CN109022390B

CN109022390B - 一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶d的方法

Info

Publication number: CN109022390B
Application number: CN201810846519.XA
Authority: CN
Inventors: 卢英华; 熊维德; 曾宪海; 姚传义; 沈亮; 陈翠雪
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN109022390A

Abstract

本发明公开了一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，将带有组氨酸纯化标签的重组磷脂酶D表达在大肠杆菌周质空间中，通过脱氧胆酸钠和EDTA的提取液提取后，经二步硫酸铵沉淀和打浆，阴离子交换层析和Ni²⁺柱亲和层析纯化得到电泳级纯度磷脂酶D。

Description

一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法

技术领域

本发明属于生物工程下游蛋白质分离纯化领域，具体涉及一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法。

背景技术

磷脂酶D(EC 3.1.4.4，PLD)，以磷脂为底物，作用于磷酸二酯键，根据受体的不同(水和醇)，发生水解反应和转磷脂酰反应。其中，通过转磷脂酰反应，底物磷脂中可以引入各种各样醇基，生成多种生物活性和药用价值的磷脂，被广泛用于食品和制药行业。目前，受限于磷脂酶D来源不足和价格高(链霉菌属PLD，≥150units/mg，6516.9￥/1000U，Sigma)，其工业上的广泛应用受到制约。特别是当重组蛋白位于大肠杆菌周质空间时，利用传统的溶菌酶渗透压提取法，并不能完全提取PLD。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，包括：

1)表达所述磷脂酶D的序列中带有组氨酸纯化标签及定位于大肠杆菌周质空间的信号肽序列；收集表达磷脂酶D后的重组大肠杆菌菌体，按照不低于18mL·g^-1菌体湿重(WCW)的比例加入提取液，所述提取液中含有0.025～0.1％(w/v)脱氧胆酸钠(DOC)及9～11mM EDTA；室温搅拌萃取30min以上，离心去除菌体，上清为活性部分；

2)往步骤1)得到的活性部分中，搅拌加入硫酸铵至饱和度40～60％，0～5℃放置12～16h(例如放置过夜)得第一蛋白沉淀；

3)步骤2)得到的第一蛋白沉淀用含有20～30％(w/v)硫酸铵、pH值为5～7的洗涤液打浆，离心去除沉淀，上清中加入硫酸铵至饱和度40～60％，0～5℃放置12～16h(例如放置过夜)得第二蛋白沉淀；

4)步骤3)得到的第二蛋白沉淀经平衡液溶解和透析，经阴离子交换层析，洗脱得PLD活性组分；

5)将步骤4)收集的PLD活性组分，经Nⁱ²⁺亲和层析纯化得到纯化的磷脂酶D。

一实施例中：所述步骤1)中，提取液包括：0.025～0.1％(w/v)脱氧胆酸钠，9～11mM EDTA，180～220mM Tris-HCl，pH值为7.0～7.6。提取液中脱氧胆酸钠的浓度优选0.04～0.06％(w/v)。

一实施例中：所述步骤1)中，提取液的加入比例为18～20mL·g^-1菌体湿重(WCW)；加入提取液后，室温搅拌萃取30～45min。

一实施例中：所述步骤1)中，组氨酸标签位于磷脂酶D核苷酸序列的C端，所述信号肽序列位于磷脂酶D核苷酸序列的N端；所述信号肽序列为pelB signal sequence或GeneIII secretion signal sequence。

一实施例中：所述步骤3)中，洗涤液包括20～30％硫酸铵，45～55mM Tris-HCl，pH值为5～7。

一实施例中：所述步骤4)中，第二蛋白沉淀用含有18～22mM Tris-HCl，pH值7.8～8.2的平衡液溶解，0～5℃透析至透析液电导率与平衡液一致后，超滤，上样至已用平衡液平衡后的阴离子交换层析柱，用浓度为0～0.3M的NaCl进行洗脱。

