CN114806899B

CN114806899B - 一种生产l-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用

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Publication number: CN114806899B
Application number: CN202210392087.6A
Authority: CN
Inventors: 王玮; 陈雨蒙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114806899A

Abstract

本发明公开了一种生产L‑苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用，属于生物工程领域。本发明公开一种里氏木霉工程菌，其是以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株经过基因改造导入四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶表达的基因，使不具备生产L‑苹果酸的所述出发菌株能够生产L‑苹果酸。本发明获得的工程菌株能以葡萄糖、甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或葡萄糖/β‑二糖混合物等常见碳源，直接发酵生产大量L‑苹果酸，其最高产量可达100g/L。本发明为微生物来源的L‑苹果酸的生产提供了新的方法，可应用于L‑苹果酸的工业化生产。

Description

一种生产L-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种生产L-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用。

背景技术

L-苹果酸作为一种重要的四碳二元羧酸，主要用于食品、医药等行业。在食品行业，由于其酸味持久柔和、解渴爽口、风味别致、性质稳定，主要用作食品、饮料中的酸味剂，是目前世界食品行业中公认的安全、无毒无害的食用有机酸。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、尿毒症、贫血等多种疾病。此外，L-苹果酸常被配入复合氨基酸注射液中促进氨基酸的吸收。因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。美国能源部将苹果酸作为可通过微生物发酵生产的12种平台化合物之一。

传统化学方法合成的产品为外消旋的D/L-苹果酸混合物，限制了其在食品和医药行业的应用；以微生物发酵生产纯的L-苹果酸具有较好经济和社会效益，受到研究者的广泛关注和高度重视。

里氏木霉的优势：里氏木霉作为重要的工业生产菌株，是GRAS(GenerallyRegarded as Safe)菌株，已被广泛应用于食品、饲料等发酵行业。然而由于里氏木霉菌株不能生产L-苹果酸，因此，本发明通过代谢工程改造，构建里氏木霉工程菌株用于L-苹果酸的发酵生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产L-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该工程菌可以生产大量的L-苹果酸，为微生物来源的L-苹果酸提供了新的方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种里氏木霉工程菌，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备生产L-苹果酸的所述出发菌株能够生产L-苹果酸。

优选的是，所述里氏木霉工程菌导入正调控四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶表达的基因，使所述里氏木霉工程菌具备生产L-苹果酸的功能。

优选的是，所述里氏木霉包括里氏木霉菌株QM6a(购买于美国模式培养物集存库ATCC 13631)，QM9414(购买于美国模式培养物集存库ATCC 26921)，Rut-C30(购买于美国模式培养物集存库ATCC 56765)，RL-P37(美国农业研究菌种保藏中心NRRL15709)，NG14(购买于美国模式培养物集存库ATCC 56767)，PC-3-7(购买于美国模式培养物集存库ATCC66589)。

本发明还提供一种所述的里氏木霉工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将包含四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶编码基因的载体转入里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌中，获得表达四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶的菌株，即为所述里氏木霉工程菌。

优选的是，所述四碳二元羧酸转运蛋白源自于米曲霉或裂殖酵母注释的具有表达四碳二元羧酸转运功能的蛋白编码基因。

优选的是，所述丙酮酸羧化酶源自于米曲霉注释的具有表达丙酮酸羧化酶功能的蛋白编码基因。

本发明还提供一种生产L-苹果酸的方法，利用所述的里氏木霉工程菌孢子接种于液体培养基，在28℃条件下震荡培养，获取L-苹果酸。优选的是，接种量按照10⁸个孢子/50mL的接种量接种液体培养基。

优选的是，所用培养基包括以下浓度组分：碳源40-100g/L，蛋白胨1-6g/L，KH₂PO₄0.15g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，CaCl₂·2H₂O 0.10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.10g/L，碳酸钙80g/L，NaCl 0.05g/L，1mL/L微量元素液；所述微量元素包括以下浓度的组分：1.6gMnSO₄·4H₂O，5g FeSO₄·7H₂O，2g CoCl₂·6H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，用水溶解并定容至1L。

优选的是，所述碳源包括甘油、葡萄糖、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或者葡萄糖/β-二糖混合物任一种。

本发明还提供一种所述的里氏木霉工程菌，或者所述的方法在生产L-苹果酸方面的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以里氏木霉菌为出发菌株，经过基因改造，使改造后的菌株能够表达四碳二元羧酸转运蛋白和丙酮酸羧化酶，使原先不具备L-苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效合成分泌L-苹果酸的工程菌株。本发明获得的工程菌株能以葡萄糖、甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或葡萄糖/β-二糖混合物等常见碳源，直接发酵生产大量L-苹果酸，其最高产量可达100g/L。本发明为微生物来源的L-苹果酸的生产提供了新的方法，可应用于L-苹果酸的工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中表达质粒构建流程图；A：Aomae1表达载体；B：Spmae1表达载体；C：Aopyc表达载体；

图2为本发明中以葡萄糖为碳源时，基因工程菌株的L-苹果酸产量；

图3为本发明中以甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素、葡萄糖/β-二糖混合物为碳源时，基因工程菌株TrMM004的L-苹果酸产量。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

实施例1基因工程菌的L-苹果酸发酵

将基因工程菌接种至250mL三角瓶中的50mL以甘油、葡萄糖、木糖、液化淀粉(Huang et al.Direct production of itaconic acid from liquefied corn starch bygenetically engineered Aspergillus terreus.Microbial Cell Factories 2014,13:108)、微晶纤维素或葡萄糖/β-二糖混合物(Li et al.Overproduction of cellulase byTrichoderma reesei RUT C30through batch-feeding of synthesized low-cost sugarmixture.Bioresource Technology.2016,216:503–510)为碳源的培养基中(配方：碳源100g/L，蛋白胨6g/L，KH₂PO₄ 0.15g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，CaCl₂·2H₂O 0.10g/L，MgSO₄·7H₂O0.10g/L，碳酸钙80g/L，NaCl0.05g/L，1mL/L微量元素液。微量元素配方(1000mL)：1.6gMnSO₄·4H₂O，5gFeSO₄·7H₂O，2g CoCl₂·6H₂O,1.4g ZnSO₄·7H₂O，溶于水中，定容至1L)，接种量为10⁸个孢子/50mL培养基，28℃，220rpm培养，第八天取样测定L-苹果酸含量。

