CN107384844A - 一种产磷脂酶d的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段从生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)中克隆获得磷脂酶D基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，通过卡那霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含磷酸酶工程菌。并将重组磷脂酶D用于转化磷脂酰胆碱和丝氨酸生产磷脂酰丝氨酸，实现维生素C‑2‑磷酸酯的高效生产。在40℃、pH4.5的条件下反应2h，磷脂酰丝氨酸产量可达15.8g/L，转化率为63.9％，时空产率为7.9g/L/h。

Description

一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程和蛋白质工程技术领域。

背景技术

磷脂酰丝氨酸(phophatidylserine，PS)是一种构成哺乳动物、高等植物和微生物细胞的重要的膜磷脂。在生理调节方面，PS传递神经讯息、调节体内代谢过程、调节与膜蛋白互作的酶的活性；在功效价值方面，PS能够改善老年痴呆症、抗抑郁、舒缓压力、提高记忆力和认知力。

目前制备PS的方法有有机溶剂萃取法、化学合成法和生物酶转化法。化学合成难度大、产物成分复杂、分离提纯困难，因此还处于试验研究阶段。萃取法是目前工业化生产PS的主要方法。其原理是以富含PS的动、植物细胞，如牛脑、大豆等为原料，以有机溶剂萃取、浓缩。然而，以动物脑为原料提取PS时存在致病隐患，由此而得到的PS的安全性受到质疑。而以大豆为原料进行萃取还存在萃取过程不环保、干扰物质种类多等问题。

酶转化法是利用磷脂酶D(phospholipase D，PLD)的转磷脂酰活性，卵磷脂提供磷脂基质，L-丝氨酸(L-Ser)作为醇供体，合成PS。生物合成PS具有生产成本低、反应效率高、条件温和的优势，由此得到的PS高纯度、多功效、无毒副作用，而具有更广阔的应用前景，磷脂酶D(EC 3.1.4.4)，最先于1947年在卷心菜、花生中被发现，随后的研究发现PLD广泛存在于动、植物和微生物细胞内，其中以微生物来源的、同时是链霉菌属来源的PLD表现出更好的转磷脂酰活性。

目前PLD的生产主要采取微生物发酵法。然而链霉菌的产酶周期长(5-7天)、生产强度低、培养成本高，不利于实际工业生产。

发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明利用大肠杆菌异源表达PLD基因，实现酶在短时间内的大量表达纯化，以大大提高生产效率，降低生产成本。

本发明的第一个目的是提供一种高产磷脂酶D的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶D。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶D由SEQ ID NO.2所示基因编码。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶D由pET28a(+)为载体进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α、或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明的第二个目的是提供一种构建高产磷脂酶D重组菌的方法，所述方法是将来源于产二素链霉菌的编码磷脂酶D的基因与载体连接，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述编码磷脂酶D的基因如SEQ ID NO.2所示，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述基因编码的重组蛋白N端引入6个连续的组氨酸标签。

在本发明的一种实施方式中，所述构建高产磷酸酶的重组菌具体包括如下步骤：以pET28a(+)为载体，将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中重组表达SEQ ID NO.1所示磷脂酶D。

本发明的第三个目的是提供一种重组磷脂酶D的制备方法，所述方法将所述重组菌培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，以IPTG为诱导剂，表达磷脂酶D。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，加入终浓度为0.4～0.6mM IPTG后，在25～28℃诱导1～4h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，加入终浓度为0.4mM IPTG后，在25℃下进行诱导2h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还将磷脂酶D进行纯化，所述纯化将所述重组菌细胞破碎，选用亲和镍柱层析纯化磷脂酶D，分别用10、20、50mM的咪唑洗去杂蛋白，再以300、500mM浓度的咪唑洗脱目标蛋白，透析脱盐后，采用10kDa超滤浓缩管获得纯磷脂酶D蛋白。

本发明的第四个目的是提供应用所述磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法，所述方法是以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物，应用SEQ ID NO.1所示磷脂酶D转化底物生产磷脂酰丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶D的形式为酶液或载有产磷脂酶D的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述转化条件是：pH 4～9，转化温度30～60℃，转化时间2～8h。