一实施例中：所述步骤4)中，阴离子交换层析使用的阴离子交换树脂为弱阴离子交换树脂，如DEAE-琼脂糖凝胶FF；所述步骤5)中，Nⁱ²⁺亲和层析采用Histrap-Ni琼脂糖凝胶HP。

一实施例中：所述步骤5)中，Nⁱ²⁺亲和层析的方法包括：上样后，用含有18～22mM咪唑，0.4～0.6M NaCl，18～22mM Tris-HCl，pH 7.8～8.2的连接液平衡至基线，用含有480～520mM咪唑，0.4～0.6M NaCl，18～22mM Tris-HCl，pH 7.8～8.2的0～50％的洗脱液梯度洗脱。

一实施例中：所述表达磷脂酶D的重组大肠杆菌的构建方法包括：以含有如SEQ IDNo.1所示的pSC101的par区域序列的质粒pUC57-par为模板，扩增par序列；以含有阿拉伯糖启动子P_BAD的质粒pBADK为模板，扩增质粒pBADK骨架；以上述扩增得到的par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，扩增并转化，得到载体pBADKP；采用含有如SEQ ID No.2所示的密码子优化的Streptomyces antibioticus PLD基因序列的质粒pUC57-PLD与所述载体pBADKP，通过Nco I和Xba I双酶切，连接并转化至大肠杆菌recA^-缺陷株，得到含有pBADKP-PLD的重组菌。

其中，扩增par序列采用如SEQ ID No.3所示的引物1及如SEQ ID No.4所示的引物2。

其中，扩增质粒pBADK骨架采用如SEQ ID No.5所示的引物3及如SEQ ID No.6所示的引物4。

其中，以par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，采用POE-PCR进行扩增并转化至E.coli DH5α。

其中，大肠杆菌recA^-缺陷株为E.coli TOP10(recA^-)，得到的重组菌为TOP10/pBADKP-PLD。

一实施例中：诱导所述重组大肠杆菌表达磷脂酶D的方法包括：培养至高密度；然后补充营养，饱和诱导，调节温度为16～22℃，添加碱金属盐至浓度为0.05～0.75M，诱导表达得到磷脂酶D。

其中，碱金属盐为钠盐、钾盐、锂盐中的至少一种。

其中，碱金属盐为NaCl，浓度为0.15～0.75M，优选0.35～0.65M。

其中，诱导温度为17～19℃，优选18℃。

其中，营养为质量比为1～1.25:1的甘油和酵母粉，例如1:1或1.25:1，甘油的终浓度为20～30g·L^-1。

其中，饱和诱导为添加诱导剂阿拉伯糖至浓度为0.03～0.04％·OD₆₀₀ ^-1。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明在大肠杆菌中成功表达了大量有活性的链霉菌PLD，达到1.1×10⁶U·L^-1(748mg·L^-1)，产量是目前文献报道的最高水平，其中99％重组蛋白位于大肠杆菌周质空间，利用传统的溶菌酶渗透压提取法，并不能完全提取其中的PLD。本发明提供了一种简单和有效的化学提取法，组合使用DOC和EDTA，能够100％的提取PLD，进一步地，通过二步硫酸铵沉淀和打浆，阴离子交换层析和Ni²⁺亲和层析纯化得到电泳纯的PLD。本发明为磷脂酶D的工业化应用奠定了基础。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1用于说明不同方法对提取重组磷脂酶D的影响比较。