实施例2L-苹果酸含量测定

取按照实施例1发酵的发酵液于离心管中，加入1倍体积的2mol/L H₂SO₄，放入80℃，100rpm的水浴摇床震荡30min，待发酵液中的碳酸钙溶解完全后，将发酵液与管壁上的水珠混匀后，取1mL液体于1.5mL离心管中，14000×g离心30min，吸取上清，测定L-苹果酸含量。

处理后的样品用高效液相色谱(HPLC)测定L-苹果酸含量：流动相：5mM H₂SO₄；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；检测器：紫外检测器；波长：210nm；柱子：AmineX HPX-87X，(300mm×7.8mm)。

实施例3在里氏木霉中表达米曲霉来源的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因Aomae1

1、Aomae1基因表达载体(pOEAomae1)的构建

1)利用引物Ppdc-F和Ppdc-R，以里氏木霉基因组为模板扩增Ppdc序列；

Ppdc-F：5’-ACTAGTGAGCTCATTTATGAAAGGAGGGAGCATTCTTCGA-3’；

Ppdc-R：5’-CATGATTGTGCTGTAGCTGCGC-3’。

扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO₄ 3μL；引物(10μM each)1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。

反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。

2)利用引物Aomae1-1和Aomae1-2，以密码子优化的Aomae1质粒为模板扩增Aomae1序列；

Aomae1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGTTCAACAACGAGCACCACAT-3’；

Aomae1-2：5’-CCGGTCACGAAAGCCTCAGTCGCTGACGTCCTCG-3’。

3)利用引物Tcbh2-1和Tcbh2-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Tcbh2序列；

Tcbh2-1：5’-GGCTTTCGTGACCGGGCTT-3’；

Tcbh2-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTTGGGTATGGTTTCCACGTGCA-3’。

反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃15sec，运行30个循环；68℃5min。

4)以LML2.0a(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering andcontrol of non-homologous end-joining in industrial eukaryoticmicroorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme One StepClone Kit进行同源重组，构建Ppdc-Aomae1-Tcbh2表达框，得到Aomae1表达载体(图1A)。

其中，Aomae1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Aomae1的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，Ppdc的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Tcbh2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

>SEQ ID NO.1

MFNNEHHIPPGSSHSDIEMLTPPKFEDEKQLGPVGIRERLRHFTWAWYTLTMSGGGLAVLIISQPFGFRGLREIGIAVYILNLILFALVCSTMAIRFILHGNLLESLRHDREGLFFPTFWLSVATIICGLSRYFGEESNESFQLALEALFWIYCVCTLLVAIIQYSFVFSSHKYGLQTMMPSWILPAFPIMLSGTIASVIGEQQPARAALPIIGAGVTFQGLGFSISFMMYAHYIGRLMESGLPHSDHRPGMFICVGPPAFTALALVGMSKGLPEDFKLLHDAHALEDGRIIELLAISAGVFLWALSLWFFCIAIVAVIRSPPEAFHLNWWAMVFPNTGFTLATITLGKALNSNGVKGVGSAMSICIVCMYIFVFVNNVRAVIRKDIMYPGKDEDVSD。

>SEQ ID NO.2

atgttcaacaacgagcaccacatcccccccggcagctcgcactccgacatcgagatgctgacgccccccaagttcgaggacgagaagcagctgggccccgtcggcatccgcgagcgcctgcgccacttcacgtgggcctggtacacgctcaccatgagcggcggcggcctggccgtcctgatcatctcccagcccttcggcttccgcggcctccgcgagatcggcatcgccgtctacatcctcaacctgatcctgttcgccctggtctgctcgacgatggccatccgcttcatcctccacggcaacctcctggagagcctgcgccacgaccgcgagggcctgttcttccccaccttctggctctcggtcgccacgatcatctgcggcctctcgcgctacttcggcgaggagtccaacgagtcgttccagctggccctggaggccctgttctggatctactgcgtctgcacgctgctggtcgccatcatccagtactcgttcgtcttcagctcgcacaagtacggcctccagaccatgatgccctcgtggattctccccgccttccccatcatgctctcgggcacgatcgccagcgtcatcggcgagcagcagcccgcccgcgccgccctccccatcatcggcgccggcgtcacgttccagggcctgggcttctcgatctcgttcatgatgtacgcccactacatcggccgcctgatggagtcgggcctgccccactccgaccaccgccccggcatgttcatctgcgtcggcccccccgccttcaccgccctcgccctggtcggcatgagcaagggcctccccgaggacttcaagctgctgcacgacgcccacgccctggaggacggccgcatcatcgagctgctggccatcagcgccggcgtcttcctgtgggccctctcgctgtggttcttctgcatcgccatcgtcgccgtcatccgcagcccccccgaggccttccacctcaactggtgggcaatggtcttccccaacacgggcttcacgctggccacgatcacgctgggcaaggccctgaactcgaacggcgtcaagggcgtcggcagcgccatgtcgatctgcatcgtctgcatgtacatcttcgtcttcgtcaacaacgtccgcgccgtcatccgcaaggacatcatgtaccccggcaaggacgaggacgtcagcgactag。

>SEQ ID NO.3

atgaaaggagggagcattcttcgacttgcggcaattgcatgcacatgtacgattggaagcgcgggcgatgtattcgcaatcatgtttagaaggacggcgtttggaaacgttgggatgctgttgaagcgttggaaacaggggcaattagaaacaccgagccagacagagtcaatggtacgaggtcagccagtatcatgacctgtgtgcgcatggtggcgagagattccgagccatgccacgggagacgagcaatgaaaaaactcttcactcacttgtcgaggctctctcaacctatcgacttatcaagtagacgatgaaagccttgcaactgtggtgatgtggctcatcaatgtgcgacgtcgtatccatgtctgaggccattcgatatcgtgatgcgactacctagtaaagcccggccagagggcaaaccggggcgacaggggcaggcaattgaccggatggctgcatgtgccgaagcagccccgatggaatcgagatgtctgtcggatggaccgctgagcggcctggcaaggtgtcccagatacgaagatggaagtgaagtcagaggtggtcgttaattgtccgacgagcgaatcggccgctccttcggattgccggctctgctgtatgtaccgtgcatgaagccacccgggatccatgttacgatggataggttccaactctctagtagctatagtggacctgaggctatctagtatcactggaggagcagccgtccactatcgtcgagcgctgtagaagcagctgcattagcggctgcccacccgcgcagaaatggccccattacatcactatcatgacagcggcgcgtccaaaagtgagctcatgcttgccgatggcacgagcagctgcaactggcggggctcctgcctgccgtctccggtgccgctgcccatttgagtttgtccgagctgttgatggttgaaaccgagaccgatggatgattcaacacttcgaagtctaggtagataaaaaacatctatatatcctcattcattgccctgtcagtgtgttggctcacgtctccaatcctccgcccctcctcctgcaaagtaaataccttctcaaaacacgtctggaatcctgcaagtctccatcacaaggagcttcttcatcaaccaccttatacgagcaacatcatttgcatcatcgttgatccacatctcctcgcgcctcagagtgtcgtcaccagtataaataaccgcatcaagctctcgtccttcttcgttccacaatccaagaagcacctcaaaacgatcaaagcagcgcagctacagcacaatc。

