CN114058606A - 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，公开了缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用。本发明通过基因工程的方法敲除了地衣芽孢杆菌WX‑02中应激蛋白基因xpt，成功得到了缺失基因xpt的地衣芽孢杆菌WX‑02Δxpt，在此基础上转入绿色荧光蛋白游离表达质粒pHY‑GFP、红色荧光蛋白游离表达质粒pHY‑RFP、碱性蛋白酶游离表达质粒pHY‑AprE、角蛋白酶游离表达质粒pHY‑Ker。相对于对照菌株，本发明所构建得到的工程菌株在上述蛋白表达量提升方面效果显著，为地衣芽孢杆菌异源蛋白生产提供新思路。

Description

缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用
技术领域
本发明属于细菌基因工程改造和蛋白高效表达领域，具体涉及缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌 在异源蛋白生产中的应用。
背景技术
芽胞杆菌是异源蛋白高效表达的良好宿主，地衣芽孢杆菌是目前异源蛋白尤其是蛋白酶 高效工业化生产的常用宿主菌株。异源蛋白表达是提高目的蛋白表达水平的有效策略。近年 来，越来越多的策略被开发用于提高目的蛋白的合成水平。然而，地衣芽孢杆菌中存在着众 多与外源蛋白表达的合成与分泌息息相关的基因，蛋白产量与哪些基因相关仍然是个未知数， 通过对相关基因改造的方式得到高产蛋白工程菌也有待进一步研究。
在之前的研究中，申请人为了提高地衣芽胞杆菌中异源蛋白的表达水平，通过构建敲除 自身胞外蛋白酶，构建了地衣芽胞杆菌表达宿主(ZL201301562150.7)，并成功用于纳豆激 酶的高效合成(We et al.,J IndMicrobiolBiotechnol,2015,42:287-295)；此外，通过强化 信号肽肽酶SppA，提高了纳豆激酶的分泌水平(Cai et al.,Microb Cell Fact,2017,16:70)； 通过细胞表面工程改造，提高了纳豆激酶、α-淀粉酶、β-甘露聚糖酶的表达水平(Chen et al.,World J MicrobiolBiotechnol,2018,34:135)。此外，表达元件的优化改造也是提高蛋 白表达水平的有效策略，通过人工串联启动子的构建(Rao et al.,JBiotechnol,2020,312:1 -10)、5’-UTR筛选与优化(Xiao et al.,ACS SynthBiol,2020,9(5):1051-1058；Rao et al., ACS SynthBiol,10(9):2331-2339)，显著提高了绿色荧光蛋白、角蛋白酶等表达水平；通 过筛选用于目的蛋白分泌的信号肽，提高了纳豆激酶的分泌水平(Cai et al.,J ApplMicrob iol,2016,121(3):704-712)。
xpt是地衣芽孢杆菌中无效循环中的限制性关键酶，其表达水平是否与异源蛋白表达是 否有联系并未解析，不可预知。本发明通过在地衣芽孢杆菌中敲除xpt，达到了异源蛋白产 量提高的技术效果，说明敲除xpt是提高异源蛋白生产水平的有效策略。
发明内容
本发明的目的之一在于提供缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用，所 述的xpt基因的序列为SEQ ID NO.1所示。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用，包括利用本发明的常规方法， 将地衣芽孢杆菌中的xpt基因敲除，然后转入异源蛋白表达载体进行蛋白表达，所述的xpt 基因为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，优选的，所述的异源蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、碱性蛋白酶、 角蛋白酶；
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌WX-02；
以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽孢杆菌中的xpt基因敲除方法，包括下述步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出上游同源臂和xpt基因的下游同源 臂，以CRISPR-Cas9n敲除质粒为模板，PCR扩增出xpt基因的sgRNA；
(2)通过重叠延伸PCR将xpt基因的sgRNA、上游同源臂和xpt基因的下游同源臂连接到 一起，构成目的基因片段；
(3)以CRISPR/Cas9n质粒为模板，扩增得到pHY-cas9n骨架；
(4)采用ExnaseⅡT5外切酶对步骤(2)中的目的基因片段和步骤(3)中的骨架进行酶 切酶连得到敲除质粒pHY-cas9n-Δxpt；
(5)将敲除质粒pHY-cas9n-Δxpt转入地衣芽孢杆菌中，筛选得到阳性转化子；
(6)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到xpt被成功敲除的地衣芽孢 杆菌。
以上所述的应用中，优选的，当采用缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在绿色荧光蛋白、红 色荧光蛋白的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基为M9改良培养基或LB培养基；