图2用于说明基于EDTA和DOC的重组磷脂酶D提取方法。

图3用于说明SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)分析磷脂酶D纯化过程。

图4为本发明实施例采用的pBAD/gIIIC质粒图谱。

图5为本发明实施例采用的pBADK质粒图谱。

图6为本发明实施例采用的pBADKP质粒图谱。

图7为本发明实施例采用的pBADKP-PLD质粒图谱。

图8为本发明实施例采用的pET22KP-PLD质粒图谱。

图9为本发明实施例采用的pLACKP-PLD质粒图谱。

图10为本发明实施例采用的pUC57-par质粒图谱。

图11为本发明实施例采用的pUC57-PLD质粒图谱。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

备注：对于下述实施例中所用的材料及仪器特作如下说明，但并不限于此。

主要的实验材料：

质粒pBADK(原始质粒来源于Invitrogen公司的质粒pBAD/gIIIC，将Amp^R抗性基因替换成如SEQ ID No.7所示的Kan^R后得到pBADK，并含有严谨型阿拉伯糖启动子P_BAD，Guzmanet al.1995)，质粒pBADKP-PLD(含有严谨型阿拉伯糖启动子P_BAD和par区域)，质粒pET22KP-PLD(含有T7启动子P_T7和par区域)，质粒pLACKP-PLD(含有严谨型乳糖启动子P_lac/ara-1，Lutzand Bujard 1997和par区域)，质粒pUC57-par(含有如SEQ ID No.1所示的pSC101的par区域序列，由生工生物(上海)有限公司全合成，得到含有如SEQ ID No.1所示的par序列的质粒pUC57-par)和质粒pUC57-PLD(含有如SEQ ID No.2所示的密码子优化的Streptomycesantibioticus PLD基因序列，由生工生物(上海)有限公司全合成，得到含有如SEQ ID No.2所示的PLD序列的质粒pUC57-PLD)由实验室保存。E.coli DH5α购自生工生物工程(上海)股份有限公司，E.coli TOP10(recA^-)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。相关质粒图谱见附图，其中黑色填充标识表示启动子(P_BAD、P_T7和P_lac/ara-1)、定位于周质空间的信号肽序列(pelB signal sequence和Gene III secretion signal sequence)、par区域、Kan^R抗性基因、通过Nco I和Xba I插入PLD、设计用于West bolting实验的myc epitope标签和用于Ni²⁺亲和层析纯化的6×His的组氨酸标签，这两者标签位于PLD的C端。

采用本发明的分离纯化方法对重组菌TOP10/pBADKP-PLD表达的PLD进行分离纯化：

其中，重组菌TOP10/pBADKP-PLD的构建及PLD诱导表达过程包括：

A)以质粒pUC57-par(含有如SEQ ID No.1所示的pSC101的par区域序列)为模板，通过引物1和引物2(表1)，PCR扩增par序列；以含有阿拉伯糖启动子P_BAD的质粒pBADK为模板，通过引物3和引物4(表1)，PCR扩增质粒pBADK骨架；以上述两段扩增得到的par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，进行POE-PCR，产物直接转化至E.coli DH5α，菌落PCR验证并测序，得到载体pBADKP；将含有如SEQ ID No.2所示的密码子优化的Streptomycesantibioticus PLD基因序列的质粒pUC57-PLD与载体pBADKP，通过Nco I和Xba I双酶切，T4连接酶连接，转化至E.coli TOP10(recA^-)，菌落PCR验证并测序，得到重组菌TOP10/pBADKP-PLD。PCR和POE-PCR的反应体系和热循环条件分别见表2、表3、表4和表5。

表1引物序列

表2 PCR反应体系

表3 PCR热循环条件

表4 POE-PCR反应体系

表5 POE-PCR热循环条件

B)取TOP10/pBADKP-PLD甘油冻存管少量菌体，接种至10mL LB培养基，37℃，200rpm，培养过夜。按1％接种量，转接至200mL TB培养基中，37℃，200rpm，培养6～7h。然后接种至含发酵培养基的3L发酵罐中，温度控制在37℃，待细胞培养至OD₆₀₀为50～60，甘油耗完，此时调整培养温度至18℃。往发酵罐中，分别补加氯化钠、阿拉伯糖、甘油和酵母粉，其中氯化钠的终浓度为0.4M，阿拉伯糖终浓度为0.035％·OD₆₀₀ ^-1，甘油和酵母粉的质量比为1.25：1，甘油的终浓度为25g·L^-1。诱导过程持续至生物量开始下降或PLD酶活下降时结束。最终最高产酶达1.1×10⁶U·L^-1(748mg·L^-1)，胞外产酶为1.6×10⁴U·L^-1，只占总酶活的1.5％，表明细胞裂解并没有发生。

