CN117821416A - 一种胞苷激酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种胞苷激酶突变体及其应用。本发明基于Thermus thermophilus来源的野生型胞苷激酶(cytidine kinase,EC 2.7.1.213)的氨基酸进行改造，通过在野生型胞苷激酶蛋白表面引入半胱氨酸，使其在空间结构上形成二硫键，借此提高蛋白三维结构的稳定性，筛选得到了一种稳定性获得提升的胞苷激酶突变体。改造后的胞苷激酶可在催化反应温度下长时间保持活性状态，从而提高保证催化体系的稳定性并提高效率，满足工业生产需求。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种胞苷激酶突变体及其应用。
背景技术
胞苷酸本身用作食品添加剂、基因工程试剂及制药原料，具有促进肠胃道细胞发育和改善肠、胃道微生态的作用，还具有抗病毒、抗肿瘤、增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢的作用，还是生产胞磷胆碱、三磷酸胞苷等核苷酸类药物的中间体原料。以胞苷为原料，可通过胞苷激酶UDK(cytidine kinase,EC 2.7.1.213)催化合成胞苷酸。然而，在胞苷酸的生产过程中，工业催化环境大幅降低了催化酶的活性，当在35℃环境下保存时间超过5h时，胞苷激酶UDK(cytidine kinase,EC 2.7.1.213)活性降低了50％以上。为了增加该酶在工业催化环境下的稳定性，提高胞苷酸的转化率，需要构建了一种稳定性能得到强化的胞苷激酶，以便更好的应用于胞苷酸的制备中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，通过在野生型胞苷激酶蛋白表面引入半胱氨酸，构建一种胞苷激酶突变体，使其在空间结构上相邻的氨基酸残基形成二硫键，增强蛋白三维结构的稳定性。
本发明还要解决的技术问题是提供上述胞苷激酶突变体在制备胞苷酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种胞苷激酶突变体，所述的胞苷激酶突变体的氨基酸序列，是将野生型胞苷激酶的氨基酸序列第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第175位脯氨酸突变为半胱氨酸，第195位的谷氨酸突变为半胱氨酸得到的。
具体的，所述的突变为K19C，L46C，L124C，P175C，E195C。
其中，所述的野生型胞苷激酶来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的编码野生型胞苷激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
其中，所述的胞苷激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，编码胞苷激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含上述编码胞苷激酶突变体的核苷酸序列。
其中，所述表达载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述的重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达即可。优选的表达载体为pET28a，其是通过提取E.coli DHSα/pET28a(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)质粒，再经酶切、分离回收、纯化得到的。
一种重组表达转化体，含有上述重组表达载体或上述胞苷激酶突变体的核苷酸序列。通过将上述构建好的重组表达载体转化至宿主细胞制备得到的。
其中，所述的宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地进行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。
在适于胞苷激酶突变体表达的条件下培养所述的重组表达转化体后，离心收集胞苷激酶突变体菌体。
具体的，将菌株在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上划线，37℃培养12h。挑取单菌落至50mL离心管(含10％v/v加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基)，37℃，220rpm培养12h。然后以10％v/v的接种量接种到1L摇瓶(含25％v/v加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基)，37℃，220rpm培养至OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，降低温度至30℃，200rpm，再持续培养10h以诱导表达，离心并收集菌体用于后续催化反应。
在本发明的一些实施例中，将获得的胞苷激酶突变体菌体进行酶活检测，测定方法如下：50mL酶活测定体系含有30mM胞苷，100mM MgCl2·6H2O，30mM ATP，10g/L二甲苯，20g/L胞苷激酶突变体，在35℃下以750rpm搅拌反应混合物1h，并通过添加5mol/L碱溶液将反应pH维持在7.5，分别置于35℃环境保存5h和10h，检测各环境下胞苷激酶突变体的酶活(以野生型胞苷激酶为对照)。其中，所述的酶活，其定义为：30-37℃，pH＝7-8条件下，优选为在35℃，pH 7.5条件下，每分钟产生1μmol CMP(胞苷酸)所需的酶量。