M9改良培养基的配方包括：50-90g/L葡萄糖、4-6g/L酵母粉、0.4-0.6g/L氯化钠、0.8-1.2g/L氯化铵、0.01-0.02g/L氯化钙、2-5g/L KH2PO4、15-19g/L Na2HPO4·12H2O、 0.3-0.6g/L MgSO4·7H2O和1ml/LTrace Metal Mix A5母液；pH 6.8～7.4；
所述的Trace Metal Mix A5母液的配方为：2.86g/L H3BO3，1.81g/L MnCl2·4H2O，0. 222g/L ZnSO4·7H2O，0.39g/L NaMoO4·2H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O和49.4mg/LCo (NO3)2·6H2O，其余为水。
当采用缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌生产碱性蛋白酶、角蛋白酶时，所用的发酵培养基 为：5-20g/L葡萄糖、3-5g/L骨蛋白胨、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵 母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K2HPO4，4-8g/L(NH4)2SO4，其余为水，pH 6.8～7.4。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人首次构建敲除xpt基因的地衣芽孢杆菌，成功得到了缺失xpt基因的地衣芽孢杆 菌异源蛋白表达宿主菌株，经过转入绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白游离表达载体，发酵结果 表明，xpt缺失显著提高了蛋白表达水平，与相应对照菌株相比，通过本发明构建得到的工 程菌株在上述蛋白的表达量提升方面效果显著，在绿色荧光蛋白的表达方面上，以LB作为 发酵培养基时，表达量提高了254.12％，以M9改良为发酵培养基时，表达量提高了168.92％； 在红色荧光蛋白的表达方面，以LB作为发酵培养基时，表达量提高了15.41％，以M9改良 作为发酵培养基时，表达量提高了22.08％。本发明为地衣芽孢杆菌蛋白高效表达提供了一 种新策略。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未 特别说明，均来源于商业渠道。
本发明以四种蛋白(绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、碱性蛋白酶、角蛋白酶)为例，说 明本发明技术方案的优越性。
实施例1：
xpt基因缺失株地衣芽孢杆菌WX-02Δxpt的获得：
1、根据地衣芽孢杆菌WX-02(CCTCC NO：M208065，已在CN101603015A中公开)基因组DNA序列中的xpt基因(SEQ ID NO.1所示)的基因序列，设计xpt基因的上游同源臂 引物(xpt-AF、xpt-AR)、下游同源臂引物(xpt-BF、xpt-BR)和sgRNA引物(xpt-gF、xpt -gR)；并以地衣芽孢杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以xpt基因的上游同源臂引 物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到xpt基因的上游同源臂片段和xpt基因的下游同源臂 片段(xpt基因的上游同源臂片段为500bp；xpt基因的下游同源臂片段为500bp)，以CRI SPR/Cas9n质粒(Li et al.,ApplEnviron Microbiol,2018,84(6))为模板，以xpt-gF和xpt-gR 为引物，PCR扩增出xpt基因的含sgRNA的片段(xpt基因的含sgRNA的片段为560bp)；
其中，xpt-AF、xpt-AR、xpt-BF、xpt-BR、xpt-g-F、xpt-g-R的序列为：
xpt-AF：GCTGGACCGTCATCATTA AAATCGCTGCTGCCTTCA、
xpt-AR：GCAGAGCATGGCACGGTGTGCCGATGGAAAAGTTAC、
xpt-BF：GTAACTTTTCCATCGGCACACCGTGCCATGCTCTGC、
xpt-BR：TTTGCCCAAGCTTCTAGAAAAAACCGTTGGACATCA、
xpt-gF：AGTGATAGCGGTACCATTGATTCCGCACACCTTTGCGCGTTTTAGAGCTAGAA ATAG、
xpt-gR：TGAAGGCAGCAGCGATTTTAATGATGACGGTCCAGC；
2、以xpt基因的上游同源臂、xpt基因的下游同源臂片段和xpt基因的含sgRNA的片段为模 板，上游同源臂引物xpt-gF、下游同源臂引物xpt-BR为引物，通过重叠延伸PCR将xpt基 因的上游同源臂、xpt基因的下游同源臂和xpt基因的含sgRNA的片段连接到一起，得到目 的基因片段；
3、以CRISPR/Cas9n质粒(Li et al.,ApplEnviron Microbiol,2018,84(6))为模板，以P43(no R BS)-T5-F、300-T5-R进行PCR扩增得到pHY-cas9n骨架；
其中，P43(no RBS)-T5-F、300-T5-R的序列为：
P43(no RBS)-T5-F：AATGGTACCGCTATCACTTTATAT；
300-T5-R：TCTAGAAGCTTGGGCAAAGCGTTTT。
