CN104152505B - 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-l-异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用重组菌株转化制备4‑羟基‑L‑异亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过筛选获得了一株有异亮氨酸双加氧酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373，克隆了其异亮氨酸双加氧酶基因ido，然后构建带有目的基因的重组菌株，通过重组菌催化转化底物L‑异亮氨酸得到4‑羟基‑L‑异亮氨酸。本发明得到了双加氧酶基因，且为4‑羟基‑L‑异亮氨酸的获得提供了有效途径，对于今后生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法，具体涉及一种微生物异亮氨酸双加氧酶及其重组菌转化合成羟基异亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
4-羟基-L-异亮氨酸（4-HIL）的化学结构为：
4-羟基-L-异亮氨酸是一种新型胰岛素分泌促进剂，可用于治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇，因此开发生物催化转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法的研究极有意义。
目前医药领域中用的4-羟基-L-异亮氨酸主要是从植物葫芦巴种子中提取得到的，而关于4-HIL的合成方法则有以下相关报道。
Wang等研究了一种有效的八步合成4-羟基-L-异亮氨酸的方法，其转化总产率为39%，该方法的关键步骤是利用Geotrichum candidum生物转化2-甲基乙酰乙酸乙酯生成(2S,3R)-2-甲基-3-羟基丁酸已酯，接着将上述反应的产物做不对称斯特雷克尔合成(是一种从α-氨基腈制备α-氨基酸的合成法)。
Rolland-Fulcrand等研究了有六个步骤完全控制立体化学酶合成4-羟基-L-异亮氨酸的方法，该方法最后一步是利用商业化应用的固定化青霉素酰化酶G酶解拆分N-苯乙酰内酯衍生物。
Smirnov等利用4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸盐醛缩酶和支链氨基酸氨基转移酶的双酶偶联，经过两步反应将乙醛、α-酮基丁酸盐和L-谷氨酸转化生成4-羟基-L-异亮氨酸。
Haefele等发现在葫芦巴种子中4-羟基-L-异亮氨酸的合成过程中有双加氧酶，当有Fe2+、α-酮戊二酸、抗坏血酸和氧气存在时，该酶可一步催化合成4-羟基-L-异亮氨酸。
Kodera等从Bacillus thuringiensis中发现了可一步催化合成4-羟基-L-异亮氨酸的L-异亮氨酸双加氧酶，即L-异亮氨酸羟基化酶，探索该酶催化合成4-羟基-L-异亮氨酸的路线，即，L-异亮氨酸双加氧酶催化底物L-异亮氨酸发生羟基化，生成4-羟基-L-异亮氨酸。
合成4-羟基-L-异亮氨酸的新型路径如下：
Ogawa等筛选得到了一株产L-异亮氨酸双加氧酶的苏云金芽孢杆菌，并对该菌中L-异亮氨酸双加氧酶的酶学性质和生物转化代谢过程进行了研究，进而将L-异亮氨酸双加氧酶基因ido克隆到E. coli中进行表达，并从基因水平对表达进行了调控，最终使得L-异亮氨酸双加氧酶催化L-异亮氨酸生产4-羟基-L-异亮氨酸的产率最高达82%。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选L-异亮氨酸双加氧酶的方法，以及含L-异亮氨酸双加氧酶基因重组大肠杆菌全细胞催化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法。
本发明目的不仅仅在于筛选获得L-异亮氨酸双加氧酶，并将其基因克隆表达，构架重组大肠杆菌，该重组菌株应用于全细胞转化L-异亮氨酸制备4-羟基-L-异亮氨酸的反应中，以获得单一产物4-羟基-L-异亮氨酸。
本发明的技术方案：
一、出发菌株的获得：
酶标显色筛选方法：接种针挑取芽孢杆菌单菌落接种到含500 μL发酵培养基（可溶性淀粉4 g/L，酵母提取物4 g/L，麦芽提取物10 g/L，L-异亮氨酸2 g/L，pH 7.0）的96孔酶标板中，37℃、200 rpm振荡培养2 d，然后加入500 μL溶有15 mM氯苯的发酵培养基，用膜包住板，于37℃、200 rpm振荡培养，12h后将板离心，取上清100 μL加入到酶标板孔中，再加入100 μL 0.1 mM HCl，将酶标板于37℃静置30 min，然后分别加入20 μL 1 mM Tris-HCl(pH 8.5)和25 μL 0.4% Gibbs试剂（吉布斯试剂）的乙醇溶液，于室温下反应40 min后，用酶标仪检测在652 nm下的吸光度值。
薄层层析方法：将筛到的芽孢杆菌接种到96孔板中的1 mL发酵培养基中，28℃、200 rpm振荡培养2 d，培养液离心，取上清0.5 μL，分两次点样，进行层析。展开剂各成分体积比例是，正丁醇:醋酸:水= 4:1:0.5；显色剂为0.3%茚三酮(溶于展开剂中)。
以筛选现象最明显的菌株作为出发菌株，出发菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373。
二、4-羟基-L-异亮氨酸的制备：
（1）基因ido的获得：
LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。
将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373接种于50 mL LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养24 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)（碧云天公司）提取基因组。
根据已报道的L-异亮氨酸双加氧酶基因 (GenBank Accession No.KC884243.1)，在NCBI上BLAST后，根据相关基因的同源性设计了以下简并引物：引物1：5'-CATGCCATGG AAATGARTGG STTTAGCA-3' (其中R=A/G，S=C/G)，引物2：5'-ACGCGTCGACTTTTGTCTCC TTATAAGAAA ATGT-3'。引物1含有NcoI 限制性酶切位点，引物2含有SalI 限制性酶切位点。
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5μL，引物1 (50 pmol/μL) 1 μL，引物2 (50 pmol/μL) 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNApolymerase (5 U/μL) 0.5 μL。
PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min。
用PCR纯化试剂盒(Bioer Technology Co. Ltd)纯化DNA片段。
DNA片段与pMD19-T连接：将外源基因与质粒pMD19-T连接，反应体系组成如下：质粒pMD19-T 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH2O将体系补足10 μL。混合连接液，将其置于16℃下连接4h。
