CN114921395B - 用CRISPR-Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D中的应用 - Google Patents

用CRISPR-Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用CRISPR‑Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D中的应用。本发明涵盖敲除三个海藻糖酶基因treA、treC及treF构建耐盐菌株和磷脂酶D表达菌株及优化磷脂酶D表达条件两部分。所述磷脂酶D表达菌株构建采用质粒pBADKP‑pld2，优化表达条件包含诱导条件优化、培养基优化、氯化钠及氯化镁胁迫。在优选的表达条件下，一方面获得高水平磷脂酶D产量，另一方面极大地减少了磷脂酶D的细胞泄露问题，维持细胞的表达活性。本发明能实现短时间内磷脂酶D高表达，具有优良的时空产率。

Description

用CRISPR-Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D 中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及用CRISPR技术敲除大肠杆菌海藻糖酶基因并用改造菌株生产磷脂酶D的方法。
背景技术
磷脂酶D(EC 3.1.4.4，PLD)是一种能够作用于磷酸二酯键的酶，能够催化磷脂发生碱基交换反应或者水解反应。基于这一独特的反应位点，磷脂酶D有广泛的应用：以磷脂作为底物能获得各种稀有磷酯，如磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺等在医药及食品行业有重要应用的高附加值产品；对磷脂粗品进行纯化制备普通提纯工艺难以获得的高纯度磷脂；用于药物的开发，催化核苷类、多肽类和多糖类与磷脂连接制成脂质体，构建高效的药物递送系统。
目前工业上和实验室的研究中所采用的磷脂酶D主要来源于高等植物或者放线菌。经过一系列的研究表明，来源于放线菌特别是来源于链霉菌的磷脂酶D，有最高的转磷脂酰基活性。但由于链霉菌自身磷脂酶D的产量较少，不能满足工业生产的要求，越来越多的异源表达系统被用于表达磷脂酶D，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、毕氏酵母等。
受限于磷脂酶D对于细胞的毒性，表达宿主在发酵过程中会出现细胞裂解、磷脂酶D胞外泄露、包涵体形成等问题，使得表达量难以达到工业生产的门槛。2020年，熊维德等发现大肠杆菌在高盐胁迫下能极大的减小磷脂酶D的细胞毒性及改善胞外泄露的情况，取得了有报道以来最高的磷脂酶D产量，达到1100U/mL。然而，在高盐胁迫下大肠杆菌的生长会受到一定程度的限制，因此，还有必要寻找增加大肠杆菌耐盐能力的方法。
CRISPR-Cas9技术是从细菌适应性免疫系统发展而来，能够进行基因敲除、基因标记、基因特定突变或者敲入等操作，是新一代的基因编辑技术。该技术通过gRNA定位到编辑基因位点，而后Cas9蛋白能以极高精度切割所选位点使之发生双键断裂。再结合λ-Red同源重组技术，与所选的同源臂发生同源重组，能够实现基因编辑的操作。目前还未有利用CRISPR-Cas9技术对大肠杆菌进行改造增强其耐盐能力、进而提高磷脂酶D产量的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了用CRISPR-Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D中的应用。
本发明经研究发现，在大肠杆菌中，有多种应对外界环境变化的保护系统。其中海藻糖是大肠杆菌能通过自身合成的最重要的保护剂之一。海藻糖能够使得大肠杆菌抵御高渗环境、低温、高温、干燥、乙醇等不良因素的侵害。海藻糖由葡萄糖经过6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶两步催化合成，可被周质海藻糖酶(TreA)、6-磷酸海藻糖水解酶(TreC)和胞质海藻糖酶(TreF)等几个海藻糖酶分解。敲除海藻糖酶基因能够使得海藻糖在大肠杆菌胞内积累量增加，进而增加其对于不良因素的抵御能力。因此：
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种海藻糖酶缺陷菌株，所述海藻糖酶缺陷菌株为E.coli BW25113△treA，E.coli BW25113△treA△treC或E.coli BW25113△treA△treC△treF。
