CN109402182A - 一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 - Google Patents

一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建含有重组质粒pET‑28a‑ydiI的大肠杆菌工程菌；(2)取含有重组质粒pET‑28a‑ydiI的大肠杆菌工程菌，制备诱导细胞；(3)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10‑羟基癸酸，制备10‑羟基‑2‑癸烯酸；本发明首次公开了利用基因工程改造的含有硫酯酶的阳性重组大肠杆菌，经过特殊诱导处理后，可以通过静息细胞发酵生产10‑羟基‑2‑癸烯酸，实现了10‑羟基‑2‑癸烯酸的大量生物合成。

Description

一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的 方法
技术领域
本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C10H18O3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：
鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。10-HDA的结构式如下：
目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。
中国专利文献CN108265041A(申请号201810230833.5)公开了一种小分子硫酯酶的表达方法及应用，具体涉及一种小分子蛋白硫酯酶在大肠杆菌中的重组表达及其在生产一种10-羟基-2-癸烯酸中间产物反式-2-癸烯酸中的应用。该发明将大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI连接到含有sumo标签的pET-28a质粒上，转入大肠杆菌BL21(DE3)，利用重组大肠杆菌(含pET-28a-ydiI)，通过无细胞体系生产反式-2-癸烯酸。但利用生物发酵方法生产10-羟基-2-癸烯酸的相关技术未见报道。
静息细胞是一种处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长的处于特殊状态的细胞。静息细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长整个细胞通过提供一个安全的细胞室和最佳的环境条件，使其具有较高的及酶合成的抑制。静息细胞为不能独立发挥作用的酶的生物催化提供了可能，此外，还可以保证酶的稳定性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：
(1)构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌；
(2)取步骤(1)制得的含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，接入含有抗生素的液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD600为0.8～1.2时，降温至14～20℃适应0.5～2小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5～0.8mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞；
(3)将步骤(2)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10-羟基癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下，制得10-羟基-2-癸烯酸；
所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：
甘油0.8～1.2％,葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，步骤如下：
(i)以大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)将步骤(i)扩增的ydiI基因片段和含有sumo标签的质粒pET-28a用BamH I和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接得含有sumo标签的重组质粒pET-28a-ydiI；
(iii)将步骤(ii)的重组质粒pET-28a-ydiI转入大肠杆菌BL21DE(3)，筛选阳性重组大肠杆菌，诱导表达得融合型硫酯酶；
根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增体系为：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL Hifi酶12.5μL，ddH2O 9.5μL，共25μL。
根据本发明进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
根据本发明进一步优选的，步骤(iii)中筛选阳性菌株的方法为：采用菌落PCR鉴定和蛋白表达及可溶性鉴定，将鉴定结果为阳性的菌株再进行测序鉴定。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，液体培养基为LB液体培养基，抗生素为卡那霉素，卡那霉素浓度为50μg/mL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，诱导培养条件为降温至16℃适应1小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.64mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，继续诱导培养12小时，制得诱导细胞；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min,收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％盐水洗涤沉淀。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，转化培养条件为在25～35℃条件下培养20小时。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，转化培养基组份如下，均为质量百分比：
甘油1％,葡萄糖0.4％,抗生素50μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，10-羟基癸酸在培养基中的浓度为8g/L。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜。
有益效果
1、本发明首次公开了利用基因工程改造的含有硫酯酶的阳性重组大肠杆菌，经过特殊诱导处理后，可以通过静息细胞发酵生产10-羟基-2-癸烯酸，实现了10-羟基-2-癸烯酸的生物合成；
2、本发明通过优化转化培养基，可以显著提高10-羟基-2-癸烯酸的转化率，从而实现10-羟基-2-癸烯酸的工业化生产。
附图说明
图1：大肠杆菌硫脂酶质粒构建图；
图2为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图中，泳道M为Marker；泳道1-6均为硫酯酶基因ydiI的PCR扩增产物样品；
图3为菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道M为Marker；泳道1-8为挑取的不同的单菌落PCR扩增产物样品；
图4为融合蛋白表达产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)图；
其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为含sumo标签的pET-28a-ydiI重组质粒蛋白表达产物；
图5为不同底物浓度下反应20h产物气相色谱图；
数据1是0.03125g/L的10-HDA标样图、数据2是以1g/L10-羟基癸酸为底物反应20h样品图、数据3是以2g/L10-羟基癸酸为底物反应20h样品图、数据4是以4g/L10-羟基癸酸为底物反应20h样品图，数1据5是以8g/L0-羟基癸酸为底物反应20h样品图、数据6是对照(未加底物的工程菌)。
图6为不同底物浓度下10-HDA产量柱形图；
图7为不同反应时间产物气相色谱图；
数据6是以4g/L10-羟基癸酸为底物反应20h样品图、数据5以4g/L10-羟基癸酸为底物反应12h样品图、数据1是0.03125g/L的10-HDA标样图、数据4是以4g/L10-羟基癸酸为底物反应8h样品图、数据3是以4/L10-羟基癸酸为底物反应4h样品图，数据2是以4g/L10-羟基癸酸为底物反应2h样品图、数据7是对照(未加底物的工程菌)。
图8为不同时间10-HDA产量变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步阐述，但本发明保护内容并不仅局限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。
实施例1：大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的PCR扩增
根据大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI设计PCR扩增引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
其中，大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
使用上述引物进行PCR扩增，反应体系如下：
PCR反应条件如下：
PCR产物回收：
PCR扩增结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图2所示，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工生物工程股份有限公司的DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
实施例2：重组质粒pET-28a-ydiI的构建
实施例1中回收的PCR产物及含有sumo标签的pET-28a质粒载体的双酶切反应，反应体系如下：
反应条件：37℃反应1.5h。
PCR产物和质粒载体双酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用DNA胶回收试剂盒进行目的片段回收。
将经过酶切的PCR产物与同样经过酶切的质粒载体连接，连接反应体系如下：
将上述连接反应体系充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃连接过夜，得重组质粒pET-28a-ydiI。
实施例3：重组质粒pET-28a-ydiI的转化：
(1)感受态细胞的制备
①挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基，37℃、210rpm过夜培养；