4、采用ExnaseⅡT5外切酶对步骤2中的目的基因片段和步骤3中的骨架进行酶切酶连得 到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有 盐酸四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证， 所用引物为：PHY-F，PHY-R；
pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC；
pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC。
若转化子的PCR验证结果为：在1779bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上 述转化子为阳性转化子，命名为：敲除载体pHY-cas9n-Δxpt；
5、将敲除载体pHY-cas9n-Δxpt转入地衣芽孢杆菌WX-02中，在37℃的条件下经含有盐酸 四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所 用引物为：xpt-YF和xpt-YR)。若转化子的PCR验证结果为：在1279bp处出现电泳条带， 证明：敲除载体pHY-cas9n-Δxpt成功转入地衣芽孢杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了敲除载体300-cas9n-Δxpt的地衣芽孢杆菌WX-02)；
其中，xpt-YF和xpt-YR的序列为:
xpt-YF：GACGATCAGCACGAGGGA、
xpt-YR：TGCTTCATATTTGTCATT；
6、将步骤5得到的阳性转化子在37℃条件下、不含有盐酸四环素的培养基中经过数次转接 培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为Δxpt-YF和Δxpt-YR)。若转化子的PCR验 证结果为：在1779bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌WX-02；在1279bp处出现电泳条带时，说明WX-02的基因组上的xpt基因成功敲除，该 转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到xpt成功敲除 的工程菌株(即地衣芽孢杆菌WX-02Δxpt)。
实施例2：
两种外源蛋白表达载体的构建：
碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE的制备：
1.以地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA为模板，设计引物AprE-F/AprE-R扩增碱性蛋白酶基 因aprE的基因表达框(SEQ ID NO.2所示，包括启动子、aprE基因和终止子)，得到apr E基因序列1740bp；
2.采用EcoRI和XbaI对得到的aprE基因进行酶切，得到双酶切片段；
3.采用EcoRI和XbaI对芽胞杆菌表达载体pHY300PLK进行双酶切，得到双酶切载体片段；
4.将步骤2和3得到的双酶切片段和双酶切载体经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产 物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗 性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为： pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1992bp处出现电泳条带，说明表达 载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：游离表达载体pHY-AprE)；
AprE-F：CGGAATTCTGATCTCATAAAATAAATGAATAGT
AprE-R：GCTCTAGAGGGGTCATCTCTTTCGCGTCGT
角蛋白酶游离表达载体pHY-Ker的制备：
1.以解淀粉芽胞杆菌HZ-12基因组DNA(Cai et al.,Appl BiochemBiotechnol.2017,181(3):11 08-1122)为模板，设计引物Ker-F/Ker-R扩增角蛋白酶基因ker的基因簇序列(SEQ ID NO. 3所示，包括启动子、基因和终止子)，得到ker基因片段1713bp；
2.采用EcoRI和XbaI对得到的ker基因进行酶切，得到酶切后的双酶切片段；
3.采用EcoRI和XbaI对芽胞杆菌表达载体pHY300PLK进行双酶切，得到双酶切载体片段；
4.将步骤2和3得到的双酶切片段和双酶切载体经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产 物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗 性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为： pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1965bp处出现电泳条带，说明表达 载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：游离表达载体pHY-Ker)；
Ker-F：CGGAATTCTTTACAAACGCAGTTTCGAGGCA
Ker-R：GCTCTAGATGATCTCATAAAATAAATGAATAG.