具体的，所述的胞苷激酶突变体在35℃工业催化环境下保存5h、10h，其酶活活性比野生型胞苷激酶的酶活活性分别提高了36.5％、93.8％。
上述胞苷激酶突变体在催化合成胞苷酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。
即以胞苷为底物，以ATP作为辅助底物，通过胞苷激酶突变体催化胞苷合成胞苷酸。
其中，所述的催化合成，其催化体系包括：80-150mM胞苷，30-80mM MgCl2·6H2O，80-150mM ATP，5-15g/L二甲苯，50-150g/L胞苷激酶突变体；优选为：100mM胞苷，50mMMgCl2·6H2O，100mM ATP，10g/L二甲苯，100g/L胞苷激酶突变体。
其中，所述的催化合成，其反应条件为：30-37℃、500-1000rpm、pH＝7-8；优选为35℃、750rpm、pH＝7.5下，反应10h或15h。
具体的，所述的胞苷激酶突变体在35℃工业环境下催化反应5h、10h和15h，胞苷激酶突变体的胞苷转化率在后期明显高于野生型胞苷激酶，在反应10h、15h后，其胞苷转化率比野生型胞苷激酶分别提高了31.9％、46.9％。
有益效果：与现有技术相比，本发明构建了一种稳定性得到强化的胞苷激酶突变体，相较于野生型胞苷激酶，其在以胞苷为原料催化合成胞苷酸的工业催化环境下的适应能力更强，可在催化反应温度下长时间保持活性状态，从而保证了催化体系的稳定性并提高了生成胞苷酸的效率，可以更好的满足工业生产的需求，因而具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为胞苷激酶突变体的重组表达载体的质粒构建图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明中，所述的胞苷激酶稳定性强化型突变体M与胞苷激酶突变体M所表述的意思相同，均为野生型胞苷激酶WT经定点突变(K19C，L46C，L124C，P175C，E195C)得到的突变体。
实施例1：野生型Thermus thermophilus胞苷激酶的构建及其稳定性强化型突变体的构建。
野生型Thermus thermophilus胞苷激酶WT，根据NCBI所述的对应序列由基因组经体外PCR技术扩增而来，其对应核苷酸序列为：(SEQ ID NO:1)
ATGAGCGCGCCGAAACCGTTTGTGATTGGCATTGCGGGCGGCACCGCGAGCGGCAAAACCACCCTGGCGCAGGCGCTGGCGCGCACCCTGGGCGAACGCGTGGCGCTGCTGCCGATGGATCATTATTATAAAGATCTGGGCCATCTGCCGCTGGAAGAACGCCTGCGCGTGAACTATGATCATCCGGATGCGTTTGATCTGGCGCTGTATCTGGAACATGCGCAGGCGCTGCTGCGCGGCCTGCCGGTGGAAATGCCGGTGTATGATTTTCGCGCGTATACCCGCAGCCCGCGCCGCACCCCGGTGCGCCCGGCGCCGGTGGTGATTCTGGAAGGCATTCTGGTGCTGTATCCGAAAGAACTGCGCGATCTGATGGATCTGAAAGTGTTTGTGGATGCGGATGCGGATGAACGCTTTATTCGCCGCCTGAAACGCGATGTGCTGGAACGCGGCCGCAGCCTGGAAGGCGTGGTGGCGCAGTATCTGGAACAGGTGAAACCGATGCATCTGCATTTTGTGGAACCGACCAAACGCTATGCGGATGTGATTGTGCCGCGCGGCGGCCAGAACCCGGTGGCGCTGGAAATGCTGGCGGCGAAAGCGCTGGCGCGCCTGGCGCGCATGGGCGCGGCG
相对应的氨基酸序列为：(SEQ ID NO:2)
MSAPKPFVIGIAGGTASGKTTLAQALARTLGERVALLPMDHYYKDLGHLPLEERLRVNYDHPDAFDLALYLEHAQALLRGLPVEMPVYDFRAYTRSPRRTPVRPAPVVILEGILVLYPKELRDLMDLKVFVDADADERFIRRLKRDVLERGRSLEGVVAQYLEQVKPMHLHFVEPTKRYADVIVPRGGQNPVALEMLAAKALARLARMGAA
具体操作步骤如下：
(1)将嗜热栖热菌Thermus thermophilus接种于YP(含有蛋白胨20g/L；酵母提取物30g/L)液体培养基，30℃培养至对数生长期，使用细菌基因组提取试剂盒(购买自索莱宝科技有限公司)提取基因组获得Thermus thermophilus基因组模板。
根据NCBI数据库中已有嗜热栖热菌Thermus thermophilus中胞苷激酶的基因，设计合成了引物UDK-F：ACGCGAATTCATGAGCGCGCCGAAACCGTTT和UDK-R：CGTAAAGCTTCGCCGCGCCCATGCGCGCCAGG(由南京金斯瑞科技有限公司设计合成)进行PCR扩增，得到PCR反应液。
其中，PCR反应体系包括：2.5μL l0×Buffer(Mg2+free)，2μL dNTP Mixture(2.5mM)，3μL MgCl2(25mM)，0.1μL引物UDK-F(100μM)，0.1μL引物UDK-R(100μM)，1μLThermus thermophilus基因组模板，0.5μL PCR扩增高保真酶(购买自Takara)，灭菌双蒸水定容至25μL。PCR反应参数为：95℃变性5分钟，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，设置20个循环，72℃保温15分钟，而后16℃保温1小时。