在本发明的一种实施方式中，所述转化在摇床中进行，摇床转速为200～220rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系是：大豆卵磷脂浓度为0.1～0.4mol，L-ser浓度为0.5～2.0mol，用所述重组菌的冻干状态进行转化：酶粉添加量为20～100mg/mol PC。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶D经过冷冻干燥机冻干。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系是：大豆卵磷脂浓度为0.1mol，L-ser浓度为0.5mol，加入纯化后的磷脂酶D用于转化反应。

本发明还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含磷脂酰丝氨酸的食品、药品或保健品。

有益效果：

1、本发明所述的磷脂酶D属于碱性磷脂酶家族，具有较高的水解和转磷脂酰活性。

2、本发明将来源产二素链霉菌的磷脂酶D基因异源表达于大肠杆菌中，经过生产优化，解决了包涵体的问题，磷脂酶D表现出相对较高的活力，可以更好地满足工业生产的需求。在40℃、pH4.5的条件下反应2h，磷脂酰丝氨酸产量可达15.8g/L，转化率为63.9％，时空产率为7.9g/L/h。

附图说明

图1为蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：BL21对照菌株；2：表达优化后PLD1破碎上清；3：表达优化前PLD1破碎上清；4：表达优化前PLD1破碎沉淀；

图2为蛋白表达及纯化SDS-PAGE电泳图；M：marker；1：纯化后PLD1；2：纯化前PLD1；

图3为PLD1在不同pH下的酶活；

图4为PLD1在不同温度下的酶活。

具体实施方式

酶活定义：在50℃下，pH 8.0，每分钟每生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活单位。

待测样品预处理：去转化液10000rpm离心5min，收集上层有机相，旋转蒸发后用流动相重新溶解样品。以磷脂酰丝氨酸、磷脂酸胆碱、磷脂酸钠盐为标准品，配置标准溶液。将适度稀释的样品和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和剩余磷脂酰胆碱的含量。

磷脂酰丝氨酸含量的测定：采用高效液相色谱法。色谱柱：DIOL(250mm×4mm，5μm)；流动相：正己烷/异丙醇/1％冰醋酸＝8：8：1(v：v：v)，用0.22μm滤膜过滤；柱温：30℃；检测波长：210nm；进样量：20μL；流速:1mL/min。

时空产率的计算：时空产率(g/L/h)＝PS产量(g/L)/转化时间(h)

实施例1：重组磷脂酶D基因工程菌的构建

(1)设计引物，通过分子生物学手段用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物将来源于Streptomyces ambofaciens的磷脂酶D基因(SEQ ID NO.2所示)进行PCR扩增：体系中加入LA taq酶，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min；

(2)用限制性内切酶HindIII和EcoR I将目的片段和表达载体pET28a(+)在37℃酶切2h；

(3)将目的基因酶切胶回收后用T4连接酶和质粒pET28a(+)在16℃连接10h；

(4)将连接产物导入E.coli BL21(DE3)感受态中，在卡那霉素抗性的LB平板中培养12h；

(5)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，即为表达磷脂酶D基因工程菌E.coli BL21-PLD1。

分别将来源于Streptomyces virginiae、Streptomyces katrae、Streptomycesmobaraensis、Streptomyces durhamensis、Streptomyces auratus、Streptomycescellostaticus，NCBI登录号为702629196、797033027、491094579、665609522、493655542、973824570、21886803和517155的对应的基因采用相同策略在目的宿主中进行表达，构建的工程菌分别命名为E.coli BL21-PLD2～PLD7。

实施例2：基因工程菌的诱导表达

(1)将构建的基因工程菌E.coli BL21-PLD1接入LB斜面培养基培养12h；未导入表达载体的菌株作为对照；

(2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养8h；

(3)将E.coli BL21-SaPLD种子液接入LB培养基内，培养至OD₆₀₀为0.6，使用单因素优化，分别加入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.8mM的IPTG进行诱导，于16、25、30、37℃诱导4、8、12、16h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体。磷脂酶D可在BL21菌株内正确表达，大小为55kDa(如图1所示)，最优表达条件为：IPTG浓度0.1mM、诱导温度25℃、诱导时长12h，此时酶活为2.5U/mL，表达优化后破碎上清中可溶性蛋白含量明显增加。