实施例3：
两种表达外源蛋白基因工程菌的构建及应用：
将绿色荧光蛋白游离表达载体pHY-GFP(将GFP序列(SEQ ID NO.4所示)通过ExnaseⅡT5外切的方法，插入到pHY300PLK中，获得质粒pHY-GFP。)、红色荧光蛋白游 离表达载体pHY-RFP(将RFP(SEQ ID NO.5所示)序列通过ExnaseⅡT5外切的方法， 插入到pHY300PLK中，获得质粒pHY-RFP。)分别电转入地衣芽孢杆菌WX-02Δxpt中， 以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以pHY-F和pHY-R作为验证引物，P CR验证得到阳性转化子，获得绿色荧光蛋白表达菌株地衣芽孢杆菌WX-02Δxpt/pHY-GFP、 红色荧光蛋白表达菌株地衣芽孢杆菌WX-02Δxpt/pHY-RFP。
其中pHY-F和pHY-R的序列为：
pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC；
pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC。
本实施例，同时将绿色荧光蛋白游离表达载体pHY-GFP、红色荧光蛋白游离表达载体p HY-RFP分别电转入地衣芽孢杆菌WX-02中，以上述相同的方法筛选出基因工程菌绿色荧 光蛋白表达菌株地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-GFP、红色荧光蛋白表达菌株地衣芽孢杆菌WX- 02/pHY-RFP作为对照。
本实施例通过向4种不同的发酵培养基中，分别接种上述四种外源蛋白基因工程菌，以 考察不同的培养基对目标产物的影响，以及验证缺失了xpt基因的地衣芽孢杆菌确实能提高 外源蛋白的表达量。每组3个重复。
种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于 装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；
生产发酵的具体步骤为：
向500mL三角瓶中装入50mL的发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0) 以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养24小时，得到生产发酵的菌液。
所述的发酵培养基为LB培养基或M9改良培养基；
M9改良培养基的配方如下：
Figure BDA0003297818290000061
Figure BDA0003297818290000071
3种培养基中其他成分均为：1ml/LTrace Metal Mix A5母液；其余为水pH 7.0。
所述的Trace Metal Mix A5母液的配方为：2.86g/L H3BO3，1.81g/L MnCl2·4H2O，0. 222g/L ZnSO4·7H2O，0.39g/L NaMoO4·2H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O和49.4mg/LCo (NO3)2·6H2O，其余为水。
取上述发酵液750ml于2ml离心管，加入1.5ml PBS缓冲液混匀，8000rpm、5min离心去上清，向2ml离心管中加入2ml PBS缓冲液，重悬菌体，8000rpm、5min离心去上清， 重复上述操作两次，最后用2ml PBS缓冲液重悬菌体，用酶标仪检测重悬液的荧光强度和 生物量OD600，最终结果为相对荧光强度，计算公式为相对荧光强度＝荧光强度/生物量；单 位为FL/OD600。
Figure BDA0003297818290000072
实施例4：
两种表达外源蛋白基因工程菌的构建及应用：
将碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE、角蛋白酶游离表达载体pHY-Ker分别电转入地 衣芽胞杆菌WX-02Δxpt中，以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选，以pHY-F和pHY-R作为验证引物，PCR验证得到阳性转化子，获得碱性蛋白酶表达菌株地衣芽胞 杆菌WX-02Δxpt/pHY-AprE、角蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02Δxpt/pHY-Ker；
本实施例，将碱性蛋白酶游离表达质粒pHY-AprE、角蛋白酶游离表达载体pHY-Ker、 分别电转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以上述相同的方法筛选出基因工程菌碱性蛋白酶表达 菌株地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-AprE、角蛋白酶表达菌株地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-Ker作 为对照。
本实施例通过向发酵培养基中，接种上述四种外源蛋白基因工程菌，以考察发酵培养基 对目标产物的影响，以及验证缺失了xpt基因的地衣芽胞杆菌确实能提高外源蛋白的表达量。 所述的发酵培养基为蛋白酶发酵培养基；
蛋白酶发酵培养基的配方如下：
Figure BDA0003297818290000081
其余为水，pH 7.0。
种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于 装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；
生产发酵的具体步骤为：
向500mL三角瓶中装入50mL的发酵培养基，然后将种子培养的菌液(OD600 4.0-5.0) 以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。
上述两种蛋白酶酶活测定参照中华人民共和国国家标准中所描述的福林法进行。
一个单位酶活(U)定义为：一定温度、一定pH条件下，蛋白酶液在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。
其中标准曲线的测定：将标准酪氨酸溶液配置成等梯度的溶液(10、20……80、90、10 0μg/mL)，进行上述文献中的反应。
样品的蛋白酶活力计算公式＝A×4×N/10
