CN109929822A

CN109929822A - 一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用

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Publication number: CN109929822A
Application number: CN201910283495.6A
Authority: CN
Inventors: 郑建永; 钟伟超; 蓝星; 章银军; 汪钊
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN109929822B

Abstract

本发明公开了一种米曲霉脂肪酶突变体及在拆分(R,S)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯制备(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行定点饱和单突变或多突变获得的。本发明通过比较突变体酶AOL‑3^F38N、AOL‑3^F38N‑V230R和未突变酶AOL‑3的水解能力，结果发现突变体酶AOL‑3^F38N、AOL‑3^F38N‑V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍，改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好，(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯产率提高，更加适合工业化生产。

Description

一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种随机突变结合定点饱和突变获得的米曲霉脂肪酶突变体及其拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用，属于酶工程、基因工程技术领域。

(二)背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3，triacylglycerol lipase)即甘油三酯水解酶，可以作用在油水界面，能进行酯合化、酯水解、醇解、转酯等多种反应。脂肪酶广泛存在于自然界中，来源繁多，在植物、动物、微生物中均有发现。其中，产脂肪酶微生物的获得相对简单，适合进行大规模生产，有发酵周期短等优点，是工业用脂肪酶的重要来源和研究热点。产脂肪酶的微生物主要集中在根霉、曲霉、毛霉、青霉菌属等有工业应用前景的菌株。但是在传统的微生物研究中，自然界被开发利用的资源仅在1％左右，很多新型的脂肪酶还未被挖掘利用。随着研究的深入，发现很多脂肪酶具有结构选择的专一性，可以被用于手性化合物的合成和拆分，在油脂、农业、日用品、食品工业和药物合成等领域都能被应用。

米曲霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，还可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等，被美国食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)及世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为食品级安全菌株。米曲霉脂肪酶来源于米曲霉，最早在食品发酵过程中被发现，随后许多研究发现米曲霉脂肪酶在手性拆分、酯交换、酯合成方面有很大的作用。野生的米曲霉脂肪酶的产量低，催化活性、稳定性等不够理想，所以需要后期利用分子改造技术来提高。像丹麦NovoNordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商也利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。

(R)-2-(4-羟基苯氧基)乙酯((R)-EHPP)是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂(Aryloxy phenoxy propionate，简称APP)的关键手性中间体，APP类除草剂是一类能够有效防除禾本科杂草的除草剂，也是一类发展较迅速、不断开发出新品种的除草剂，迄今为止已有20个品种商品化，其中噁唑禾草灵、炔草酯、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵是近几年来同类除草剂市场全球销售额最高的几个农药产品，由于手性APP类除草剂具有安全，高效和低毒等特性，近几年来该类除草剂越来越受到大家的关注。

(三)发明内容

本发明提供了一种米曲霉脂肪酶突变体，在最适的反应条件下，水解活性有明显的提高，在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用中有更高的效率。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种米曲霉脂肪酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行单点或多点饱和定点突变获得的(优选通过易错PCR结合定点饱和突变的方法来获得突变子)。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列(米曲霉脂肪酶)的编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。

所述脂肪酶基因源自米曲霉(Aspergillus oryzae)WZ007，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M 206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申请专利(中国专利CN 101186938)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。本发明对目标脂肪酶基因进行分子改造，以提高酶的催化活性。

进一步，所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：(1)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸；(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸；(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸或脯氨酸(优选精氨酸)；(4)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸或脯氨酸(优选精氨酸)。

上述任一突变体基因同源性70％以上的核苷酸序列或其编码酶同源性80％以上的氨基酸序列均属于本发明要求保护的范围。

本发明提供一种米曲霉脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用，所述的应用方法为：以含米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的纯酶为催化剂，以(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯为底物，以pH7.5-8.0的Tris-HCl缓冲液(优选pH8.0，50mM)为反应介质构成反应体系，在30-40℃金属浴、800rpm条件下反应(优选30min)，反应结束后，转化液分离纯化，获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。所述反应体系中，纯酶用量以反应体系总体积计为50～250U/ml(优选200U/mL)，所述底物体积用量以反应体系总体积计为1～10％(优选1％)。

进一步，所述催化剂制备方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，将培养液以体积浓度1％的接种量转接到LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度0.1mM的IPTG，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，超声破碎，离心，取上清进行镍离子亲和层析，得到米曲霉脂肪酶突变体纯酶。所述超声破碎条件为：功率100W、破2s，停6s，共破碎10min。所述镍离子亲和层析方法为：取上清上样至预平衡的镍柱中，分别用含终浓度300mM NaCl的50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，目的蛋白被250mM咪唑洗脱，收集250mM咪唑的流出液，经10KDa超滤膜浓缩20倍，浓缩液即为米曲霉脂肪酶突变体纯酶。