实施例1.不同方法提取重组磷脂酶D的比较

将诱导表达后的重组菌TOP10/pBADKP-PLD离心收集，经渗透压法、超声破碎法和化学提取法分别提取大肠杆菌周质空间蛋白。图1(A)所示，比较这三种方法对提取的总蛋白和PLD酶活的影响。相较于超声破碎法(以100％计)，渗透压法、0.1％DOC和10mM EDTA分别提取了52％、55％和36％的PLD；同时，相较于渗透压法和0.1％DOC，10mM EDTA显示出更好的比提取率(以比酶活计，提取的PLD酶活/提取总蛋白含量)。

DOC为表面活性剂，EDTA为离子螯合剂，二者作用方式不同，可以选择一起使用于提取实验。结果如果图1(B)所示。在10mM EDTA下，随着DOC浓度的增加，提取的总蛋白和PLD都增加，比提取率先增加后减小；相较于超声破碎法，在10mM EDTA下，0.05％DOC和0.1％DOC都获得100％PLD的释放，且0.05％DOC的比提取率更小。10mM EDTA，0.05％DOC和200mMTris-HCl(pH 7.5)作为提取液组分效果最佳。

实施例2.基于EDTA和DOC的重组磷脂酶D提取方法

提取体积和提取时间考察结果如图2所示，采用18～20mL·g-1WCW体积的提取液，萃取30～40min，提取PLD足够有效；同时，增加提取液体积和延长萃取时间，PLD提取仍然有效。工业应用上，高离心力难以获得，造成的细胞湿重中含有更多的水份，从而相应增加提取液体积并不影响PLD的提取。

实施例3.大尺度纯化重组磷脂酶D

1)参照上述步骤B)的方法，分批发酵重组菌TOP10/pBADKP-PLD获得2.4L发酵液，4℃，8000rpm离心得菌体，湿重为250g。菌体重悬在4.5L提取液(0.05％(w/v)脱氧胆酸钠，10mM EDTA，200mM Tris-HCl，pH值为7.0～7.6)中，室温搅拌萃取45min，离心获得约4.5L上清；

2)上清缓慢加入1800g硫酸铵，至饱和度为50％，放置4℃冰箱过夜。离心获得第一蛋白沉淀；

3)用2.5L洗涤液(20～30％硫酸铵，50mM Tris-HCl，pH值为5～7)打浆第一蛋白沉淀，放置4℃冰箱过夜，离心去除沉淀，上清中加入715g硫酸铵至饱和度50％，放置4℃冰箱过夜；离心获得第二蛋白沉淀；

4)第二蛋白沉淀用一定体积平衡液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)溶解，4℃透析，至透析液电导率与平衡液一致；超滤，上样至平衡液平衡后的DEAE-琼脂糖凝胶FF层析柱，使用TH-300梯度混合器(上海沪西分析仪器厂)，一杯中加入平衡液200mL，另一杯中加入等体积的含0.3M NaCl的平衡液，流速为1mL/min，进行梯度洗脱，洗脱时间6h，用自动部分收集器收集样品，测定蛋白浓度和酶活，得到PLD活性组分；

5)富集的PLD活性组分，通过AKTA蛋白纯化系统，上样至HitrapTM HP柱，用连接液(20mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡至基线，经AKTA系统设置梯度洗脱模式，A通道为连接液，B通道为洗脱液(500mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)，确定B通道最高比例为50％，柱体积5mL，流速为5mL/min，时间为20min，B通道比例由0％均匀增加至50％，完成梯度洗脱，自动部分收集样品，测定蛋白浓度和酶活，得电泳级纯度PLD(SDS-PAGE显示单一条带)。

图3给出了不同纯化步骤的结果和SDS-PAGE及Western blotting分析，其中序号1～5按顺序对应纯化步骤，分别为提取、第一次硫酸铵沉淀打浆、第二次硫酸铵沉淀透析、阴离子交换和Ni²⁺柱纯化。