>SEQ ID NO.4

ggctttcgtgaccgggcttcaaacaatgatgtgcgatggtgtggttcccggttggcggagtctttgtctactttggttgtctgtcgcaggtcggtagaccgcaaatgagcaactgatggattgttgccagcgatactataattcacatggatggtctttgtcgatcagtagctagtgagagagagagaacatctatccacaatgtcgagtgtctattagacatactccgagaataaagtcaactgtgtctgtgatctaaagatcgattcggcagtcgagtagcgtataacaactccgagtaccagcaaaagcacgtcgtgacaggagcagggctttgccaactgcgcaaccttgcttgaatgaggatacacggggtgcaacatggctgtactgatccatcgcaaccaaaatttctgtttatagatcaagctggtagattccaattactccacctcttgcgcttctccatgacatgtaagtgcacgtggaaaccataccca。

2、将表达载体pOEAomae1导入里氏木霉，获得Aomae1基因表达工程菌株

本发明所述表达或异源表达，是农杆菌介导里氏木霉转化及克隆筛选，将相关基因整合到里氏木霉基因组进行表达。本发明所述转化方法为根瘤农杆菌介导的结合转移。

1)将质粒pOEAomae1电转至农杆菌，然后将含有质粒pOEAomae1的农杆菌与里氏木霉宿主菌株QM6a(ATCC 13631)，QM9414(ATCC 26921)，Rut-C30(ATCC56765)，RL-P37(NRRL15709)，NG14(ATCC 56767)，PC-3-7(ATCC 66589)在IM平板(Covert et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Fusariumcircinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至转化子长出菌丝和孢子，然后进行筛选和验证。

2)将上述验证的转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的培养基(见实施例1)中，接种量为10⁸个孢子/50mL培养基，28℃，220rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量。

3)Aomae1在里氏木霉菌株中大量表达时，均能显著发酵生产L-苹果酸。其中产量最高的菌株命名为TrMM001，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量可达到60g/L(图2)。

4)筛选标记缺失：选取TrMM001菌株进行筛选标记缺失。所述筛选标记缺失方法为：将获得的阳性重组里氏木霉菌株接种于木糖PDA液体培养基(含20g/L木糖，100g/L土豆水，无琼脂)中诱导抗性基因缺失，28℃、200rpm摇床培养48h后，挑取少量菌丝点到木糖PDA固体培养基(含20g/L木糖，100g/L土豆水，20g/L琼脂)平板上，在28℃下培养5-7天，收集孢子。孢子按浓度梯度稀释至木糖PDA固体培养基平板上。28℃下培养48h，选择合适的孢子浓度，使里氏木霉菌株可以单克隆的形式，从木糖PDA固体培养基平板上长出。挑取有里氏木霉单克隆菌株的琼脂块于葡萄糖PDA固体培养基(含20g/L葡萄糖，100g/L土豆水，20g/L琼脂)平板上，28℃下培养24h，使琼脂块中的真菌菌丝蔓延到平板上。再挑取此琼脂块至抗性PDA孔板(含20g/L葡萄糖，100g/L土豆水，20g/L琼脂，150μg/ml潮霉素和150μg/ml头孢霉素)，28℃下培养48h，验证抗性缺失是否成功：若不能在抗性PDA孔板中生长，说明抗性发生缺失。挑取琼脂块后的PDA平板，继续在28℃下培养4-6天，让蔓延出来的菌丝充分生长，并生产出孢子，收集抗性缺失菌株的孢子。该菌株即为无抗性标记的Aomae1基因大量表达菌株TrMM002，葡萄糖为碳源时其L-苹果酸产量也可达到60g/L(图2)。

实施例4在里氏木霉中表达裂殖酵母来源的四碳二元羧酸转运蛋白编码基因Spmae1

1、Spmae1基因表达载体(pOESpmae1)的构建；

1)利用引物Spmae1-1和Spmae1-2，以密码子优化的Spmae1质粒为模板扩增Spmae1序列；其中，Spmae1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，Spmae1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

Spmae1-1：5’-AGCTACAGCACAATCATGGGCGAGCTGAAGGAGAT-3’；

Spmae1-2：5’-CCGGTCACGAAAGCCTCAGACCGACTCGTGCTCG-3’。

>SEQ ID NO.5

MGELKEILKQRYHELLDWNVKAPHVPLSQRLKHFTWSWFACTMATGGVGLIIGSFPFRFYGLNTIGKIVYILQIFLFSLFGSCMLFRFIKYPSTIKDSWNHHLEKLFIATCLLSISTFIDMLAIYAYPDTGEWMVWVIRILYYIYVAVSFIYCVMAFFTIFNNHVYTIETASPAWILPIFPPMICGVIAGAVNSTQPAHQLKNMVIFGILFQGLGFWVYLLLFAVNVLRFFTVGLAKPQDRPGMFMFVGPPAFSGLALINIARGAMGSRPYIFVGANSSEYLGFVSTFMAIFIWGLAAWCYCLAMVSFLAGFFTRAPLKFACGWFAFIFPNVGFVNCTIEIGKMIDSKAFQMFGHIIGVILCIQWILLMYLMVRAFLVNDLCYPGKDEDAHPPPKPNTGVLNPTFPPEKAPASLEKVDTHVTSTGGESDPPSSEHESV。