所述含有米曲霉脂肪酶突变体基因工程菌构建方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因与载体pET28a(+)连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，挑选转化子，获得工程菌。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明构建了米曲霉脂肪酶突变体，实现了米曲霉脂肪酶水解活性提高，对(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的拆分效率分别提高了75.5％和92.8％，通过比较突变体酶AOL-3^F38N、AOL-3^F38N-V230R和未突变酶AOL-3的水解能力，结果发现突变体酶AOL-3^F38N、AOL-3^F38N-V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍，改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好，有利于后期的工业化应用。

(四)附图说明

图1脂肪酶突变体和原始脂肪酶基因AOL-3的比酶活比较。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2(wt)％，溶剂为去离子水，pH 7.0。

筛选培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，三丁酸甘油酯1(v/v)％，琼脂粉2(wt)％，溶剂为去离子水，pH 7.0。

酶活测定法：在试管中加入2.8mL磷酸盐缓冲(50mM，pH 7.0)和0.1mLp-NPA(30mM，溶于乙腈，保存于4℃棕色瓶)，40℃水浴锅中预热5min，加入0.1mL粗酶液，反应5min，加入1mL无水乙醇终止反应(用灭活的酶液代替酶液作空白对照)，测波长405nm处的吸光度值(OD₄₀₅)。酶活定义：在该测定条件下，每分钟催化产生1μmol脂肪酸所需要酶量定义为1U。

原始AOL-3酶粗酶液制备方法：将AOL-3种子液以体积浓度1％的接种量接种到LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，超声破碎10min(功率100W、破2s，停6s)，12000rpm离心10min，上清即为粗酶液，酶活为521.12U/g。

实施例1：利用随机突变构建米曲霉脂肪酶突变体文库

利用易错PCR试剂盒(该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司)在体外向米曲霉脂肪酶基因aol-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)引入核苷酸突变。

易错PCR反应条件及引物(30μL体系)：

浓度1ng/μL的米曲霉脂肪酶基因(SEQ ID NO.2)DNA模板1μL，浓度10μM的引物1F、1R各1μL，10×的易错PCR Mix 3μL，10×的易错PCR专用dNTP3μL，易错PCR专用MnCl₂ 4μL，易错PCR专用dGTP 2μL，5U/μL易错PCR专用Taq DNA聚合酶0.5μL，超纯水14.5μL。

引物1F：5’TAAGAAGGAGATATACCATGGCACATCTGGCCATTAAGAGCC 3’

引物1R：5’GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTTGGCGGCTGCAACTG 3’

引物下划线部分为同源臂，用于连接。

PCR反应条件为：预变性94℃，3min，然后进入温度循环94℃，1min；60℃，1min；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。

易错PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA。用NcoI和Xho I限制性内切酶对载体pET28a(+)进行双酶切。消化后的PCR产物以及双酶切后的载体用纯化试剂盒纯化，用一步克隆试剂盒连接(37℃，30min)。连接产物用化转的方式，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，构建突变体文库。同样条件下，构建未突变米曲霉脂肪酶基因aol-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)的转化子。

实施例2：突变体文库筛选

对实施例1得到的转化子进行如下操作：

1、突变子的挑选：将上述得到的突变子都转移到新的含100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，每一个突变子都进行标号，37℃培养一夜。

2、突变子的平板筛选：在含100μg/mL卡那霉素的筛选培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG，将标号好的突变子点到筛选平板上，并且保证编号一一对应。在37℃培养箱中培养24h-48h。期间观察是否产生水解圈以及水解圈的大小情况。

3、突变子的复筛：将初筛得到的水解圈较大的突变子转接到LB液体培养基中，37℃培养10h，将培养液以体积浓度1％的接种量转接到LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度0.1mM的IPTG，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，得到的菌体进行超声破碎10min(破3s，停6s，功率100W)，12000rpm离心10min，上清即为粗酶液，以p-NPA为底物测定水解活性，以未突变米曲霉脂肪酶基因aol-3(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)的转化子的水解活性为对照。从100多个突变子中挑选水解圈最大的菌落，将该阳性突变子送去测序，测序结果与SEQ ID NO.2的序列进行比对，得到突变的碱基以及突变位点。复筛发现SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位苯丙氨酸突变为亮氨酸的突变菌株酶活有提高。

4、定点饱和突变：在第一轮随机突变后筛选出来的酶活提高最高的菌株基础上，将对突变位点进行饱和突变。设计定点饱和突变的引物2：

NNK-38-F:5’GCCCCTCTGAATGAANNKCTGAGCGCACTGCTG 3’