本发明还适用于使用其它信号肽表达磷脂酶D在大肠杆菌周质空间后的PLD纯化，如pelB signal sequence。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

gaattcgaca gtaagacggg taagcctgtt gatgataccg ctgccttact gggtgcatta 60

gccagtctga atgacctgtc acgggataat ccgaagtggt cagactggaa aatcagaggg 120

caggaactgc gaacagcaaa aagtcagata gcaccacata gcagacccgc cataaaacgc 180

cctgagagcc cgtgacgggc ttttcttgta ttatgggtag tttccttgca tgaatccata 240

aaaggcgcct gtagtgccat ttacccccat tcactgccag agccgtgagc gcagcgaact 300

gaatgtcacg aaaaagacag cgactcaggt gcctgatggt cggagacaaa aggaatattc 360

agcgatttgc ccgtg 375

<210> 2

<211> 1527

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

gcggataccc cgccgacccc gcatctggat gcaattgaac gtagcctgcg tgatacctca 60

ccgggtctgg aaggttcagt ttggcagcgt accgatggta atcgcctgga tgccccggat 120

ggtgatccgg caggttggct gctgcagaca ccgggttgtt ggggtgatgc aggttgtaaa 180

gatcgcgcag gtacccgtcg tctgctggat aaaatgaccc gtaatattgc cgatgcacgt 240

cataccgttg atattagtag cctggccccg tttccgaatg gtggctttga agatgcagtt 300

gttgatggcc tgaaagcagt ggttgcagca ggtcattcac cgcgtgttcg cattctggtt 360

ggtgcagcac cgatttatca tctgaatgtg gttccgtctc gttatcgtga tgaactgatt 420

ggtaaactgg gtgcagcagc aggtaaagtt actctgaatg tggccagcat gaccaccagc 480

aaaaccagcc tgtcatggaa tcatagcaaa ctgctggttg ttgatggtaa aacagcaatt 540

accggtggta ttaatggttg gaaagatgat tatctggata ccgcgcatcc ggtgagtgat 600

gttgatatgg cgctgagcgg tccggcagca gcgagtgcag gtaaatatct ggataccctg 660

tgggattgga catgtcgtaa tgcaagtgat ccggcaaaag tttggctggc aacctcaaat 720

ggtgcatctt gtatgccgtc aatggaacag gatgaagcag gtagtgcacc ggctgaaccg 780

accggtgatg ttccggttat tgcagttggt ggtctgggtg ttggtattaa agaaagcgat 840

ccgtctagcg gttatcatcc ggatctgccg accgcacctg ataccaaatg tacagtgggt 900

ctgcatgata ataccaatgc agatcgtgat tatgataccg ttaatcctga agaaaatgcg 960

ctgcgtagcc tgattgcgag tgcacgtagt catgttgaaa ttagtcagca ggatctgaat 1020

gcaacctgtc cgccgctgcc gcgttatgat attcgtacct atgataccct ggcaggtaaa 1080

ctggccgcag gtgttaaagt tcgtattgtt gtgagcgatc cggcaaatcg tggtgcagtt 1140

ggtagcggtg gttattctca gattaaatca ctggatgaaa ttagcgatac cctgcgtacc 1200

cgcctggttg cactgaccgg tgataatgaa aaagcgagcc gtgccctgtg tggtaatctg 1260

cagctggcta gttttcgtag cagtgatgca gcaaaatggg cagatggcaa accgtatgca 1320

ctgcatcata aactggtgag cgttgatgat agcgcatttt atattggtag taaaaatctg 1380

tatccggcat ggctgcagga ttttggttat attgttgaaa gcccggcagc agcacagcag 1440

ctgaaaaccg aactgctgga tccggaatgg aaatatagcc agcaggcagc agccaccccg 1500

gcaggttgtc cggcacgtca ggcaggt 1527

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcatcaccga aacgcgcgag gcagcgaatt cgacagtaag acgggtaagc 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcgccttcg cgcgcgaatt gatctcacgg gcaaatcgct gaatattcct 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggaatattc agcgatttgc ccgtgagatc aattcgcgcg cgaaggcgaa 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttacccgt cttactgtcg aattcgctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga 50