②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37℃、210rpm培养至菌液OD600为0.375左右；
③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；
④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；
⑤每个离心管中加入10mL预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬菌体，再加入30mL预冷的0.1MCaCl2溶液，颠倒混匀，冰上静置20min；
⑥4℃，3700rpm离心10min收集菌体，按照与步骤④中菌液的体积比为3：125的比例加入预冷的含有15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，重悬菌体，得感受态细胞；
⑦将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。
(2)重组质粒的转化
①将10μL重组质粒pET-28a-ydiI加入到100μL新鲜制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；
②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min；
③将上述感受态细胞接入到500μL LB培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；
④取上述菌液200μL，涂布于带有50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基；
⑤37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。
(3)阳性克隆的鉴定：
①菌落PCR鉴定
挑取上述培养出的单菌落至1mL含有卡那霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h，吸取1μL菌液，按照20μL PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定，由于酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI为大肠杆菌基因，故菌落PCR验证卡那霉素抗性基因，鉴定结果如图3所示，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆。
②蛋白表达及可溶性鉴定
取上述菌液900μL，并加入终浓度为0.64mM的IPTG，诱导表达4h，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2倍上样缓冲液，重悬菌体，100℃水浴变性10min，用SDS-PAGE检测蛋白表达，结果如图4所示，显示为阳性克隆。
③菌样测序
将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。
实施例4：小分子硫酯酶的应用
(1)菌种活化：将实施例3中的阳性重组大肠杆菌以1％的接种量接种至50mL的含有卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；
(2)菌体转接：取上述活化菌株1mL接入100mL含有卡那霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为1.0时，降温至16℃适应1小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.64mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，过夜诱导培养；
(3)收集菌体：取上述菌液500mL，5000rpm，4℃离心15min，收集菌体；
(4)用0.85％生理盐水洗涤沉淀三次，并用转化培养基重悬菌体制备菌悬液(50gcwwl-1)。转化培养基包含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，1％的甘油，0.4％的葡萄糖，50μg/mL的卡那抗生素，分别加入1g/L，2g/L，4g/L，8g/L的10-羟基癸酸进行反应，未加10-羟基癸酸的为对照组。30℃反应20h并在0，4，8，12h补加0.4％葡萄糖，1％的甘油。
发酵液硅烷化处理：取2mL发酵液于具塞试管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋离心，有机相收集到新管中，加入150uL N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺振荡混匀，70℃水浴15min后备用。
气相色谱检测生成产物：气相色谱以氮气为载气，恒流模式，进样体积1μl，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。产物的色谱图如图5所示。
实施例5：静息细胞的制备及利用静息细胞生产10-羟基-2-癸烯酸
(1)菌种活化：将实施例3中的阳性重组大肠杆菌以1％的接种量接种至50mL的含有卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；
(2)菌体转接：取上述活化菌株5mL接入500mL含有卡那霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为1.0时，降温至16℃适应1小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.64mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，过夜诱导培养；
(3)收集菌体：取上述菌液500mL，5000rpm，4℃离心15min，收集菌体；
(4)用质量百分比浓度为0.85％生理盐水洗涤沉淀三次，并用转化培养基重悬菌体制备菌悬液(50gcwwl-1)。转化培养基包含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，1％的甘油,0.4％的葡萄糖,50μg/mL的卡那抗生素，加入4g/L的底物在30℃开启反应，未加10-羟基癸酸的为对照组。在0,4,8,12h补加0.4％葡萄糖，1％的甘油，并在2,4,8,12,20h取样2mL；
(5)样品处理：向样品中加入200μl的浓盐酸终止反应，加入1mL乙酸乙酯，涡旋离心，有机相收集到新管中，加入150μL N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺振荡混匀，70℃水浴15min后备用。
气相色谱检测生成产物：气相色谱以氮气为载气，恒流模式，进样体积1μl，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。在不同时间的产物色谱图如图7所示。
经检测，在10-羟基癸酸浓度为1g/L时，10-HAD浓度为0.0203g/L，在10-羟基癸酸浓度为2g/L时，10-HAD浓度为0.0186g/L，在10-羟基癸酸浓度为4g/L时，10-HAD浓度为0.0238g/L，在10-羟基癸酸浓度为8g/L时，10-HAD浓度为0.0298g/L。
对比例1
如实施例5所述的方法，不同之处在于，采用相同浓度的10-羟基癸酸(溶于二甲基亚砜)替代癸烷进行过夜诱导培养。
在诱导时，将20mL 50g/L的10-羟基癸酸加到500mL菌液中，在后续菌体离心时，发现异常，推测可能是二甲基亚砜或者10-羟基癸酸对菌体造成伤害，致使后期静息细胞不能成功制备。
对比例2
如实施例5所述的方法，不同之处在于，采用相同浓度的IPTG替代葡萄糖进行转化培养。经检测，在10-羟基癸酸浓度为1g/L时，10-HAD浓度为0.0153g/L，在10-羟基癸酸浓度为2g/L时，10-HAD浓度为0.0156g/L，在10-羟基癸酸浓度为4g/L时，10-HAD浓度为0.0160g/L，在10-羟基癸酸浓度为8g/L时，10-HAD浓度为0.0208g/L。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
cggatccatg atatggaaac gaaaaatcac cctgga 36
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cctcgagtca caaaatagcg gtcgtcaa 28
<210> 3
<211> 411
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
atgatatgga aacgaaaaat caccctggaa gcactgaatg ctatggggga aggaaacatg 60
gtgggattgc tggatattcg ctttgaacat attggtgatg acacccttga agcgacaatg 120
ccagtagact cacggacaaa gcagcctttc gggttgctgc atggaggtgc atctgtggta 180
ctggccgaaa gtatcggttc cgttgccggt tatttatgta ccgaaggtga gcaaaaagtg 240
gttggtctgg aaatcaatgc taaccacgtc cgctcggcac gagaagggcg ggtgcgcggc 300
gtatgcaaac cgttgcatct cggttcgcgt caccaggtct ggcagattga aatcttcgat 360
gagaaagggc gtttgtgctg ttcgtcacga ttgacgaccg ctattttgtg a 411
<210> 4
<211> 136
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
Met Ile Trp Lys Arg Lys Ile Thr Leu Glu Ala Leu Asn Ala Met Gly
1 5 10 15
Glu Gly Asn Met Val Gly Leu Leu Asp Ile Arg Phe Glu His Ile Gly
20 25 30
Asp Asp Thr Leu Glu Ala Thr Met Pro Val Asp Ser Arg Thr Lys Gln
35 40 45
Pro Phe Gly Leu Leu His Gly Gly Ala Ser Val Val Leu Ala Glu Ser
50 55 60
Ile Gly Ser Val Ala Gly Tyr Leu Cys Thr Glu Gly Glu Gln Lys Val
65 70 75 80
Val Gly Leu Glu Ile Asn Ala Asn His Val Arg Ser Ala Arg Glu Gly
85 90 95
Arg Val Arg Gly Val Cys Lys Pro Leu His Leu Gly Ser Arg His Gln
100 105 110
Val Trp Gln Ile Glu Ile Phe Asp Glu Lys Gly Arg Leu Cys Cys Ser
115 120 125
Ser Arg Leu Thr Thr Ala Ile Leu
130 135