>SEQ ID NO.6

atgggcgagctgaaggagatcctgaagcagcgctaccacgagctgctcgactggaacgtcaaggccccccacgtccccctctcgcagcgcctcaagcacttcacgtggtcgtggttcgcctgcacgatggccacgggcggcgtcggcctgatcatcggctcgttccccttccgcttctacggcctcaacacgatcggcaagatcgtctacatcctccagattttcctgttctcgctgttcggctcgtgtatgctgttccgcttcatcaagtacccctcgacgatcaaggactcgtggaaccaccaccttgaaaagctgttcatcgccacgtgcctgctcagcatcagcaccttcatcgacatgctggccatctacgcctaccccgacacgggcgagtggatggtctgggtcatccgcatcctctactacatctacgtcgccgtgtcgttcatctactgcgtcatggccttcttcacgatcttcaacaaccacgtctacacgatcgagaccgccagccccgcctggatactgcccatcttcccccccatgatctgcggcgtcatcgccggcgccgtcaactcgacgcagcccgcccaccagctgaagaacatggtcatcttcggcatcctgttccagggcctgggcttctgggtctacctgctgctgttcgccgtcaacgtcctccgcttcttcaccgtcggcctggccaagccccaggaccgccccggcatgttcatgttcgtcggcccccccgccttctccggcctcgccctgatcaacatcgcccgcggcgcaatgggcagccgcccctacatcttcgtcggcgccaacagctccgagtacctgggctttgtatcgacgttcatggccatcttcatctggggcctggccgcctggtgctactgcctggctatggtatcgttcctggccggcttcttcacgcgcgcccccctcaagttcgcctgcggctggttcgccttcatcttccccaacgtcggcttcgtcaactgcacgatcgagatcggcaagatgatcgactccaaggccttccagatgttcggccacatcatcggcgtcatcctgtgcatccagtggattctcctgatgtacctgatggtccgcgccttcctggtcaacgacctctgctaccccggcaaggacgaggacgcccaccccccccccaagcccaacacgggcgtcctgaaccccaccttcccccccgagaaggcccccgcctcgctggagaaggttgatacgcacgtcaccagcacgggcggcgagagcgacccccccagctccgagcacgagtcggtctga。

2)Ppdc序列和Tcbh2序列的获得见实施例3。

3)以LML2.0a为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，构建Ppdc-Spmae1-Tcbh2表达框，得到Spmae1表达载体(图1B)。

2、将表达载体pOESpmae1导入里氏木霉，获得Spmae1基因表达菌株

1)将构建的质粒pOESpmae1导入里氏木霉QM6a(ATCC 13631)，QM9414(ATCC26921)，Rut-C30(ATCC 56765)，RL-P37(NRRL 15709)，NG14(ATCC 56767)，PC-3-7(ATCC 66589)基因组，然后进行筛选和验证。其方法见实施例3。

2)将上述验证的转化子接种至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖为碳源的培养基中(配方见实施例1)，接种量为10⁸个孢子/50mL培养基，28℃，220rpm培养，第8天取样测定L-苹果酸含量。

4)样品经实施例1所述方法处理后，测定发酵液中L-苹果酸的产量。结果显示：Spmae1在里氏木霉中大量表达时，均能显著发酵生产L-苹果酸。其中，产量最高的菌株命名为TrMM003，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量可达到30g/L(图2)。

实施例6在里氏木霉TrMM002菌株中表达米曲霉来源的丙酮酸羧化酶编码基因Aopyc

1、Aopyc基因表达载体(pOEAopyc)的构建；

1)利用引物Aopyc-1和Aopyc-2，以密码子优化的Aopyc质粒为模板扩增Aopyc序列；其中，Aopyc的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，Aopyc的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

Aopyc-1：5’-TGAAATAGCTTCAAAATGGCCGCCCCCTTCCGC-3’；

Aopyc-2：5’-TTTCGCCACGGAGCTTCAGGCCTTGACGATCTTGCA-3’。

反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃105sec，运行30个循环；68℃5min。

>SEQ ID NO.7

MAAPFRQPEEAVDDTEFIDDHHEHLRDTVHHRLRANSSIMHFQKILVANRGEIPIRIFRTAHELSLQTVAIYSHEDRLSMHRQKADEAYMIGHRGQYTPVGAYLAGDEIIKIALEHGVQLIHPGYGFLSENADFARKVENAGIVFVGPTPDTIDSLGDKVSARRLAIKCEVPVVPGTEGPVERYEEVKAFTDTYGFPIIIKAAFGGGGRGMRVVRDQAELRDSFERATSEARSAFGNGTVFVERFLDKPKHIEVQLLGDSHGNVVHLFERDCSVQRRHQKVVEVAPAKDLPADVRDRILADAVKLAKSVNYRNAGTAEFLVDQQNRHYFIEINPRIQVEHTITEEITGIDIVAAQIQIAAGASLEQLGLTQDRISARGFAIQCRITTEDPAKGFSPDTGKIEVYRSAGGNGVRLDGGNGFAGAIITPHYDSMLVKCTCRGSTYEIARRKVVRALVEFRIRGVKTNIPFLTSLLSHPTFVDGNCWTTFIDDTPELFSLVGSQNRAQKLLAYLGDVAVNGSSIKGQIGEPKLKGDVIKPKLFDAEGKPLDVSAPCTKGWKQILDREGPAAFAKAVRANKGCLIMDTTWRDAHQSLLATRVRTIDLLNIAHETSYAYSNAYSLECWGGATFDVAMRFLYEDPWDRLRKMRKAVPNIPFQMLLRGANGVAYSSLPDNAIYHFCKQAKKCGVDIFRVFDALNDVDQLEVGIKAVHAAEGVVEATMCYSGDMLNPHKKYNLEYYMALVDKIVAMKPHILGIKDMAGVLKPQAARLLVGSIRQRYPDLPIHVHTHDSAGTGVASMIACAQAGADAVDAATDSMSGMTSQPSIGAILASLEGTEQDPGLNLAHVRAIDSYWAQLRLLYSPFEAGLTGPDPEVYEHEIPGGQLTNLIFQASQLGLGQQWAETKKAYEAANDLLGDIVKVTPTSKVVGDLAQFMVSNKLTPEDVVERAGELDFPGSVLEFLEGLMGQPFGGFPEPLRSRALRDRRKLEKRPGLYLEPLDLAKIKSQIREKFGAATEYDVASYAMYPKVFEDYKKFVQKFGDLSVLPTRYFLAKPEIGEEFHVELEKGKVLILKLLAIGPLSEQTGQREVFYEVNGEVRQVAVDDNKASVDNTSRPKADVGDSSQVGAPMSGVVVEIRVHDGLEVKKGDPLAVLSAMKMEMVISAPHSGKVSSLLVKEGDSVDGQDLVCKIVKA。