NNK-38-R:5’CAGCAGTGCGCTCAGMNNTTCATTCAGAGGGGC 3’

提取第一轮易错PCR筛选出的突变子的质粒为定点饱和突变的模板，进行定点饱和突变。PCR产物进行消化，纯化后，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建突变文库。按照上述初筛、复筛的过程，初筛共筛选到19株菌株，复筛发现有8株酶活明显提高的突变菌(SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸)，酶活分别提高了104.37％，115.02％，207.06％，71.08％，110.63％，139.12％，200.13％，11.53％，其他11株菌株酶活下降，其中AOL-3^F38N(SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺)的酶活提高最多，为原始菌的3.4倍。

5、第二轮随机突变和定点饱和突变：提取第一轮最终筛选出来的AOL-3^F38N的质粒为模板，进行第二轮易错PCR，并用与第一轮同样的方法和顺序进行筛选。发现96位，104位，134位突变的酶活都比原始菌株低，230位突变的有酶活提高，因此在原始米曲霉脂肪酶AOL-3和在突变菌AOL-3^F38N基础上对230位进行定点饱和突变，设计定点饱和突变的引物3：

NNK230F:5’ATCTGCAACAACAGCNNKGTGATCCTGCCGCCG 3’

NNK230R:5’CGGCGGCAGGATCACMNNGCTGTTGTTGCAGAT 3’

用同样的方法筛选，共筛选到了11株和13株，其中在AOL-3的基础上进行定点饱和突变的有5株的酶活有提高(SEQ ID NO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸)，粗酶液的比酶活分别为1571.31U/g，1619.44U/g，1315.36U/g，857.52U/g，1653.17U/g；在AOL-3^F38N基础上进行突变的有2株酶活提高(SEQID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸)，粗酶液的比酶活分别为2491.44U/g和2160.8U/g，其中突变菌AOL-3^F38N-V230R(SEQ ID NO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为精氨酸)的酶活提高最多，为原始米曲霉脂肪酶的4倍左右。

实施例3：高产米曲霉脂肪酶生产菌株的验证和纯化

分别将实施例2中突变菌AOL-3^F38N和突变菌AOL-3^F38N-V230R接种在LB液体培养基中，37℃培养10h，培养液以体积浓度1％的接种量接种到LB培养基中，37℃培养至菌体长到OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，28℃下继续培养12h，离心收集菌体细胞，用pH 7.5磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎10min(功率100W，破2s，停6s)，上清即为突变株AOL-3^F38N和AOL-3^F38N-V230R的酶液。按照按照GE公司25mL镍离子亲和层析填料以及AKAT纯化仪的使用说明，取上清上样至预平衡的镍柱中，再依次用含300mM NaCl的50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成的5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白。其中目的蛋白用250mM咪唑洗脱得到，所得的洗脱液经10KDa超滤膜浓缩20倍，浓缩液即为米曲霉脂肪酶突变体纯酶，于-20℃低温保藏。同样条件下，制备原始AOL-3纯酶。利用酶活检测方法，测得比酶活分别为159.48U/mg和186.81U/mg，分别是原始AOL-3的3.4倍和4倍左右，见图1。

实施例4：突变体AOL-3^F38N-V230R在催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用

以实施例3方法获得的原始米曲霉脂肪酶AOL-3及其突变体AOL-3^F38N-V230R纯酶为催化剂，拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。在2mL离心管中加入980μL Tris-HCl缓冲液(pH8.0，50mM)、10μL(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，混合后再加10μL(50U)纯酶构成反应体系，30℃金属浴、800rpm转速条件下反应30min，加入1mL乙酸乙酯萃取，用无水Na₂SO₄除水后，以手性气相色谱检测(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。气相色谱检测条件：色谱柱BGB-174(30m×0.32mm，0.25μm)、载气(N₂)流速2.0mL/min；进样口温度220℃，分流比50:1；进样量1μL；柱箱温度先120℃保持2min，再以5℃/min的速率升温到200℃保持2min；采用氢离子火焰检测器，检测器温度250℃。结果表明，米曲霉脂肪酶能高效拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯光学纯度99.8％以上。在酶液添加量相同，反应时间相等的情况下，相较于原始脂肪酶基因的工程菌株的转化率26.3％，突变酶AOL-3^F38N转化率提高到46.2％，突变酶AOL-3^F38N-V230R的转化率提高到50.9％。因此突变酶AOL-3^F38N和AOL-3^F38N-V230R比原始脂肪酶催化效率分别提高了75.5％和92.8％。。