A—样品在分光光度计660nm处测得的数值经标准曲线计算而得的酪氨酸微克数；
N—蛋白酶原液经稀释的倍数；
10—蛋白酶液与酪蛋白的反应时间(min)。
Figure BDA0003297818290000091
序列表
<110> 湖北大学
<120> 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaaaagc taaaacgaaa aattgcagag catggcacgg tgttgtctga cgaagtgctg 60
aaagttgatt catttttaaa tcatcaaatc gatccggaat taatgcttgc tgtgggcgaa 120
gagtttgcct cgcttttccg ggaggaaggc gtcacgaaga ttgtgacgat cgaatcctca 180
ggcatcgcac ctgccgtgat ggcaggcttg aagctgggcg tgccggtagt atttgcaaga 240
aagcgtcaat cgcttacctt aacggaaaat ctgttgacgg cttctgtcta ttcatttaca 300
aaaaaaacgg aaagtacgat tgccgtatca gccagccatc tttcaaagga tgacaaagtt 360
ctgatcatcg acgatttttt ggcaaacgga caagcggcga aagggctcgt ttccatcatt 420
gaacaggccg gcgcaaaggt gtgcggaatc gggattgtta tcgaaaaatc attccagacg 480
ggcagggagg agcttgacaa tcttggaatc agagtcgaat cccttgcgcg tattgcatcc 540
cttgccgatg gaaaagttac ctttttacag gaggttgggt catga 585
<210> 2
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatctcata aaataaatga atagtatttt cataaaatga atcagatgga gcaatctcct 60
gtcattcgcg gccctcggga cctctttccc tgccaggctg aagcggtcta ttcatacttt 120
cgaactgaac atttttctaa aacagttatt aataaccaaa aaattttaaa ttggtcctcc 180
aaaaaaatag gcctaccata taattcattt tttttctata ataaattaac agaataattg 240
gaatagatta tattatcctt ctatttaaat tattctgaat aaagaggagg agagtgagta 300
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttcatgct cgtgttcacg 360
atggcattca gcgattccgc ttctgctgct caaccggcga aaaatgttga aaaggattat 420
attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatctgtca aaaaggacat catcaaagag 480
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 540
aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 600
gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 660
gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 720
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 780
tataacaccg acggcaacgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 840
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 900
aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 960
aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 1020
caggcagtcg acaatgcata tgcaaaaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 1080
ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 1140
gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 1200
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 1260
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1320
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1380
ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1440
catattctaa caaatagcat atagaaaaag ctagtgtttt tagcactagc tttttcttca 1500
ttctgatgag ggttgttcaa tattttgaat ccgttccatg atcgtcggat ggccgtattt 1560
aaaaatcttg acgagaaacg gcgggtttgc ctcgctcagc ccggcttttg agagctcttg 1620
aaacgtcgaa accgctgcat cgctgttttg cgtcagttca atcgcatact ggtcagcagc 1680