进一步地，所述海藻糖酶缺陷菌株通过以下方法得到：利用CRISPR-Cas9&λ-Red技术对大肠杆菌BW25113(Escherichia coli BW25113)进行基因编辑，敲除了周质海藻糖酶基因treA、6-磷酸海藻糖水解酶基因treC、胞质海藻糖酶基因treF，分别构建了上述的海藻糖酶缺陷菌株E.coli BW25113△treA、E.coli BW25113△treA△treC、E.coli BW25113△treA△treC△treF。
上述的海藻糖酶缺陷菌株E.coli BW25113△treA、E.coli BW25113△treA△treC、E.coli BW25113△treA△treC△treF相比原始菌株，对不良环境的耐受性高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种磷脂酶D表达菌株，所述磷脂酶D表达菌株为在上述的海藻糖酶缺陷菌株E.coliBW25113△treA△treC△treF中转入带有磷脂酶D基因的质粒pBADKP-pld2而构建得到。具体的构建方法如下：
(1)宿主菌改造：利用CRISPR-Cas9&λ-Red技术，选取E.coli BW25113进行基因改造，将海藻糖代谢途径中的三个海藻糖酶基因treA、treC、treF敲除，分别获得海藻糖酶缺陷菌株E.coli BW25113△treA(记为BW1)，E.coli BW25113△treA△treC(记为BW2)和E.coli BW25113△treA△treC△treF(记为BW3)，经培养筛选选择BW3进行后续实验；
(2)磷脂酶D表达菌株构建：将步骤(1)取得的海藻糖酶缺陷菌株BW3经过电转化转入带有磷脂酶D基因的质粒pBADKP-pld2，即获得磷脂酶D表达菌株，简称为大肠杆菌BW3-PLD。
进一步地，步骤(1)的基因敲除，参考美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公布的大肠杆菌K-12MG165(登录号：NC_000913)的基因组序列。敲除的三个序列为treA(Gene ID：945757)、treC(Gene ID：948762)、treF(Gene ID：948037)。选取CRISPR-Cas9&λ-Red技术进行基因编辑，具体实施过程参照文献“Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene editing in the Escherichiacoli genome via the CRISPR-Cas9 system.[J].Applied and environmentalmicrobiology，2015，81(7)：2506-2514.”。
进一步地，步骤(2)中选用的质粒pBADKP-pld2为磷脂酶D表达质粒，公开于“熊维德.链霉菌磷脂酶D异源表达研究[D].福建：厦门大学，2018.”。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
磷脂酶D表达菌株在制备磷脂酶D中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
一种利用磷脂酶D表达菌株制备磷脂酶D的方法，所述磷脂酶D表达菌株用LB培养基复苏后，转接于TB培养基中培养至对数期，然后再转接至发酵培养基中，加入诱导剂，诱导磷脂酶D的表达。
其中，本发明中采用的TB培养基的配方为甘油4mL/L，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾12.54g/L。
进一步地，所选用诱导剂阿拉伯糖的浓度为0.01％/OD600～1.00％/OD600，诱导时间选为对数生长期，pH为6.3～7.8，诱导温度为12℃～30℃。优选地，诱导条件为诱导剂阿拉伯糖浓度0.10％/OD600～0.30％/OD600，诱导时间为对数生长中后期(如OD600＝6～8)，pH为6.8～7.0，温度为16℃～20℃。
优选地，诱导剂的加入时间为转接至发酵培养基之后1～3h，转接后在2h的时间点加入诱导剂可以使PLD表达量达到最高。
优选地，所述发酵培养基的配方为：5～7g/L甘油，28～36g/L酵母粉，0.45～0.55M盐，10～14g/L胰蛋白胨，0.09～0.11M磷酸钾缓冲盐；所述盐包括氯化钠或氯化镁中的至少一种。