表1结果表明，突变酶AOL-3^F38N-V230R纯酶添加量为1％(50U)，反应时间都为2h的情况下，最高8％的(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯能反应完全，转化率和e.e._S分别为50.2％和99.4％。而10％的(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯在反应2h后转化率降为37.5％。并且整个反应过程中产物光学纯度都在99％以上。

表1：突变脂肪酶AOL-3^F38N-V230R催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 255

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 1

Met Ala His Leu Ala Ile Lys Ser Leu Phe Val Ser Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ser Pro Leu Pro Ser Asn Ala Leu Val Glu Arg Asn

20 25 30

Ala Pro Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Leu Leu Ser His Leu Pro Ala

35 40 45

Ile Asp Gly Thr Ile Asp Ala Val Ser Gly Val Ile Thr Asp Phe Asp

50 55 60

Gln Leu Leu Ala Asp Leu Thr Gly Ala Arg Thr Thr Gln Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Ile Gly Val Cys Thr Asp Tyr Thr Val Leu Phe Ala Arg Gly Thr Ser

85 90 95

Glu Pro Gly Asn Val Gly Val Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser Glu Ala

100 105 110

Phe Glu Gln Ala Val Gly Ala Lys Ala Leu Ser Phe Gln Gly Val Asn

115 120 125

Gly Tyr Asn Ala Asp Val Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Gly Asp Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Lys Ser Met Ala Ser Leu Ala Gly Glu Val Leu Ser Lys Cys

145 150 155 160

Pro Asp Thr Lys Leu Val Met Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Cys Gln Ile

165 170 175

Val His Asn Ala Val Glu Gln Leu Pro Ala Ala Asp Ala Ser Lys Ile

180 185 190

Ser Ser Val Leu Leu Phe Gly Asp Pro Tyr Ala Gly Lys Ala Phe Pro

195 200 205

Asn Val Asp Ala Ser Arg Val His Thr Val Cys His Ala Gly Asp Thr

210 215 220

Ile Cys Asn Asn Ser Val Val Ile Leu Pro Pro His Leu Thr Tyr Ala

225 230 235 240

Val Asp Val Pro Gly Ala Val Gln Phe Ala Val Ala Ala Ala Asn

245 250 255

<210> 2

<211> 765

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 2

atggcacatc tggccattaa gagcctgttt gtgagcctgc tgggcgcaag tgtgctggca 60

agtccgctgc cgagtaatgc actggtggaa cgcaatgccc ctctgaatga attcctgagc 120

gcactgctga gccatctgcc ggccattgat ggtaccatcg atgccgtgag cggcgttatt 180

accgatttcg atcagctgct ggccgatctg accggtgccc gtacaacaca gaacggctac 240

atcggcgttt gcaccgacta taccgttctg tttgcacgtg gcaccagcga accgggcaat 300

gtgggtgttc tggtgggtcc gccgctgagt gaagcctttg aacaagccgt gggcgcaaaa 360

gccctgagct ttcagggtgt gaacggctac aatgccgatg ttgccggcta tctggcaggt 420

ggtgatgccg caggtagcaa aagcatggca agcctggccg gcgaagttct gagcaaatgc 480

ccggacacca agctggtgat gagcggctat agccagggct gccagattgt gcacaacgca 540

gtggaacagc tgcctgccgc cgatgccagc aaaattagca gcgtgctgct gttcggcgat 600

ccgtatgccg gcaaagcatt tccgaatgtg gatgccagcc gtgtgcatac cgtttgccat 660

gccggtgata ccatctgcaa caacagcgtg gtgatcctgc cgccgcacct gacctatgcc 720

gttgacgtgc cgggtgcagt gcagttcgca gttgcagccg ccaac 765

Claims

1.一种米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或230位进行单点突变或多点饱和定点突变获得的。

2.如权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：(1)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸；(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸；(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸；(4)SEQ IDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸。

3.如权利要求2所述米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为天冬酰胺；SEQ ID NO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺同时第230位的颉氨酸突变为精氨酸。

4.一种权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的纯酶为催化剂，以(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯为底物，以pH7.5-8.0的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-40℃金属浴、800rpm条件下反应，反应结束后，转化液分离纯化，获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，纯酶用量以反应体系总体积计为50～250U/ml，所述底物体积用量以反应体系总体积计为1～10％。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂制备方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，将培养液以体积浓度1％的接种量转接到LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，超声破碎，离心，取上清进行镍离子亲和层析，得到米曲霉脂肪酶突变体纯酶。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：功率100W、破2s，停6s，共破碎10min。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述镍离子亲和层析方法为：取上清上样至预平衡的镍柱中，分别用含300mM NaCl的50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成的5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，收集250mM咪唑的流出液，经10KDa的超滤膜浓缩20倍，浓缩液即为米曲霉脂肪酶突变体纯酶。