(2)将10×TBE缓冲液稀释20倍至0.5×TBE工作缓冲液；配制含Gel Red核酸染料的1％琼脂糖的核酸电泳凝胶，混合4μL PCR反应液或DL 2000的DNA marker(对照，购买自Takara公司)和1μL 10×Loading Buffer(购买自Takara公司)，用微量移液器分别将样品加入核酸凝胶胶板的样品小槽内，加完样后电压100v开始跑胶，待胶内蓝色条带移至距离下沿1.5厘米处，停止电泳，取胶观察并利用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)切胶回收。将胶回收产物连接到pMD18T-vector载体(购自Takara公司)连接产物，连接产物转化采用氯化钙法制备的大肠杆菌DHSα感受态细胞，涂布于含有50mg/L卡那抗性的LB平板(含有蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L，琼脂5g/L)，于30℃静置培养过夜，挑取LB平板上的单菌落，置于5mL LB液体培养基(含有蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L)中，30℃，220rpm下培养12小时后提取重组质粒。
提取的重组质粒双酶切验证，双酶切体系包括：8.4μL重组质粒，0.3μL EcoR I，0.3μL HindⅢ，1μL 10×buffer。酶切验证后委托南京金斯瑞科技有限公司测序，测序正确的菌体接种到装有5ml LB液体培养基中，30℃，220rpm下培养12小时后提取重组质粒。提取的重组质粒采用以下体系双酶切：84μL重组质粒，3μL EcoR I，3μL HindⅢ，10μL 10×buffer。37℃恒温水浴12h酶切过夜，采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离回收并纯化得到600bp左右大小的基因片段UDK。
(3)将采购自南京诺唯赞生物科技有限公司的E.coli DHSα/pET28a接种到装有5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm下培养12小时后提取质粒。提取的质粒进行双酶切，酶切体系同上。37℃恒温水浴12h酶切过夜，采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离回收并纯化得到5000bp左右大小的基因片段，即为所需的载体片段pET28a。将回收纯化得到的基因片段UDK和载体片段pET28a连接过夜，连接体系如下：4μL基因片段UDK，1μL载体片段pET28a，5μLSolutionⅠ，16℃连接过夜。
(4)连接产物转化氯化钙法制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，复苏后的菌体涂布于含有50mg/L卡那抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取10个单菌落接种到装有LB液体培养基，双酶切验证并测序，验证正确的即为野生型嗜热栖菌Thermus thermophilus中胞苷激酶菌株。
实施例2：胞苷激酶稳定性强化型突变体M的构建
对实施例1中野生型胞苷激酶的氨基酸残基位点进行定点突变，改造位点及改造方法如下：
将第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第175位脯氨酸突变为半胱氨酸，第195位的谷氨酸突变为半胱氨酸，即K19C，L46C，L124C，P175C，E195C。
胞苷激酶稳定性强化型突变体M的氨基酸序列为：(SEQ ID NO:3)
MSAPKPFVIGIAGGTASGCTTLAQALARTLGERVALLPMDHYYKDCGHLPLEERLRVNYDHPDAFDLALYLEHAQALLRGLPVEMPVYDFRAYTRSPRRTPVRPAPVVILEGILVLYPKELRDCMDLKVFVDADADERFIRRLKRDVLERGRSLEGVVAQYLEQVKPMHLHFVECTKRYADVIVPRGGQNPVALCMLAAKALARLARMGAA
对应的胞苷激酶稳定性强化型突变体M的核苷酸序列为：(SEQ ID NO:4)
ATGAGCGCGCCGAAACCGTTTGTGATTGGCATTGCGGGCGGCACCGCGAGCGGCAGCACCACCCTGGCGCAGGCGCTGGCGCGCACCCTGGGCGAACGCGTGGCGCTGCTGCCGATGGATCATTATTATAAAGATAGCGGCCATCTGCCGCTGGAAGAACGCCTGCGCGTGAACTATGATCATCCGGATGCGTTTGATCTGGCGCTGTATCTGGAACATGCGCAGGCGCTGCTGCGCGGCCTGCCGGTGGAAATGCCGGTGTATGATTTTCGCGCGTATACCCGCAGCCCGCGCCGCACCCCGGTGCGCCCGGCGCCGGTGGTGATTCTGGAAGGCATTCTGGTGCTGTATCCGAAAGAACTGCGCGATAGCATGGATCTGAAAGTGTTTGTGGATGCGGATGCGGATGAACGCTTTATTCGCCGCCTGAAACGCGATGTGCTGGAACGCGGCCGCAGCCTGGAAGGCGTGGTGGCGCAGTATCTGGAACAGGTGAAACCGATGCATCTGCATTTTGTGGAAAGCACCAAACGCTATGCGGATGTGATTGTGCCGCGCGGCGGCCAGAACCCGGTGGCGCTGAGCATGCTGGCGGCGAAAGCGCTGGCGCGCCTGGCGCGCATGGGCGCGGCG