优选地，选取氯化钠及氯化镁混合进行盐胁迫，即在上述发酵培养基中，总的盐浓度为0.45～0.55M，其中氯化钠为0.38～0.42M、氯化镁为0.08～0.12M，可以提高磷脂酶D产量，且可减少胞外占比。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明所构建的海藻糖酶缺陷菌株对于高盐的耐受性有明显的提高，该海藻糖酶缺陷菌株转入pBADKP-pld2得到磷脂酶D表达菌株，用于磷脂酶D发酵，表达水平高且发酵时间显著缩短，具有优良的时空产率。
附图说明
图1为本发明实施例2中改造菌在氯化钠胁迫下的生长曲线(A)及海藻糖含量对比(B)，B中各组从左到右分别为BW、BW1、BW2、BW3。
图2为本发明实施例3中四株菌的产酶对比。
图3为本发明实施例4中诱导条件对表达磷脂酶D的影响图，分别为：诱导剂浓度(A)，诱导时机(B)，pH(C)，温度(D)；(B)中，OD600＝2.51、5.03、6.99、8.55、9.00分别对应对数生长前期、对数生长中期、对数生长中后期、对数生长后期、稳定期。
图4为本发明实施例4中细菌生长曲线图。
图5为本发明实施例5中最陡爬坡实验结果图。
图6为本发明实施例6中不同时间补加诱导剂对表达磷脂酶D的影响图。
图7为本发明实施例7中氯化钠及氯化镁混合胁迫对表达磷脂酶D的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.海藻糖酶缺陷菌株大肠杆菌BW3的构建
三个海藻糖酶基因敲除所用的N20序列如SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ IDNo.19所示，分别用于构建pTargetF-treA，pTargetF-treC，pTargetF-treF：
ACGCACCACCAGCATCGTAC(N20-treA)(SEQ ID No.17)
TCGTAACCGTTATCGACCTG(N20-treC)(SEQ ID No.18)
TACTCGCTGGAGTAGACCTC(N20-treF)(SEQ ID No.19)
其他采用的序列如表1。
表1 引物序列
以pKD13质粒为模板，选用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增出同源臂1。将pCas质粒电转导入大肠杆菌BW25113中，获得大肠杆菌BW25113-pCas，再同时将同源臂1和质粒pTargetF-treA电转进大肠杆菌BW25113-pCas中，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12进行菌落PCR筛选阳性菌株，构建得到海藻糖酶缺陷菌株BW1-pCas，在37℃下培养，使得菌株将质粒pCas丢失，得到海藻糖酶缺陷菌株BW1(BW25113△treA)。经过IPTG诱导后使得细胞将质粒pTargetF-treA丢失以进行下一步基因编辑。
同样的以大肠杆菌BW25113基因组为模板，选用SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQID No.5，SEQ ID No.6进行overlap PCR扩增出同源臂2。同时将同源臂2和pTargetF-treC电转进BW1-pCas进行基因编辑并用SEQ ID No.13和SEQ ID No.14进行菌落PCR筛选阳性菌落，构建得到海藻糖酶缺陷菌株BW2-pCas，在37℃下培养，使得菌株将质粒pCas丢失，得到海藻糖酶缺陷菌株BW2(BW25113△treA△treC)。
同样的以大肠杆菌BW25113基因组为模板，选用SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQID No.9，SEQ ID No.10进行overlap PCR扩增出同源臂3。同时将同源臂3和pTargetF-treF电转进大肠杆菌BW2-pCas进行基因编辑并用SEQ ID No.15和SEQ ID No.16进行菌落PCR筛选阳性菌落，构建得到海藻糖酶缺陷菌株BW3-pCas，在37℃下培养，使得菌株将质粒pCas丢失，得到海藻糖酶缺陷菌株BW3(BW25113△treA△treC△treF)。
以上阳性菌落均通过测序验证菌株序列被成功敲除。
实施例2.海藻糖酶缺陷菌株盐胁迫生长曲线
分别将菌株BW(即原始菌株大肠杆菌BW25113)、海藻糖酶缺陷菌株BW1、海藻糖酶缺陷菌株BW2、海藻糖酶缺陷菌株BW3用LB培养基，37℃，200rpm过夜复苏后，以1％接种量转接于TB培养基中，培养5h后离心重悬于新鲜的带有0.5M NaCl的TB培养基中。结果如图1所示：(A)在高浓度的氯化钠胁迫下各个菌株的生物量都出现不同程度的降低，再经过一定时间的适应之后，改造菌株BW2和BW3较另外两株菌生物量有较大提高，且BW3生物量还有一定程度反弹。(B)在生物量差别较大的后面两个时间点中取样，测量各个样品的海藻糖含量，可以发现海藻糖在BW3积累更多，其耐盐的能力与海藻糖的含量呈现出正相关。