(4)用同样培养方法培养E.coli BL21-PLD2～PLD7，酶活分别为0.27、0.27、0.27、0.31、0.31、0.29U/mL。

实施例3：磷脂酶D的纯化

培养实施例1构建的基因工程菌，并按实施例2诱导其表达磷脂酶D，然后收集基因工程菌菌体，并用无菌生理盐水洗涤菌体两次；经超声破碎后，8000×g离心30min后取上清，即为粗酶液。选用亲和镍柱层析纯化磷脂酶D，分别用10、20、50mM的咪唑洗去杂蛋白，再以300、500mM浓度的咪唑洗脱目标蛋白，透析脱盐后，采用10kDa超滤浓缩管获得纯磷脂酶D蛋白(如图2所示)。纯化结果如表1所示，E.coli BL21-PLD1菌株生产的纯化酶的比活力可达0.27U/mg蛋白，而PLD2～PLD7的纯酶比酶活分别为0.03、0.03、0.03、0.05、0.05和0.04U/mg蛋白。本发明获取的PLD1具有比较好的竞争优势。

表1磷脂酶D的纯化

实施例4

取用实施例3中获得的纯化酶PLD1，调节缓冲液的pH为4.0～12.0，测定其最适pH。反应液包括13.5μLPC(10mM)，3.5μL CaCl₂，1U胆碱氧化酶，1U辣根过氧化物酶，0.24mg/mL4-氨基安替比林，0.16mg/mL苯酚，和10μL重组磷脂酶D，在50℃保温20min后在550nm下测定吸光值，计算剩余酶活力。此时FMMEPLD7的最适pH为8.0，在pH 4.0～12.0范围内都表现出酶活力，在pH 6.5～7.5之间，剩余酶活力保留了最高酶活力的85％(图3所示)。

取用实施例3中获得的纯化酶PLD1，控制pH为8.0，调节反应温度为10～80℃，测定其最适温度。反应液包括13.5μLPC(10mM)，3.5μL CaCl₂，1U胆碱氧化酶，1U辣根过氧化物酶，0.24mg/mL 4-氨基安替比林，0.16mg/mL苯酚，和10μL重组磷脂酶D，在不同温度下保温20min后在550nm测定吸光值，计算剩余酶活力。此时FMMEPLD7的最适温度为50℃，在10～80℃范围内都表现出酶活力，60℃时相对酶活为94％，40℃时依旧维持85％的剩余酶活。(图4所示)。

取用实施例3中获得的纯化酶PLD1，控制pH为8.0，反应温度为50℃，调节底物浓度为1～10mM。反应液包括13.5μLPC，3.5μL CaCl₂，1U胆碱氧化酶，1U辣根过氧化物酶，0.24mg/mL 4-氨基安替比林，0.16mg/mL苯酚，和10μL重组磷脂酶D，加入磷脂酶D后立即记录其吸光值的变化，计算酶的初始反应速率，得到米氏常数。此时FMMEPLD7的K_m为7.0mM。

实施例5：纯酶转化PC生产PS

制备4mL底物和PLD1的反应体系。反应混合物由终浓度为0.1mol PC(溶解于3mL乙醚)，0.5mol L-ser(溶解于1mL 0.2M醋酸钠缓冲液，pH 4.5，0.1mM氯化钙)，和100μL经实施例3的获得的纯化酶(30U/mL)组成。在40℃的反应条件下反应2h后，通过0.22μm的过滤器进行过滤，并用高效液相色谱法进行分析结果如图3所示。此时，PS产量达到15.8g/L，转化率63.9％，时空产率为7.9g/L/h。

实施例6：全细胞转化PC生产PS

实施例2获得的PDL1菌体不经过纯化，收集菌体冻干得到酶粉后为催化剂进行全细胞转化。制备4mL底物和磷脂酶D的反应体系。反应混合物由终浓度为0.1mol PC(溶解于3mL乙醚)，0.5mol L-ser(溶解于1mL 0.2M醋酸钠缓冲液，pH 4.5，0.1mM氯化钙)，和20～100mg/mol PC酶粉。在40℃的反应条件下反应2h后，通过0.22μm的过滤器进行过滤，并用高效液相色谱法进行分析结果如图3所示。此时，PS产量达到2.8～13.9g/L，转化率11.3～56.4％，时空产率为1.4～7.0g/L/h。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产磷脂酶D的重组大肠杆菌及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Ser Arg His Arg Ser Ser Glu Ser Thr Leu Pro Ala Ser Ala