Claims (10)

1.一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌；
(2)取步骤(1)制得的含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，接入含有抗生素的液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD600为0.8～1.2时，降温至14～20℃适应0.5～2小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5～0.8mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞；
(3)将步骤(2)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10-羟基癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下，制得10-羟基-2-癸烯酸；
所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：
甘油0.8～1.2％,葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，步骤如下：
(i)以大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)将步骤(i)扩增的ydiI基因片段和含有sumo标签的质粒pET-28a用BamHI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接得含有sumo标签的重组质粒pET-28a-ydiI；
(iii)将步骤(ii)的重组质粒pET-28a-ydiI转入大肠杆菌BL21DE(3)，筛选阳性重组大肠杆菌，诱导表达得融合型硫酯酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；
进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增体系为：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL Hifi酶12.5μL，ddH2O 9.5μL，共25μL；
进一步优选的，步骤(i)中PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中筛选阳性菌株的方法为：采用菌落PCR鉴定和蛋白表达及可溶性鉴定，将鉴定结果为阳性的菌株再进行测序鉴定。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液体培养基为LB液体培养基，抗生素为卡那霉素，卡那霉素浓度为50μg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，诱导培养条件为降温至16℃适应1小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.64mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，继续诱导培养8小时，制得诱导细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min,收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％盐水洗涤沉淀。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化培养条件为在25～35℃条件下培养20小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化培养基组份如下，均为质量百分比：
甘油1％,葡萄糖0.4％,抗生素50μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，10-羟基癸酸在培养基中的浓度为8g/L；
优选的，所述步骤(3)中，10-羟基癸酸溶解于二甲基亚砜。
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