采用全基因合成的方法(由南京金斯瑞科技有限公司合成)获得上述胞苷激酶稳定性强化型突变体M的基因序列，同样经过酶切、连接、胶回收和转化构建(同实施例1，胞苷激酶突变体的重组表达载体的质粒构建图如图1所示)获取胞苷激酶稳定性强化型突变体M的菌株。
实施例3：胞苷激酶稳定性强化型突变体改造效果检测
(1)野生型胞苷激酶及其突变体M的培养：将菌株在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上划线，37℃培养12h。挑取单菌落至50mL离心管(含10％v/v加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基)，37℃，220rpm培养12h。然后以10％v/v的接种量接种到1L摇瓶(含25％v/v加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基)，37℃，220rpm培养至OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，降低温度至30℃，200rpm，再持续培养10h以诱导表达，离心并分别收集相应的菌体用于后续催化反应。
(2)野生型胞苷激酶及其突变体M的酶活检测：50mL酶活测定体系含有30mM胞苷，100mM MgCl2·6H2O，30mM ATP，10g/L二甲苯，20g/L野生型胞苷激酶或突变体M，在35℃下以750rpm搅拌反应混合物1h，并通过添加5mol/L碱溶液将反应pH维持在7.5，分别置于35℃环境保存5h和10h，检测各环境下野生型胞苷激酶及其突变体M的酶活，结果如表1所示。
其中，所述的酶活，其定义为：在35℃，pH 7.5条件下，每分钟产生1μmol CMP(胞苷酸)所需的酶量。
表1野生型胞苷激酶及其突变体M在工业催化温度下保存不同时长的活性差异
| 野生型 | 突变体M | |
| 35℃保存0h的酶活 | 102±3.1 | 95±2.5 |
| 35℃保存5h的酶活 | 52±3.1 | 71±4.2 |
| 35℃保存10h的酶活 | 32±4.3 | 62±3.5 |
(3)野生型胞苷激酶及其突变体M的胞苷转化反应：1L催化体系含有100mM胞苷，50mM MgCl2·6H2O，100mM ATP，10g/L二甲苯，100g/L野生型胞苷激酶或突变体M，在35℃下以750rpm搅拌反应混合物1h，并通过添加5mol/L碱溶液将反应pH维持在7.5，分别置于35℃环境下反应5h、10h和15h，检测各环境下胞苷的转化率，结果如表2所示。
表2野生型胞苷激酶及其突变体M在不同反应时长下的胞苷转化率
| 野生型 | 突变体M | |
| 5h胞苷转化率 | 41％ | 38％ |
| 10h胞苷转化率 | 47％ | 62％ |
| 15h胞苷转化率 | 49％ | 72％ |
结果表明，初始条件下，胞苷激酶稳定性强化型突变体M的活性与野生型胞苷激酶相似。然而，长期的工业催化环境会削弱酶活，从表1可以看出野生型胞苷激酶的活性明显受到抑制，突变体表现出比野生型更高的活性，活性减弱程度显著小于野生型。胞苷激酶稳定性强化型突变体M在35℃工业催化环境下保存5h、10h，其酶活活性比野生型胞苷激酶的酶活活性分别提高了36.5％、93.8％。从表2也可以看出，随着反应时间的推移，胞苷激酶稳定性强化型突变体M的胞苷转化率在后期明显高于野生型胞苷激酶，在反应10h、15h后，其胞苷转化率比野生型胞苷激酶分别提高了31.9％、46.9％。由此可见，经过改造后的胞苷激酶更适用于以胞苷为原料催化合成胞苷酸的工业催化环境，有利于提高反应效率。
本发明提供了一种胞苷激酶突变体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体的氨基酸序列，是将野生型胞苷激酶的氨基酸序列第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第175位脯氨酸突变为半胱氨酸，第195位的谷氨酸突变为半胱氨酸得到的。
2.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的野生型胞苷激酶来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含权利要求4所述的核苷酸序列。
6.一种重组表达转化体，其特征在于，含有权利要求5所述的重组表达载体或权利要求4所述胞苷激酶突变体的核苷酸序列。
7.权利要求1-4中任一项所述的胞苷激酶突变体在催化合成胞苷酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，以胞苷为底物，以ATP作为辅助底物，通过胞苷激酶突变体催化胞苷合成胞苷酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，其催化体系包括：80-150mM胞苷，30-80mM MgCl2·6H2O，80-150mM ATP，5-15g/L二甲苯，50-150g/L胞苷激酶突变体；优选为100mM胞苷，50mM MgCl2·6H2O，100mM ATP，10g/L二甲苯，100g/L胞苷激酶突变体。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，其反应条件为：30-37℃、500-1000rpm、pH＝7-8。
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