1 5 10 15

Glu His Ala Gly Pro Arg Thr Pro Ser Arg Arg Thr Val Val Lys Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Gly Ala Val Leu Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala Leu Pro

35 40 45

Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ala Phe Leu His Gly Val Ala Ser

50 55 60

Gly Asp Pro Leu Pro Asp Gly Val Leu Leu Trp Thr Arg Val Thr Pro

65 70 75 80

Thr Pro Glu Ser Ile Pro Gly Ser Gly Val Gly Pro Asp Thr Glu Val

85 90 95

Asn Trp Val Val Ala Arg Asp Lys Ala Phe Thr Asp Val Val Ala Lys

100 105 110

Gly Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Ser Asp His Thr Val Lys Ala Asp

115 120 125

Val Arg Gly Leu Ala Pro Ala Thr Asp Tyr Trp Phe Arg Phe Ser Ala

130 135 140

Gly Pro Thr Asp Ser Pro Ala Ala Arg Thr Arg Thr Ala Pro Ala Ala

145 150 155 160

Asp Ala Ala Val Pro Gly Leu Arg Phe Gly Val Val Ser Cys Ala Asn

165 170 175

Trp Glu Ala Gly His Phe Ser Pro Tyr Arg His Leu Ala Ala Arg Gly

180 185 190

Asp Leu Asp Ala Trp Leu His Leu Gly Asp Tyr Leu Tyr Glu Tyr Gly

195 200 205

Thr Gly Glu Tyr Gly Thr Arg Asp Thr Val Val Arg Pro His Ala Pro

210 215 220

Ala His Glu Ile Leu Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Val Arg His Gly Leu

225 230 235 240

Tyr Lys Thr Asp Pro Asp Leu Gln Ala Leu His Ala Ala Ala Pro Val

245 250 255

Val Ala Ile Trp Asp Asp His Glu Ile Ala Asn Asp Thr Trp Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Gly Asn His Thr Glu Gly Ala Glu Gly Thr Trp Ala Ala Arg

275 280 285

Gln Ala Ala Ala Lys Gln Ala Tyr Phe Glu Trp Met Pro Val Arg Thr

290 295 300

Ala Ile Ala Gly Thr Thr Tyr Arg Arg Leu Arg Phe Gly Lys Leu Ala

305 310 315 320

Asp Leu Ser Leu Leu Asp Leu Arg Ser Phe Arg Ser Gln Gln Val Ala

325 330 335

Leu Gly Asp Gly Glu Val Asp Asp Pro Asp Arg Thr Leu Thr Gly Arg

340 345 350

Ala Gln Leu Asp Trp Leu Lys Ala Gly Leu Ser Ser Ser Asp Thr Thr

355 360 365

Trp Arg Leu Val Gly Asn Ser Val Met Ile Ser Pro Phe Ala Val Gly

370 375 380

Ser Ile Pro Ala Glu Leu Leu Lys Pro Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Gly Glu Gly Leu Ala Leu Asn Thr Asp Gln Trp Asp Gly Tyr Thr

405 410 415

Asp Asp Arg Arg Glu Leu Leu Ala His Leu Arg Ala Asn Ala Val Arg

420 425 430

Asn Thr Val Phe Leu Thr Gly Asp Ile His Met Ala Trp Ala Asn Asp

435 440 445

Val Pro His His Ala Ala Thr Tyr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Ala Thr

450 455 460

Glu Phe Val Val Thr Ser Val Thr Ser Asp Asn Leu Asp Asp Ile Val

465 470 475 480

Lys Val Pro Glu Gly Thr Val Ser Ala Ile Ala Ala Pro Val Ile Arg

485 490 495

Ala Ala Asn Arg His Val His Trp Val Asp Thr Asp Arg His Gly Tyr

500 505 510

Gly Val Leu Asp Val Thr Pro Asp Arg Thr Gln Met Asp Tyr Tyr Val

515 520 525

Val Ser Asp Arg Thr Asp Pro Asp Ala Thr Ser Ala Trp Ala Arg Ser

530 535 540

Tyr Arg Thr Arg Ser Gly Thr Gln Arg Val Glu Arg Val Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Val