tttttcctga tgcctcgaaa ctgcgttcgt aaatggagac gacgcgaaag agatgacccc 1740
<210> 3
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttacaaacg cagtttcgag gcatcaggaa aaagccgctg accagtatgc gattgaactg 60
acgcaaaaca gcgatgcagc ggtttcgacg tttcaagagc tctcaaaagc cgggctgagc 120
gaggcaaacc cgccgtttct cgtcaagatt tttaaatacg gccatccgac gatcatggaa 180
cggattcaaa atattgaaca gtcttcatca gaatgaagaa aaagctagtg ctaaaaacac 240
tagctttttc tatatgctat ttgttagaat atgttattga gcggcagctt cgacattgat 300
cagacctttc ccatagtaga aggagcttcc caaataagtc gccgtgctgg agagacggtt 360
gcggacttgt gaagctgaaa ggttcggatg ttttgacaag atcaaagctg ctgctcccgc 420
tacatgagga gaagccattg acgttccgtt caatgttgca taagtgttcg ttgggtaagt 480
gctgtatacg cctgcgccag gagccatgac ttcaagctct gctcccacac tggaaaatga 540
agctctgttg ctgttagagt ctaccgcgcc aacagcgatg acagaatcgt atttcgcagg 600
atagccaatt gtattcgtgt ttcctgaaga tccgctgttc cctgctgcag ctacaacgac 660
aacccctctt gcatatgcat tgtcgactgc ctgtttcatc gctgtcgagc ctgatgctcc 720
cccaaggctc atattgataa catccatgcc gtttgttgtc gcccactcga ttccgcttac 780
aatgccgctg tatgatccgc ttccgcttga attcagtact ttaaccgcgt acaaggatac 840
gcttggcgca acgcctaata cacccgttgt attgtcaagc gcagctactg taccggcaac 900
atgtgtgccg tgtccgttgc cgtcggtgtt ataagcttcg ccagccacaa agcttgctcc 960
gccgactacg ttcaagtccg gatgagaagc ttggattcct gtatccagga cggctacttt 1020
tacattcgct cccttaaagc cttgagcctg cactttgtcc gctttaatga gaggaatgcc 1080
gtaaggaacg gtttgcgcca aggcatgggc cacatgatcc tcttccacat aagcgacatc 1140
cggatcattt ttgacttcct taagcgcttc tttgtctagc ttcgcttttg ccgcgttgat 1200
gattctaaac tgcttgtcca cttttccgcc gctctctttg atgatgtcct ttttgacaga 1260
tgcggttttc actcctgact taaatccgac aatataatcc ttttcaacat ttttcgccgg 1320
ttgagcagca gaagcggaat cgctgaatgc catcgtgaac acgagcatga aggccgtcag 1380
catcccaagc caaaaactct ttttcctcat cattactcac tctcctcctc tttattcaga 1440
ataatttaaa tagaaggata atataatcta ttccaattat tctgttaatt tattatagaa 1500
aaaaaatgaa ttatatggta ggcctatttt tttggaggac caatttaaaa ttttttggtt 1560
attaataact gttttagaaa aatgttcagt tcgaaagtat gaatagaccg cttcagcctg 1620
gcagggaaag aggtcccgag ggccgcgaat gacaggagat tgctccatct gattcatttt 1680
atgaaaatac tattcattta ttttatgaga tca 1713
<210> 4
<211> 1558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgcgattt cggcgagatt caagcccggg tctaatctat ttttccttct tcggacgctt 60
caaaaattac ttttattata atcggaacag tgttttttag atcttttgat ctatttggtg 120
tttatcttgt ctcataaata catgtttaaa caatgtaaaa tataaaatat ccaattcata 180
aaaaattaac cattattaaa caatattcct atggaaaata atgattattt ttgataatct 240
gttttcacaa gacggaggtt caataaaaaa tcggtaaaag agcaactaca gaccaatatt 300
atggtgaatc attcagaata aggacggagg attcacgatg gtcagcaaag gcgaagaact 360
gtttacgggc gtcgtcccga tcctggtcga actggatggc gatgtcaacg gccataaatt 420
tagcgtcagc ggcgaaggcg aaggcgatgc gacgtatggc aaactgacgc tgaaatttat 480
ctgcacgacg ggcaaactgc cggtcccgtg gccgacgctg gtcacgacgc tgacgtatgg 540