从图1现象表明，经过海藻糖酶敲除的菌株在盐胁迫下出现了更多的海藻糖积累，并且具有更优的耐盐性能。
实施例3.PLD表达重组菌株的构建及发酵
使用磷脂酶D表达质粒pBADKP-pld2电转进菌株BW、BW1、BW2、BW3中，得到BW-PLD、BW1-PLD、BW2-PLD、BW3-PLD。用LB培养基，37℃，200rpm过夜复苏后，以1％接种量转接于TB培养基中，培养5h后离心重悬于新鲜的带有0.45M NaCl的TB培养基(pH 6.9)中，8h后取样测胞内胞外酶活。结果如图2，海藻糖酶敲除菌株BW3构建的BW3-PLD相比于原始菌株BW构建的BW-PLD，酶活提高了29.56％，比活提高了25.88％，具有更优的产酶能力。
实施例4.诱导条件对于表达磷脂酶D的影响
将重组大肠杆菌BW3-PLD经过LB培养基过夜复苏后，以1％接种量转接于TB培养基中，培养5h后离心重悬于含有0.45M NaCl的TB培养基中，在18℃，200rpm中培养8h。本实施例依次优化了诱导剂用量、诱导时期选取、pH及温度。
结果如图3所示，所选取的最优的诱导条件为：诱导剂阿拉伯糖用量0.10％/OD600～0.30％/OD600、诱导时期在对数生长中后期、pH 6.8～7.0、温度16℃～20℃。最优诱导条件下的PLD表达量为25.09U/mL。
实施例5.PLD表达培养基优化
选取实施例4中最优的诱导条件，在本实施例中，初始的发酵培养基为含有0.45MNaCl的TB培养基，选用Plackett-Burman方法进行优化。具体设计如表2，结果如表3，分析如表4。
表2 Plackett-Burman实验因素及水平
表3 Plackett-Burman实验设计及结果
表4 Plackett-Burman实验结果分析
以PLD的比活为响应值，对数据进行回归分析，得到回归方程：
比活＝2.90–0.39甘油–0.07磷酸钾缓冲盐+0.29酵母粉–0.06胰蛋白胨–1.28氯化钠该模型中，R2＝0.903，p＝0.0054<0.05，说明该模型可信度较高。
通过分析结果可知，五个因素对于PLD比活的影响大小为(由小到大)：胰蛋白胨、磷酸钾缓冲盐、酵母粉、甘油、氯化钠。
表5 最陡爬坡实验设计
进一步的选用氯化钠、甘油、酵母粉进行最陡爬坡实验，确定较优培养基，实验设计如表2。根据图5可知，最优的培养基为第4组，此时酶活达到27.17U/mL。由此确定最优的发酵培养基配方为5～7g/L甘油，28～36g/L酵母粉，0.45～0.55M氯化钠，10～14g/L胰蛋白胨，0.09～0.11M磷酸钾缓冲盐。
实施例6.补加诱导剂对PLD表达的影响
选取实施例5中最优发酵培养基进行实验，本实施例探究了在转接至发酵培养基之后0h、2h、4h、6h补加与初始等量诱导剂对PLD表达的影响。结果如图6，在2h的时间点加入诱导剂使得PLD表达量达到最高，38.92U/mL。此时表达量被极大的提高约43％，这表明维持诱导剂在一定浓度时有利于PLD的表达。进一步地看，在这一条件下，PLD的胞外占比缩小至19.66％，较对照组30.08％有了极大的改善。
实施例7.氯化镁及氯化钠混合盐胁迫对PLD表达的影响
选取实施例6中最优的条件进行实验，实验设计表如表6所示，分别探讨了氯化钠和氯化镁不同比例时，对PLD表达的影响。从图7可以看出氯化镁对于减小PLD胞外占比起了极大的作用，在表达量最高的一组中，氯化钠为0.4M、氯化镁为0.1M，酶活达到47.63U/mL，胞外占比仅为4.80％。该结果表明两种盐对于PLD表达的影响并不是一致的，氯化钠对于缓解PLD的毒性有着极大的作用而氯化镁则更多的改善PLD的泄露问题。
表6 氯化钠及氯化镁混合设计表
上述结果表明，通过本发明的方法，构建了三株具有不同耐盐能力的海藻糖酶缺陷菌株，改善了细胞在高盐胁迫下的细胞生长情况。同时本发明优化了磷脂酶D表达条件，磷脂酶D表达量得到了极大的提高，且泄露至胞外的情况也被极大的改善。本发明的优势在于磷脂酶D的表达量高且表达时间较短，具有优良的时空产率。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 用CRISPR-Cas9技术构建的重组大肠杆菌及其在制备磷脂酶D中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgaatgacg ttgtcggagt aagcgctggt taaggtgtgg gttgtgcctc caccgtttct 60