<210> 2

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgaccagtc gacacagatc atccgagagc accctccctg cgtccgccga gcacgcgggc 60

ccccgcaccc cgagccgccg tacggtcgtc aaggccgcgg cggccggcgc cgtcctggcc 120

gccccgctcg ccgccgcgct gcccgccggt gccgccggtg ccgcccccgc cttcctgcac 180

ggcgtcgcct ccggcgatcc gctgcccgac ggtgtgctgc tgtggacccg ggtgaccccg 240

acccccgagt ccataccggg ttcgggagtc ggcccggaca cggaggtgaa ctgggtcgtc 300

gcccgggaca aggcgttcac cgacgtcgtc gccaagggat ccgtcaccgc gacggcggcc 360

tccgaccaca ccgtcaaggc cgacgtccgg ggcctcgccc ccgccacgga ctactggttc 420

cgcttctccg ccggccccac cgactccccc gcggcccgca cccgcaccgc ccccgcggcc 480

gacgcggccg tcccgggcct gcgcttcggc gtggtgtcct gcgccaactg ggaggccggc 540

cacttctccc cgtaccgcca cctcgcggcc cgcggcgacc tggacgcctg gctgcacctg 600

ggcgactatc tctacgagta cggcaccggc gagtacggca cccgcgacac cgtcgtacgg 660

ccgcacgcgc ccgcccacga gatcctcacg ctcgccgact accgcgtccg gcacggcctc 720

tacaagaccg accccgacct ccaggcgctg cacgccgccg cgccggtcgt ggcgatctgg 780

gacgaccacg agatcgccaa cgacacctgg tcgggcggtg cggggaacca caccgagggc 840

gccgagggca cctgggcggc gcgccaggcc gccgccaagc aggcctactt cgagtggatg 900

ccggtccgca ccgcgatcgc cgggaccacc taccgcaggc tgcgcttcgg caagctcgcc 960

gacctctcgc tgctggacct gcgctccttc cgctcgcagc aggtggcgct cggcgacggc 1020

gaggtcgacg acccggaccg caccctcacc ggccgcgccc agctggactg gctcaaggcg 1080

gggctcagct cctccgacac cacgtggcgg ctggtcggca actcggtgat gatctccccg 1140

ttcgccgtcg gctcgatccc cgccgagctg ctgaagccgc tcgccgagct gctcggtctg 1200

cccggggagg ggctcgccct caacacggac cagtgggacg ggtacaccga cgaccgccgc 1260

gaactgctgg cccacctgcg cgcgaacgcc gtccgcaaca ccgtgttcct gaccggcgac 1320

atccacatgg cgtgggccaa cgacgtgccg caccacgccg ccacgtaccc gctgtccgcc 1380

tcggccgcca cggagttcgt cgtcacgtcg gtgacctccg acaacctcga cgacatcgtg 1440

aaggtccccg agggcacggt ctcggcgatc gcggcgccgg tcatccgggc cgcgaaccgg 1500

cacgtccact gggtcgacac cgaccggcac ggctacggcg tgctggacgt cacgccggac 1560

cggacgcaga tggactacta cgtcgtctcc gaccgcaccg acccggacgc cacgtcggcc 1620

tgggcccgtt cgtaccgcac gcgcagcggc acccagcggg tcgagcgcgt ctacgcgccc 1680

gtctga 1686

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattcg cccccgcctt cctgc 25

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt cagacgggcg cgtagacgcg ctcg 34

Claims (10)

1.一种高产磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶D；所述磷脂酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述磷脂酶D由pET系列载体进行表达。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

4.一种构建权利要求1所述高产磷脂酶D的基因工程菌的方法，其特征在于，将编码磷脂酶D的基因与载体连接，在宿主大肠杆菌中重组表达；所述编码磷脂酶D的基因序列如SEQID NO.2所示。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体为pET28a(+)，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。

6.一种重组磷脂酶D的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因工程菌培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，以IPTG为诱导剂，表达磷脂酶D。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因工程菌培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，加入终浓度为0.4～0.6mM IPTG，于25～28℃诱导1～4h。

8.一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物，应用权利要求1所述的基因工程菌转化底物生产磷脂酰丝氨酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转化体系是：大豆卵磷脂浓度为0.1～0.4mol，L-丝氨酸浓度为0.5～2.0mol，转化条件为：pH 4～9，转化温度30～60℃，转化时间2～8h。

10.权利要求1所述的基因工程菌在制备含磷脂酰丝氨酸的食品、药品或保健品中的应用。