cgtccaatgc tttagcagat atccggatca tatgaaacaa catgattttt ttaaaagcgc 600
gatgccggaa ggctatgtcc aagaaagaac gatctttttt aaagatgatg gcaactataa 660
aacgagagcg gaagtcaaat ttgaaggcga tacgctggtc aacagaatcg aactgaaagg 720
catcgatttt aaagaagatg gcaacatcct gggccataaa ctggaatata actataacag 780
ccataacgtc tatatcatgg cggataaaca aaaaaacggc atcaaagtca actttaaaat 840
cagacataac atcgaagatg gcagcgtcca actggcggat cattatcaac aaaacacgcc 900
gatcggcgat ggcccggtcc tgctgccgga taaccattat ctgagcaagc aaagcgcgct 960
gagcaaagat ccgaacgaaa aaagagatca tatggtcctg ctggaatttg tcacggcggc 1020
gggcatcacg ctgggcatgg atgaactgta taaataaaag agcagagagg acggatttcc 1080
tgaaggaaat ccgttttttt attttgcccg tcttataaat ttctttgatt acattttata 1140
attaatttta acaaagtgtc atcagccctc aggaaggact tgctgacagt ttgaatcgca 1200
taggtaaggc ggggatgaaa tggcaacgtt atctgatgta gcaaagaaag caaatgtgtc 1260
gaaaatgacg gtatcgcggg tgatcaatca tcctgagact gtgacggatg aattgaaaaa 1320
gcttgttcat tccgcaatga aggagctcaa ttatataccg aactatgcag caagagcgct 1380
cgttcaaaac agaacacagg tcgtcaagct gctcatactg gaagaaatgg atacaacaga 1440
accttattat atgaatctgt taacgggaat cagccgcgag ctggaccgtc atcattatgc 1500
tttgcagctt gtcacaagga aatctctcaa tatcggccag tgcgacggca ttattgcg 1558
<210> 5
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcag atctgaaagg aggaaggatc aatggtttcc 300
aaaggagaag aaaataatat ggcaatcatt aaagaattta tgcgattcaa agttcatatg 360
gaaggcagtg ttaacggcca cgagtttgaa atcgaaggcg aaggggaagg aagaccctac 420
gaagcattcc agacagccaa gctgaaagtt acaaaaggcg gcccgctgcc tttcgcctgg 480
gatatattat cacctcaatt tatgtacggt tcaaaggttt atatcaaaca tcctgcggac 540
ataccggact atttcaaatt aagtttccca gaaggttttc gctgggagcg cgtgatgaat 600
tttgaagacg gcggtatcat tcacgttaat caggactcct cgcttcaaga tggggtgttt 660
atctacaagg tcaagctgcg cggcactaac ttcccctctg acggtccagt catgcaaaaa 720
aaaaccatgg gctgggaagc gtctgaagag cggatgtacc cggaagacgg tgcactgaaa 780
agtgaaatca aaaaaagatt aaagttaaaa gatggcggtc attatgcggc cgaggtgaaa 840
acgacctaca aagcaaagaa gccagtgcaa ctacctggtg cttacattgt tgacatcaag 900
ctggacatcg tgagtcacaa tgaagattac accattgttg aacagtatga acgagctgaa 960
ggacgtcact ccaccggcgg gatggatgaa ctatataaaa agagcagaga ggacggattt 1020
cctgaaggaa atccgttttt ttattttgcc cgtcttataa atttctttga ttacatttta 1080
taattaattt taacaaagtg tcatcagccc tcaggaagga cttgctgaca gtttgaatcg 1140
cataggtaag gcggggatga aatggcaacg ttatctgatg tagcaaagaa agcaaatgtg 1200
tcgaaaatga cggtatcgcg ggtgatcaat catcctgaga ctgtgacgga tgaattgaaa 1260
aagcttgttc attccgcaat gaaggagctc aattatatac cgaactatgc agcaagagcg 1320
ctcgttcaaa acagaacaca ggtcgtcaag ctgctcatac tggaagaaat ggatacaaca 1380
gaaccttatt atatgaatct gttaacggga atcagccgcg agctggaccg tcatcattat 1440
gctttgcagc ttgtcacaag gaaatctctc aatatcggcc agtgcgacgg cattattgcg 1500