连接后的产物转化至E. coli JM109感受态细胞中，得到的阳性质粒pMD19-T-ido的基因测序工作由上海生工生物工程公司完成。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373 L-异亮氨酸双加氧酶基因ido，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。
根据上述测序结果，设计以下表达引物：
引物3：5'-CATGCCATGG AAATGAAAAT GAGTGG-3'，
引物4：5'-ACGCGTCGAC TTATTTTGTC TCCTTATAAG-3'，
引物3含有NcoI 限制性酶切位点，引物4含有SalI 限制性酶切位点。
利用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek)从克隆大肠杆菌中提取质粒pMD19-T-ido。
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5μL，引物1 (50 pmol/μL) 1 μL，引物2 (50 pmol/μL) 1 μL，pMD19-T-ido 5 μL，Taq DNApolymerase (5 U/μL) 0.5 μL。
PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min。
用PCR纯化试剂盒(Bioer Technology Co. Ltd)纯化目的基因ido片段，保藏备用。
（2）重组质粒的构建：
目的基因及质粒pET28a的酶切：
按照水、缓冲液、PCR产物、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴4h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。
反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NcoI 2 μL，SalI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
目的基因与质粒pET28a的连接：
将外源基因与质粒pET28a连接，反应体系组成如下：质粒pET28a 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH2O将体系补足10 μL。混合连接液，将其置于16℃下连接12-16 h，获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a-ido。
（3）重组菌株的构建：
在每管的100 μL E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中，冷却2 min。每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡纳抗生素的LB平板上，37℃倒置培养。
诱导表达培养：
LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。筛选目的重组菌株E. coli BL21(DE3)( pET28a-ido)。
（4）4-羟基-L-异亮氨酸的制备：利用重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3) (pET28a-ido)，催化反应：
LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，卡纳抗生素0.050，固体培养基添加琼脂粉15；
挑取重组菌E. coli BL21(DE3) ( pET28a-ido)单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜；将1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.5 mM，在培养温度30℃下诱导培养10~12 h；
培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集细胞，用50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液悬浮成10%细胞浓度，30℃振荡温育过夜。
以L-异亮氨酸为底物，进行微生物细胞的催化转化反应：2mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 6.0~9.0中，细胞浓度为20%~50%，底物浓度为10~50 mmol/L，α-酮戊二酸的浓度为10~50 mmol/L，FeSO4·7H2O的浓度为0.5~2 mmol/L，抗坏血酸的浓度为5~20 mmol/L，反应温度28℃，反应时间10-24h。
反应结束后，将反应混合物离心，取250 μL上清转移到5 mL离心管中，加入250 μL0.2 M硼酸缓冲液(pH 9.2)，再加入500 μL 2倍过量的芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)乙腈溶液，待衍生化反应完成后加入500 μL与Fmoc-Cl相同浓度的2-氨基金刚烷(ADAM)的乙腈/水(1︰1，V/V)溶液，阻止过量的Fmoc-Cl水解。溶液用0.22 μm的有机膜过滤后用HPLC检测，条件为Diomansil C18柱(250 mm * 4.6 mm)，流速1.0 mL/min，紫外检测器263 nm，流动相A：50mM 的NaAc-HAc 缓冲体系，pH 4.2，流动相B：乙腈。采用50︰50等度洗脱。
转化后得到产物4-羟基-L-异亮氨酸。
本发明的有益效果：本发明成功筛选获得了一株有L-异亮氨酸双加氧酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373，克隆了其异亮氨酸双加氧酶基因ido，该基因全长723 bp，编码240个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。
将基因ido插入表达载体pET28a中并转化入相应表达宿主E. coli BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株E. coli BL21(DE3)( pET-28a-ido)。
重组菌E. coli BL21(DE3)( pET-28a-ido)全细胞催化转化L-异亮氨酸在反应10h，底物L-异亮氨酸浓度已接近为0 mM，反应体系在pH7.5环境中有利于转化进行，利用温育过夜的菌体来转化反应，效果较好。
通过优化反应体系和反应条件，在30℃过夜温育20%菌体细胞的pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入10 mM底物L-异亮氨酸，10 mM α-酮戊二酸，0.5mM FeSO4·7H2O，10 mM抗坏血酸，催化转化24h，最终可得到产率85%的产物4-羟基-L-异亮氨酸，见实施例18。
本发明得到了双加氧酶基因，且为4-羟基-L-异亮氨酸的获得提供了有效途径，对于今后生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
生物材料样品保藏：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2013373，保藏日期2013年8月8日。
具体实施方式
实施例1诱导表达培养：
LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。在培养温度30℃下进行诱导培养。
实施例2诱导表达培养：
LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 0.5 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养。
实施例3诱导表达培养：
LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 1 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养。
实施例4诱导表达培养：
LB培养基组成同实施例1。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 0.5 mmol/L，在培养温度25℃下进行诱导培养。
实施例5诱导表达培养：
LB培养基组成同实施例1。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 0.5 mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养。
实施例6诱导表达培养：
LB培养基组成同实施例1。
挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 0.5 mmol/L，在培养温度37℃下进行诱导培养。
实施例7
生物转化反应体系为质量浓度20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 6.0 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率74.6%。
实施例8
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.0 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率75.1%。
实施例9
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率79.8%。
实施例10
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 8.0 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率75.4%。
实施例11
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 8.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率57.5%。
实施例12
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 9.0 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率57.4%。
实施例13
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在20℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率51.1%。
实施例14
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在25℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率53.8%。
实施例15
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率45.2%。
实施例16
生物转化反应体系为20%的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10 mmol∙L-1 抗坏血酸，50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液，混匀后在37℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率35.5%。
实施例17
生物转化反应体系为20%的用50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液20℃温育过夜的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10mmol∙L-1 抗坏血酸，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率79.0%。
实施例18
生物转化反应体系为20%的用50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液30℃温育过夜的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10mmol∙L-1 抗坏血酸，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率85.0%。
实施例19
生物转化反应体系为20%的用50 mmol∙L-1 pH 7.5 的Tris-HCl缓冲液37℃温育过夜的菌体细胞，10 mmol∙L-1 L-Ile底物，10 mmol∙L-1 α-KG，0.5 mmol∙L-1 FeSO4·7H2O，10mmol∙L-1 抗坏血酸，混匀后在28℃恒温摇床上振荡反应24h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用HPLC检测，产物4-羟基-L-异亮氨酸的产率13.1%。
<210>SEQ ID NO: 1
<211>723
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CCTCC NO：M2013373
<214>
atgaaaatga gtggctttag catagaagaa aaggtacatg aatttgaatc taaagggttt 60
cttgaaatct caaatgaaat ctttttacaa gaggaagaga atcatagttt attaacacaa 120
gcacagttag attattataa tttggaagat gatgcgtacg gtgaatgccg tgctagatct 180
tattcaaggt atataaagta tgttgattca ccagattata ttttagataa tagtaatgat 240
tacttccaat ctaaagaata taactatgat gatggcggga aagttagaca gttcaatagc 300
ataaatgata gctttttatg taatccttta attcaaaata tcgtgcgttt cgatactgag 360
tttgcattta aaacaaatat aatagataaa agtaaagatt taattatagg cttacatcaa 420
gtaagatata aagctactaa agaaagacca tcttttagtt cacctatttg gttacataaa 480
gatgatgaac cagtagtatt tttacacctt atgaatttaa gtaatacagc tatcggcgga 540
gataatttaa tagctaattc tcctcgggaa attaatcagt ttataagttt gaaggagcct 600
ttagaaactt tagtatttgg acaaaaggtc ttccatgccg taacgccact tggaacagaa 660