>SEQ ID NO.8

atggccgcccccttccgccagcccgaggaggccgtagatgacacggagttcatcgacgaccaccacgagcacctccgcgacacggtccaccaccgcctgcgcgccaacagctccatcatgcacttccagaagatcctggtcgccaaccgcggcgagatccccatccgcatcttccgcaccgcccacgaactctccctccaaacggtcgccatctactcccacgaggaccgcctctcgatgcaccgccagaaggccgacgaggcctacatgatcggccaccgcggccagtacacccccgtcggcgcctacctggccggcgacgagatcatcaagatcgccctggagcacggcgtccagctgatccaccccggctacggcttcctctcggagaacgccgacttcgcccgcaaggtcgagaacgccggcatcgtcttcgtcggccccacccccgacaccatcgactcgctgggcgacaaggtcagcgcccgccgcctggccatcaagtgcgaggtccccgtcgtccccggcacggagggccccgtcgagcgctacgaggaggtcaaggccttcacggacacttatggcttccccatcatcatcaaggccgccttcggcggcgggggaagagggatgcgcgtcgtccgcgaccaggccgagctgcgcgactcgttcgagcgcgccacctcggaggcccgctcggccttcggcaacggcacggtcttcgtcgagcgcttcctggacaagcccaagcacatcgaggtccagctgctgggcgactcgcacggcaacgtcgtccacctgttcgagcgcgactgctcggtccagcgccgccaccagaaggtcgtcgaggtcgcccccgccaaggacctgcccgccgacgtccgcgaccgcatcctggccgacgccgtcaagctggccaagagcgtcaactaccgcaacgccggcacggccgagttcctcgttgaccagcagaaccgccactacttcatcgagatcaacccccgcatccaggtcgagcacacgatcacggaggagatcacgggcatcgacatcgtcgccgcccagatccagatcgccgccggcgcctcgctggagcagctgggcctcacgcaggaccgcatctccgcccgcggcttcgccatccagtgccgcatcaccacggaggaccccgccaagggcttcagccccgacacgggcaagatcgaggtctaccgcagcgccggcggcaacggcgtccgcctggacggcggcaacggcttcgccggcgccatcatcaccccccactacgactcgatgctggtcaagtgcacgtgccgcggcagcacctatgagatcgcccgccgcaaggtcgtccgcgccctcgtcgagttccgcatccgcggcgtcaagacgaacatccccttcctcacctccctgctctcgcaccccacgttcgttgacggcaactgctggaccacgttcatcgacgacacccccgagctgttctcgctggtcggctcgcagaaccgcgcccagaagctgctggcctacctgggcgacgtcgccgtcaacggcagcagcatcaagggccagatcggcgagcccaagctgaagggcgacgtcatcaagcccaagctgttcgacgccgagggcaagcccctggacgtcagcgccccctgcacgaagggctggaagcagatcctggaccgcgagggccccgccgccttcgccaaggccgtccgcgccaacaagggctgcctgatcatggacaccacctggcgcgacgcccaccagtccctgctggccacgcgcgtccgcacgatcgacctcctgaacatcgcccacgagaccagttatgcctactccaacgcctactccctggagtgctggggcggcgccacgttcgacgtcgccatgcgcttcctctacgaggacccctgggaccgcctgcgcaagatgcgcaaggccgtccccaacatccccttccagatgctgctccgcggcgccaacggcgtcgcctacagctcgctgcccgacaacgccatctaccacttctgcaagcaggccaagaagtgcggcgtagacatcttccgcgtcttcgacgccctgaacgacgtggaccagctggaggtcggcatcaaggccgtccacgccgccgagggcgtcgtcgaggccaccatgtgctactcgggcgacatgctgaacccccacaagaagtacaacctggagtactacatggccctggtagataagatcgtcgccatgaagccccacatcctgggcatcaaggacatggccggcgtcctgaagccccaggccgcccgcctcctcgtcggctcgatccgccagcgctaccccgacctgcccatccacgtccacacgcacgacagcgccggcacgggcgtcgcctcgatgatcgcctgcgcccaggccggcgccgacgccgtggatgccgccacggactcgatgtcgggcatgacctcgcagccctccatcggcgccatcctggcctcgctggagggcacggagcaggaccccggcctgaacctggcccacgtccgcgccatcgactcgtactgggcccagctgcgcctgctctacagccccttcgaggccggcctgacgggccccgaccccgaggtctacgagcacgagatccccggcggccagctcacgaacctgatcttccaggcctcgcagctgggcctcggccagcagtgggccgagacgaagaaggcctacgaggccgccaacgacctgctgggcgacatcgtcaaggtcacccccacctcgaaggtcgtcggcgacctggcccagttcatggtgtccaacaagctcacccccgaggacgtcgtcgagcgcgccggcgagctggacttccccggctcggtcctggagttcctggagggcctcatgggccagcccttcggcggcttccccgagcccctgcgctcccgcgccctgcgcgaccgccgcaagctggagaagcgccccggcctgtacctggagcccctggacctggccaagatcaagtcccagatccgcgagaagttcggcgccgccacggagtacgacgtcgcctcctacgccatgtaccccaaggtcttcgaggactacaagaagttcgtccagaagttcggcgacctctcggtcctgcccacgcgctacttcctggccaagcccgagatcggcgaggagttccacgtcgagctggagaagggcaaggtcctcatcctgaagctgctggccatcggccccctctcggagcagacgggccagcgcgaggtcttctacgaggtcaacggcgaggtccgccaggtcgccgtcgatgacaacaaggcctcggtagacaacacctcccgccccaaggccgacgtcggcgactcctcccaggtcggcgcccccatgtcgggcgtcgtcgtcgagatccgcgtccacgacggcctggaggtcaagaagggcgaccccctggccgtcctcagcgccatgaagatggagatggtcatcagcgccccccactcgggcaaggtcagctcgctcctggtcaaggagggcgactcggtagacggccaggacctggtctgcaagatcgtcaaggcctga。

2)利用引物Peno-F和Peno-R，以里氏木霉基因组为模板扩增Peno序列；其中，Peno的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