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctggaccgt catcattaaa atcgctgctg ccttca 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagagcatg gcacggtgtg ccgatggaaa agttac 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaacttttc catcggcaca ccgtgccatg ctctgc 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttgcccaag cttctagaaa aaaccgttgg acatca 36
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtgatagcg gtaccattga ttccgcacac ctttgcgcgt tttagagcta gaaatag 57
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgaaggcagc agcgatttta atgatgacgg tccagc 36
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aatggtaccg ctatcacttt atat 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctagaagct tgggcaaagc gtttt 25
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtttattatc cataccctta c 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagatttcgt gatgcttgtc 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacgatcagc acgaggga 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgcttcatat ttgtcatt 18
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cggaattctg atctcataaa ataaatgaat agt 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctctagagg ggtcatctct ttcgcgtcgt 30
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cggaattctt tacaaacgca gtttcgaggc a 31
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctctagatg atctcataaa ataaatgaat ag 32

Claims (6)

1.缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在异源蛋白生产中的应用，所述的xpt基因为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的异源蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、碱性蛋白酶或角蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌WX-02。
4.权利要求1所述应用中的缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌的构建方法，包括下述步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出上游同源臂和xpt基因的下游同源臂，以CRISPR-Cas9n敲除质粒为模板，PCR扩增出xpt基因的sgRNA；
（2）通过重叠延伸PCR将xpt基因的sgRNA、上游同源臂和xpt基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）以CRISPR/Cas9n质粒为模板，扩增得到pHY-cas9n骨架；
（4）采用Exnase Ⅱ T5外切酶对步骤（2）中的目的基因片段和步骤（3）中的骨架进行酶切酶连得到敲除质粒pHY-cas9n-Δxpt；
（5）将敲除质粒pHY-cas9n-Δxpt转入地衣芽孢杆菌中，筛选得到阳性转化子；
（6）将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，既得。
5.根据权利要求1所述的应用，当采用缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基为M9改良培养基或LB培养基；
M9改良培养基的配方为：50-90 g/L葡萄糖、4-6 g/L酵母粉、0.4-0.6 g/L氯化钠、0.8-1.2 g/L氯化铵、0.01-0.02 g/L氯化钙、2-5 g/L KH2PO4、15-19 g/L Na2HPO4·12H2O、0.3-0.6 g/L MgSO4·7H2O和1 ml/L Trace Metal Mix A5母液；pH 6.8~7.4；
所述的Trace Metal Mix A5母液的配方为：2.86 g/L H3BO3，1.81 g/L MnCl2·4H2O，0.222 g/L ZnSO4·7H2O，0.39 g/L NaMoO4·2H2O，0.079 g/L CuSO4·5H2O和49.4 mg/L Co(NO3)2·6H2O，其余为水。
6.根据权利要求1所述的应用，当采用缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌生产碱性蛋白酶、角蛋白酶时，所用的发酵培养基为： 5-20g/L葡萄糖、3-5g/L骨蛋白胨、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K2HPO4，4-8g/L(NH4)2SO4，其余为水，pH 6.8~7.4。
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