<210> 7

<211> 816

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 7

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

Claims

1.一种分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：包括：

1)表达如SEQ ID No.2所示的磷脂酶D的序列中带有组氨酸纯化标签及定位于大肠杆菌周质空间的信号肽序列；收集表达磷脂酶D后的重组大肠杆菌菌体，按照不低于18mL·g^-1菌体湿重的比例加入提取液，所述提取液中含有0.025～0.1％脱氧胆酸钠及9～11mMEDTA；室温搅拌萃取30min以上，离心去除菌体，上清为活性部分；

2)往步骤1)得到的活性部分中，搅拌加入硫酸铵至饱和度40～60％，0～5℃放置12～16h得第一蛋白沉淀；

3)步骤2)得到的第一蛋白沉淀用含有20～30％硫酸铵、pH值为5～7的洗涤液打浆，离心去除沉淀，上清中加入硫酸铵至饱和度40～60％，0～5℃放置12～16h得第二蛋白沉淀；

4)步骤3)得到的第二蛋白沉淀经平衡液溶解和透析，经阴离子交换层析，洗脱得PLD活性组分；第二蛋白沉淀用含有18～22mM Tris-HCl，pH值7.8～8.2的平衡液溶解，0～5℃透析至透析液电导率与平衡液一致后，超滤，上样至已用平衡液平衡后的阴离子交换层析柱，用浓度为0～0.3M的NaCl进行洗脱；阴离子交换层析使用的阴离子交换树脂为弱阴离子交换树脂；

5)将步骤4)收集的PLD活性组分，经Ni²⁺ 亲和层析纯化得到纯化的磷脂酶D；Ni²⁺ 亲和层析的方法包括：上样后，用含有18～22mM咪唑，0.4～0.6M NaCl，18～22mM Tris-HCl，pH7.8～8.2的连接液平衡至基线，用含有480～520mM咪唑，0.4～0.6M NaCl，18～22mM Tris-HCl，pH 7.8～8.2的0～50％的洗脱液梯度洗脱；Ni²⁺ 亲和层析采用Histrap-Ni琼脂糖凝胶HP。

2.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤1)中，提取液包括：0.025～0.1％脱氧胆酸钠，9～11mM EDTA，180～220mM Tris-HCl，pH值为7.0～7.6。

3.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤1)中，提取液的加入比例为18～20mL·g^-1菌体湿重；加入提取液后，室温搅拌萃取30～45min。

4.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤1)中，组氨酸标签位于磷脂酶D核苷酸序列的C端，所述信号肽序列位于磷脂酶D核苷酸序列的N端；所述信号肽序列为pelB signal sequence或Gene III secretion signalsequence。

5.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：所述步骤3)中，洗涤液包括20～30％硫酸铵，45～55mM Tris-HCl，pH值为5～7。

6.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：所述表达磷脂酶D的重组大肠杆菌的构建方法包括：以含有如SEQ ID No.1所示的pSC101的par区域序列的质粒pUC57-par为模板，扩增par序列；以含有阿拉伯糖启动子P_BAD的质粒pBADK为模板，扩增质粒pBADK骨架；以上述扩增得到的par序列和pBADK骨架分别作为引物和模板，扩增并转化，得到载体pBADKP；采用含有如SEQ ID No.2所示的密码子优化的Streptomycesantibioticus PLD基因序列的质粒pUC57-PLD与所述载体pBADKP，通过Nco I和Xba I双酶切，连接并转化至大肠杆菌recA^-缺陷株，得到含有pBADKP-PLD的重组菌。

7.根据权利要求1所述的分离纯化大肠杆菌重组磷脂酶D的方法，其特征在于：诱导所述重组大肠杆菌表达磷脂酶D的方法包括：培养至高密度；然后补充营养，饱和诱导，调节温度为16～22℃，添加碱金属盐至浓度为0.05～0.75M，诱导表达得到磷脂酶D。