Peno-F：5’-ACTAGTGAGCTCATTTTGCCAACTCCTTGACGCCAA-3’；

Peno-R：5’-CATTTTGAAGCTATTTCAGGT-3’。

>SEQ ID NO.9

caactccttgacgccaaacggcccgatagaattgccctgcccctgatcgctcgacagccttgccggccatcgtaagcataggcacaagattcgaaccgatctcgcttctccctctagttctgtcgaggcttgatcatgccctcctgcacgatgtagtaaacgacggtagagtcattgtgcagcgcagcgaggacaatgcgcttcgcccgcttgcgagcctccggaagggcgtccatgacggcggcgaggctggacagcgtccacttctcggcgagatggacggccagcacccattcgtactcggcgtcgtgctgcgcccttgtccctgttgacttttcatatgcaagcgctgctatctggtcgtcggggtggagatacagaaggcgtggcgggaggccgcggatcattggccgcgacaggcctgggaggcgatggatttgcagcgaggcccattggtgctgctcttgcaggttctcaaataccgcagaggcgacatcggccgcgaactgatgtgacgcatccatggggggggggaggctcaatggacgtgtaggtactacgtataggcagtactatgtaggaagtaagacaaatgacgagagaatgagaagcgagaagcgagcgggatcagaaatggtcgcaatgatattacaaagcgctgcgtctttcgtccatgatcttcttcgtatcttaggtatctgcccgcatcaggccaagcggccgctgcgtcgcgatagaaactttttcgctgagaggccggagaaataggactagcgtttctcgctgtctaccgattcacgtaacccggcaggcaagtggcccaattattacctcacaagcaccccagctgcgcctgccctgccggttgagagctccgtttctcgttaggtaacttgcagtgctaatccagttatctgcgagggaaggcatgacttgccccacccgtctcgctctctctggacccctccatttctctcgacaacaaaaacaccatccttcttccttttccctccccaagattctctcgacttgctcaatcacgcctcacagcaagagcctgagacactcaatccatttctccactacaggtacggtgcctccctttacttgatctctacaagaggcagaccttgttctctgtcgtccaagcttctgcccctctttcccgtttcagccttcccagctacccctccatttgggggggcagagctgctgaaagacgcggcgtctggcggaacgtgttgaggcatattctcaatatacttgtttcgctcctctggctggattttgctatccgcgggagctcttgtataccagaggaatgatgcattgccatcgaacttggctccgtcatctcgcgcgggcttcactttcgatgtcgtgatcgcccagctacctacctcccgagatagcttcgaatacacctgctaacagacattgggtccatccagccacctgaaatagcttcaaaatg。

3)利用引物Tcbh1-1和Tcbh1-2，以里氏木霉基因组为模板扩增Tcbh1序列；其中，Tcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

Tcbh1-1：5’-AGCTCCGTGGCGAAAGCC-3’；

Tcbh1-2：5’-AGTGCCAAGCTTATTTAATTTCCACTGTTGCTATTATGCTGT-3’。

>SEQ ID NO.10

agctccgtggcgaaagcctgacgcaccggtagattcttggtgagcccgtatcatgacggcggcgggagctacatggccccgggtgatttattttttttgtatctacttctgacccttttcaaatatacggtcaactcatctttcactggagatgcggcctgcttggtattgcgatgttgtcagcttggcaaattgtggctttcgaaaacacaaaacgattccttagtagccatgcattttaagataacggaatagaagaaagaggaaattaaaaaaaaaaaaaaaacaaacatcccgttcataacccgtagaatcgccgctcttcgtgtatcccagtaccacggcaaaggtatttcatgatcgttcaatgttgatattgttcccgccagtatggctccacccccatctccgcgaatctcctcttctcgaacgcggtagtggcgcgccaattggtaatgacccatagggagacaaacagcataatagcaacagtggaaatt。

4)以LML2.0a为骨架构建表达载体，在已有质粒LML2.0a上的限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，构建Peno-Aopyc-Tcbh1表达框，得到Aopyc异源表达载体(图1C)。

2、将表达载体pOEAopyc导入里氏木霉TrMM002菌株，获得Aopyc基因异源表达菌株

1)将构建的质粒pOEAopyc整合至里氏木霉基因组，然后进行筛选和验证。其方法见实施例3。

4)样品经实施例1所述方法处理后，测定发酵液中L-苹果酸的产量。结果显示：Aopyc在里氏木霉中大量表达时，能显著促进L-苹果酸的生产。其中，产量最高的菌株命名为TrMM004，葡萄糖为碳源时L-苹果酸产量可达到100g/L(图2)。

5)工程菌株TrMM004能以甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素、葡萄糖/β-二糖混合物等常见碳源，直接发酵生产大量L-苹果酸(图3)。实验说明里氏木霉经过遗传改造后可以多种碳源进行L-苹果酸发酵。

经过上述实施例可见，本发明经过对里氏木霉菌进行基因改造成功发酵了L-苹果酸。本发明的研究成果是首次表明里氏木霉原始菌株虽然不能大量积累L-苹果酸，但通过基因工程改造后可以葡萄糖、甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素、葡萄糖/β-二糖混合物等常见碳源为底物，发酵生产L-苹果酸。并且实验证实了里氏木霉工程菌株发酵生产苹果酸的潜力，为苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 王玮

<120> 一种生产L-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Asn Asn Glu His His Ile Pro Pro Gly Ser Ser His Ser Asp

1 5 10 15

Ile Glu Met Leu Thr Pro Pro Lys Phe Glu Asp Glu Lys Gln Leu Gly

20 25 30

Pro Val Gly Ile Arg Glu Arg Leu Arg His Phe Thr Trp Ala Trp Tyr

35 40 45

Thr Leu Thr Met Ser Gly Gly Gly Leu Ala Val Leu Ile Ile Ser Gln

50 55 60

Pro Phe Gly Phe Arg Gly Leu Arg Glu Ile Gly Ile Ala Val Tyr Ile

65 70 75 80

Leu Asn Leu Ile Leu Phe Ala Leu Val Cys Ser Thr Met Ala Ile Arg

85 90 95

Phe Ile Leu His Gly Asn Leu Leu Glu Ser Leu Arg His Asp Arg Glu

100 105 110

Gly Leu Phe Phe Pro Thr Phe Trp Leu Ser Val Ala Thr Ile Ile Cys

115 120 125

Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Gly Glu Glu Ser Asn Glu Ser Phe Gln Leu