gcggactggc 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgaatgacg ttgtcggagt aagcgctggt taaggtgtgg gttgtgcctc tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacttccgct gctttagctg 20
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagttaagac cgaagcgctc atcttcccta agccccggta 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcgcttcg gtcttaactg tacgttattc ctgcgaatgc 40
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagaccacgc ttgctattga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacatcggcc tgtttactgc 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagagaggt ctctcgtatc aaggatccaa cctccgaaat 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatacgagag acctctcttg ttttacagcc agccgctaac 40
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatgctcgat ggcgatcagg 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagacgtta tttgatcact ctatttcgcc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgtaacaat attcaggtag caattgatgc 30
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctctcgattc aaccgagcta ctggc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgctttgcat caaggatgtt tgagc 25
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgctgaata tcagtaccgg aacggtaaaa 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agatcaggaa tggcatatca tgattgcggc 30
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgcaccacc agcatcgtac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgtaaccgt tatcgacctg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tactcgctgg agtagacctc 20

Claims (2)

1.一种利用磷脂酶D表达菌株制备磷脂酶D的方法，其特征在于：所述磷脂酶D表达菌株为海藻糖酶缺陷菌株E.coli BW25113 △treA△treC△treF中转入带有磷脂酶D基因的质粒pBADKP-pld2；
所述磷脂酶D表达菌株用LB培养基复苏后，转接于TB培养基中培养至对数期，然后再转接至发酵培养基中，加入诱导剂，诱导磷脂酶D的表达；
所述发酵培养基的配方为：5～7 g/L甘油，28～36 g/L酵母粉，0.45～0.55 M盐，10～14 g/L胰蛋白胨，0.09～0.11 M磷酸钾缓冲盐；所述盐为0.4 M氯化钠和0.1 M氯化镁；
诱导条件为诱导剂浓度0.10%/OD600～0.30%/OD600，诱导时间为对数生长中后期，pH为6.8～7.0，温度为16℃～20℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：诱导剂的加入时间为转接至发酵培养基之后1～3 h。
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