tgtagtacgg aggcttttcg tgatatttta ttagtaacat tttcttataa ggagacaaaa 720
taa 723
<210>SEQ ID NO: 2
<211>240
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CCTCC NO：M2013373
<400>1
Met Lys Met Ser Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Val His Glu Phe
1 5 10 15
Glu Ser Lys Gly Phe Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Phe Leu Gln
20 25 30
Glu Glu Glu Asn His Ser Leu Leu Thr Gln Ala Gln Leu Asp Tyr
35 40 45
Tyr Asn Leu Glu Asp Asp Ala Tyr Gly Glu Cys Arg Ala Arg Ser
50 55 60
Tyr Ser Arg Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Ser Pro Asp Tyr Ile Leu
65 70 75
Asp Asn Ser Asn Asp Tyr Phe Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp
80 85 90
Asp Gly Gly Lys Val Arg Gln Phe Asn Ser Ile Asn Asp Ser Phe
95 100 105
Leu Cys Asn Pro Leu Ile Gln Asn Ile Val Arg Phe Asp Thr Glu
110 115 120
Phe Ala Phe Lys Thr Asn Ile Ile Asp Lys Ser Lys Asp Leu Ile
125 130 135
Ile Gly Leu His Gln Val Arg Tyr Lys Ala Thr Lys Glu Arg Pro
140 145 150
Ser Phe Ser Ser Pro Ile Trp Leu His Lys Asp Asp Glu Pro Val
155 160 165
Val Phe Leu His Leu Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala Ile Gly Gly
170 175 180
Asp Asn Leu Ile Ala Asn Ser Pro Arg Glu Ile Asn Gln Phe Ile
185 190 195
Ser Leu Lys Glu Pro Leu Glu Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys Val
200 205 210
Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly Thr Glu Cys Ser Thr Glu Ala
215 220 225
Phe Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Thr Lys
230 235 240
***
Claims (1)
1.一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法，其特征在于步骤为：
（1）基因ido的获得：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-1为出发菌株提取基因组，所述BS-1为保藏号CCTCC NO：M 2013373的枯草芽孢杆菌；根据相关基因的同源性设计了以下简并引物：
含有NcoI 限制性酶切位点的引物1：
5'-CATGCCATGG AAATGARTGG STTTAGCA-3'，其中R=A/G，S=C/G；
含有SalI 限制性酶切位点的引物2：
5'-ACGCGTCGAC TTTTGTCTCC TTATAAGAAA ATGT-3'；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1为1 μL，50 pmol/μL的引物2为1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的 TaqDNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min；
用PCR纯化试剂盒纯化DNA片段；将外源基因与质粒pMD19-T连接，反应体系组成如下：质粒pMD19-T 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合连接液，将其置于16℃下连接4h；连接后的产物转化至E. coli JM109感受态细胞中，得到阳性质粒pMD19-T-ido，基因测序；
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373 L-异亮氨酸双加氧酶基因ido，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2；
根据测序结果，设计以下表达引物：
含有NcoI 限制性酶切位点的引物3：
5'-CATGCCATGG AAATGAAAAT GAGTGG-3'，
含有SalI 限制性酶切位点引物4：
5'-ACGCGTCGAC TTATTTTGTC TCCTTATAAG-3'；
利用质粒提取试剂盒从克隆大肠杆菌中提取质粒pMD19-T-ido；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，50pmol/μL的引物1为1 μL，50 pmol/μL的引物2为1 μL，pMD19-T-ido 5 μL，5 U/μL 的TaqDNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min；
用PCR纯化试剂盒Bioer Technology Co. Ltd纯化目的基因ido片段，保藏备用；
（2）重组质粒的构建：利用限制性内切酶NcoI 和SalI对扩增得到的ido基因与载体pET28a进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a-ido；
（3）重组菌株的构建：重组质粒pET28a-ido转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，通过含有50μg/mL的卡纳抗生素的LB平板筛选目的重组菌株E. coli BL21(DE3) (pET28a-ido)；
（4）4-羟基-L-异亮氨酸的制备：利用重组菌株E. coli BL21(DE3) ( pET28a-ido)，经过菌体的培养，以L-异亮氨酸为底物，进行微生物细胞的催化转化反应：2mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 6.0~9.0中，菌体细胞浓度为20%~50%，底物浓度为10~50 mmol/L，α-酮戊二酸的浓度为10~50 mmol/L，FeSO4·7H2O的浓度为0.5~2 mmol/L，抗坏血酸的浓度为5~20 mmol/L，反应温度28℃，反应时间10-24h；反应完成后混合物离心取上清液，即得4-羟基-L-异亮氨酸。
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