ala Tyr Ser Gln Leu Gln Glu Arg Pro Ser Ala Ile Ala Lys Tyr Thr

130 140

Phe Leu Ser Ser Leu Arg Asp Gln Asn Ile Val Leu Phe Tyr Ser Leu Cys Leu Arg Tyr

150 160

Leu Asn Glu Leu Leu Pro Val Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Glu Ala Ile Gln Lys Tyr

170 180

Ser Thr Ile Trp Arg Arg Pro Asp Gly Leu Phe Leu Ser Tyr Gln His Arg Asn Lys MET

190 200

Arg Glu MET MET Leu Gln Ala Lys Arg Pro Lys Asp Val Asp Leu Ile Val Val Thr Asp

210 220

Ser Glu Gly Ile Leu Gly Ile Gly Asp Gln Gly Val Gly Gly Ile Leu Ile Ser MET Gly

230 240

Lys Ala Asn Ile Tyr Thr Leu Gly Gly Gly Ile Asp Pro Ser Arg Ile Leu Pro Val Val

250 260

Leu Asp Val Gly Thr Asp Asn Pro Ala Leu Leu Asn Asp Pro Leu Tyr Leu Gly MET Arg

270 280

Arg Lys Arg Ile Arg Gly Pro Glu Tyr Asp Gln Phe Val Asp Ala Phe Cys Asp Phe Val

290 300

Arg Glu Glu Tyr Pro Gln Ala MET Leu His Phe Glu Asp Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly

310 320

Arg Leu Leu Gln Lys Phe Arg Pro Lys Gln Ser Cys Phe Asn Asp Asp MET Gln Gly Thr

330 340

Ala Ala Val Val Leu Ser Ala Leu Val Ser Ala Val Lys Val Thr Lys Ser Glu Leu Lys

350 360

Asp Gln Arg Ile Ile Ile Tyr Gly Leu Gly Thr Ala Gly Leu Gly Ile Ala Asp Gly Ile

370 380

Arg Ser Ala Leu MET Ile Glu Ala Gly Leu Thr Ser Glu Glu Val Arg Lys Leu Phe Trp

390 400

Cys Val Asp Arg Pro Gly Leu Leu Thr Ser Glu His Ala Ala Ala Leu Arg Pro Gly Gln

410 420

Glu His Phe Ile Arg Asp Ala Glu Glu Cys Ala Asp Trp Glu Arg Asp Gly Glu Lys Gly

430 440

Ile Ser Leu Leu Glu Thr Val Arg Arg Ala Lys Pro Thr Ile MET Ile Gly Cys Ser Thr

450 460

MET Ser Gly Ala Phe Asn Glu Glu Val Val Arg Glu MET Ala Lys His Val Glu Arg Pro

470 480

Ile Ile Phe Pro Leu Ser Asn Pro Thr Lys Leu Ala Glu Ala Asp Pro Ala Asp Val Asn

490 500

Asp Trp Thr Asn Gly Lys Ala Leu MET Ala Thr Gly Ser Pro Phe Pro Pro Val Arg Asn

510 520

Pro Asn Gly Lys Glu His Gln Val Ala MET Cys Asn Asn Ala Leu Val Tyr Pro Gly Phe

530 540

Gly Leu Gly Val Ile Ile Ser Arg Ala Ser Gln Leu Thr Asp Lys MET Ile Thr Ala Gly

550 560

Val Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ala Pro Ala Leu Glu Asp Pro Asp Glu Ser Leu Leu Pro

570 580

Gly Leu His Asp Leu Arg His Ile Ser Val Lys Val Ala Val Ala Val Ala Asn Ala Ala

590 600

Lys Glu Glu Gly Val Ser Gln Ile Gln Arg Glu Asp Asp Tyr Thr Glu Glu Glu Val Arg

610 620

Asn Tyr Gln Trp Asp Pro Val Tyr Arg Pro Leu Glu Leu Val Asp Val ***

630 636

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcccgccc cgacgacgct cctcggcgct 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcagacgtca acgagctcga gggggcggta 30

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actggatcca tgcccgcccc gacga 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgcaagctt gacgtcaacg agctcga 27

Claims (2)

1.一种苹果酸酶基因RKME2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种含有权利要求1所述的苹果酸酶基因RKME2的重组表达载体。