130 135 140

Ala Leu Glu Ala Leu Phe Trp Ile Tyr Cys Val Cys Thr Leu Leu Val

145 150 155 160

Ala Ile Ile Gln Tyr Ser Phe Val Phe Ser Ser His Lys Tyr Gly Leu

165 170 175

Gln Thr Met Met Pro Ser Trp Ile Leu Pro Ala Phe Pro Ile Met Leu

180 185 190

Ser Gly Thr Ile Ala Ser Val Ile Gly Glu Gln Gln Pro Ala Arg Ala

195 200 205

Ala Leu Pro Ile Ile Gly Ala Gly Val Thr Phe Gln Gly Leu Gly Phe

210 215 220

Ser Ile Ser Phe Met Met Tyr Ala His Tyr Ile Gly Arg Leu Met Glu

225 230 235 240

Ser Gly Leu Pro His Ser Asp His Arg Pro Gly Met Phe Ile Cys Val

245 250 255

Gly Pro Pro Ala Phe Thr Ala Leu Ala Leu Val Gly Met Ser Lys Gly

260 265 270

Leu Pro Glu Asp Phe Lys Leu Leu His Asp Ala His Ala Leu Glu Asp

275 280 285

Gly Arg Ile Ile Glu Leu Leu Ala Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Trp

290 295 300

Ala Leu Ser Leu Trp Phe Phe Cys Ile Ala Ile Val Ala Val Ile Arg

305 310 315 320

Ser Pro Pro Glu Ala Phe His Leu Asn Trp Trp Ala Met Val Phe Pro

325 330 335

Asn Thr Gly Phe Thr Leu Ala Thr Ile Thr Leu Gly Lys Ala Leu Asn

340 345 350

Ser Asn Gly Val Lys Gly Val Gly Ser Ala Met Ser Ile Cys Ile Val

355 360 365

Cys Met Tyr Ile Phe Val Phe Val Asn Asn Val Arg Ala Val Ile Arg

370 375 380

Lys Asp Ile Met Tyr Pro Gly Lys Asp Glu Asp Val Ser Asp

385 390 395

<210> 2

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttcaaca acgagcacca catccccccc ggcagctcgc actccgacat cgagatgctg 60

acgcccccca agttcgagga cgagaagcag ctgggccccg tcggcatccg cgagcgcctg 120

cgccacttca cgtgggcctg gtacacgctc accatgagcg gcggcggcct ggccgtcctg 180

atcatctccc agcccttcgg cttccgcggc ctccgcgaga tcggcatcgc cgtctacatc 240

ctcaacctga tcctgttcgc cctggtctgc tcgacgatgg ccatccgctt catcctccac 300

ggcaacctcc tggagagcct gcgccacgac cgcgagggcc tgttcttccc caccttctgg 360

ctctcggtcg ccacgatcat ctgcggcctc tcgcgctact tcggcgagga gtccaacgag 420

tcgttccagc tggccctgga ggccctgttc tggatctact gcgtctgcac gctgctggtc 480

gccatcatcc agtactcgtt cgtcttcagc tcgcacaagt acggcctcca gaccatgatg 540

ccctcgtgga ttctccccgc cttccccatc atgctctcgg gcacgatcgc cagcgtcatc 600

ggcgagcagc agcccgcccg cgccgccctc cccatcatcg gcgccggcgt cacgttccag 660

ggcctgggct tctcgatctc gttcatgatg tacgcccact acatcggccg cctgatggag 720

tcgggcctgc cccactccga ccaccgcccc ggcatgttca tctgcgtcgg cccccccgcc 780

ttcaccgccc tcgccctggt cggcatgagc aagggcctcc ccgaggactt caagctgctg 840

cacgacgccc acgccctgga ggacggccgc atcatcgagc tgctggccat cagcgccggc 900

gtcttcctgt gggccctctc gctgtggttc ttctgcatcg ccatcgtcgc cgtcatccgc 960

agcccccccg aggccttcca cctcaactgg tgggcaatgg tcttccccaa cacgggcttc 1020

acgctggcca cgatcacgct gggcaaggcc ctgaactcga acggcgtcaa gggcgtcggc 1080

agcgccatgt cgatctgcat cgtctgcatg tacatcttcg tcttcgtcaa caacgtccgc 1140

gccgtcatcc gcaaggacat catgtacccc ggcaaggacg aggacgtcag cgactag 1197

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaggag ggagcattct tcgacttgcg gcaattgcat gcacatgtac gattggaagc 60

gcgggcgatg tattcgcaat catgtttaga aggacggcgt ttggaaacgt tgggatgctg 120

ttgaagcgtt ggaaacaggg gcaattagaa acaccgagcc agacagagtc aatggtacga 180

ggtcagccag tatcatgacc tgtgtgcgca tggtggcgag agattccgag ccatgccacg 240

ggagacgagc aatgaaaaaa ctcttcactc acttgtcgag gctctctcaa cctatcgact 300

tatcaagtag acgatgaaag ccttgcaact gtggtgatgt ggctcatcaa tgtgcgacgt 360

cgtatccatg tctgaggcca ttcgatatcg tgatgcgact acctagtaaa gcccggccag 420

agggcaaacc ggggcgacag gggcaggcaa ttgaccggat ggctgcatgt gccgaagcag 480

ccccgatgga atcgagatgt ctgtcggatg gaccgctgag cggcctggca aggtgtccca 540

gatacgaaga tggaagtgaa gtcagaggtg gtcgttaatt gtccgacgag cgaatcggcc 600

gctccttcgg attgccggct ctgctgtatg taccgtgcat gaagccaccc gggatccatg 660

ttacgatgga taggttccaa ctctctagta gctatagtgg acctgaggct atctagtatc 720

actggaggag cagccgtcca ctatcgtcga gcgctgtaga agcagctgca ttagcggctg 780

cccacccgcg cagaaatggc cccattacat cactatcatg acagcggcgc gtccaaaagt 840

gagctcatgc ttgccgatgg cacgagcagc tgcaactggc ggggctcctg cctgccgtct 900

ccggtgccgc tgcccatttg agtttgtccg agctgttgat ggttgaaacc gagaccgatg 960

gatgattcaa cacttcgaag tctaggtaga taaaaaacat ctatatatcc tcattcattg 1020

ccctgtcagt gtgttggctc acgtctccaa tcctccgccc ctcctcctgc aaagtaaata 1080

ccttctcaaa acacgtctgg aatcctgcaa gtctccatca caaggagctt cttcatcaac 1140

caccttatac gagcaacatc atttgcatca tcgttgatcc acatctcctc gcgcctcaga 1200

gtgtcgtcac cagtataaat aaccgcatca agctctcgtc cttcttcgtt ccacaatcca 1260

agaagcacct caaaacgatc aaagcagcgc agctacagca caatc 1305

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctttcgtg accgggcttc aaacaatgat gtgcgatggt gtggttcccg gttggcggag 60

tctttgtcta ctttggttgt ctgtcgcagg tcggtagacc gcaaatgagc aactgatgga 120

ttgttgccag cgatactata attcacatgg atggtctttg tcgatcagta gctagtgaga 180

gagagagaac atctatccac aatgtcgagt gtctattaga catactccga gaataaagtc 240

aactgtgtct gtgatctaaa gatcgattcg gcagtcgagt agcgtataac aactccgagt 300

accagcaaaa gcacgtcgtg acaggagcag ggctttgcca actgcgcaac cttgcttgaa 360

tgaggataca cggggtgcaa catggctgta ctgatccatc gcaaccaaaa tttctgttta 420

tagatcaagc tggtagattc caattactcc acctcttgcg cttctccatg acatgtaagt 480

gcacgtggaa accataccca 500

<210> 5

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Glu Leu Lys Glu Ile Leu Lys Gln Arg Tyr His Glu Leu Leu

1 5 10 15

Asp Trp Asn Val Lys Ala Pro His Val Pro Leu Ser Gln Arg Leu Lys

20 25 30

His Phe Thr Trp Ser Trp Phe Ala Cys Thr Met Ala Thr Gly Gly Val

35 40 45

Gly Leu Ile Ile Gly Ser Phe Pro Phe Arg Phe Tyr Gly Leu Asn Thr

50 55 60

Ile Gly Lys Ile Val Tyr Ile Leu Gln Ile Phe Leu Phe Ser Leu Phe

65 70 75 80

Gly Ser Cys Met Leu Phe Arg Phe Ile Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Lys

85 90 95

Asp Ser Trp Asn His His Leu Glu Lys Leu Phe Ile Ala Thr Cys Leu

100 105 110

Leu Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Met Leu Ala Ile Tyr Ala Tyr Pro

115 120 125

Asp Thr Gly Glu Trp Met Val Trp Val Ile Arg Ile Leu Tyr Tyr Ile

130 135 140

Tyr Val Ala Val Ser Phe Ile Tyr Cys Val Met Ala Phe Phe Thr Ile

145 150 155 160

Phe Asn Asn His Val Tyr Thr Ile Glu Thr Ala Ser Pro Ala Trp Ile

165 170 175

Leu Pro Ile Phe Pro Pro Met Ile Cys Gly Val Ile Ala Gly Ala Val

180 185 190

Asn Ser Thr Gln Pro Ala His Gln Leu Lys Asn Met Val Ile Phe Gly

195 200 205

Ile Leu Phe Gln Gly Leu Gly Phe Trp Val Tyr Leu Leu Leu Phe Ala

210 215 220

Val Asn Val Leu Arg Phe Phe Thr Val Gly Leu Ala Lys Pro Gln Asp

225 230 235 240

Arg Pro Gly Met Phe Met Phe Val Gly Pro Pro Ala Phe Ser Gly Leu

245 250 255

Ala Leu Ile Asn Ile Ala Arg Gly Ala Met Gly Ser Arg Pro Tyr Ile

260 265 270

Phe Val Gly Ala Asn Ser Ser Glu Tyr Leu Gly Phe Val Ser Thr Phe

275 280 285

Met Ala Ile Phe Ile Trp Gly Leu Ala Ala Trp Cys Tyr Cys Leu Ala

290 295 300

Met Val Ser Phe Leu Ala Gly Phe Phe Thr Arg Ala Pro Leu Lys Phe

305 310 315 320

Ala Cys Gly Trp Phe Ala Phe Ile Phe Pro Asn Val Gly Phe Val Asn

325 330 335

Cys Thr Ile Glu Ile Gly Lys Met Ile Asp Ser Lys Ala Phe Gln Met

340 345 350

Phe Gly His Ile Ile Gly Val Ile Leu Cys Ile Gln Trp Ile Leu Leu

355 360 365

Met Tyr Leu Met Val Arg Ala Phe Leu Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro

370 375 380

Gly Lys Asp Glu Asp Ala His Pro Pro Pro Lys Pro Asn Thr Gly Val

385 390 395 400

Leu Asn Pro Thr Phe Pro Pro Glu Lys Ala Pro Ala Ser Leu Glu Lys

405 410 415

Val Asp Thr His Val Thr Ser Thr Gly Gly Glu Ser Asp Pro Pro Ser

420 425 430

Ser Glu His Glu Ser Val

435

<210> 6

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgggcgagc tgaaggagat cctgaagcag cgctaccacg agctgctcga ctggaacgtc 60

aaggcccccc acgtccccct ctcgcagcgc ctcaagcact tcacgtggtc gtggttcgcc 120

tgcacgatgg ccacgggcgg cgtcggcctg atcatcggct cgttcccctt ccgcttctac 180

ggcctcaaca cgatcggcaa gatcgtctac atcctccaga ttttcctgtt ctcgctgttc 240

ggctcgtgta tgctgttccg cttcatcaag tacccctcga cgatcaagga ctcgtggaac 300

caccaccttg aaaagctgtt catcgccacg tgcctgctca gcatcagcac cttcatcgac 360

atgctggcca tctacgccta ccccgacacg ggcgagtgga tggtctgggt catccgcatc 420

ctctactaca tctacgtcgc cgtgtcgttc atctactgcg tcatggcctt cttcacgatc 480

ttcaacaacc acgtctacac gatcgagacc gccagccccg cctggatact gcccatcttc 540

ccccccatga tctgcggcgt catcgccggc gccgtcaact cgacgcagcc cgcccaccag 600

ctgaagaaca tggtcatctt cggcatcctg ttccagggcc tgggcttctg ggtctacctg 660

ctgctgttcg ccgtcaacgt cctccgcttc ttcaccgtcg gcctggccaa gccccaggac 720

cgccccggca tgttcatgtt cgtcggcccc cccgccttct ccggcctcgc cctgatcaac 780

atcgcccgcg gcgcaatggg cagccgcccc tacatcttcg tcggcgccaa cagctccgag 840

tacctgggct ttgtatcgac gttcatggcc atcttcatct ggggcctggc cgcctggtgc 900

tactgcctgg ctatggtatc gttcctggcc ggcttcttca cgcgcgcccc cctcaagttc 960

gcctgcggct ggttcgcctt catcttcccc aacgtcggct tcgtcaactg cacgatcgag 1020

atcggcaaga tgatcgactc caaggccttc cagatgttcg gccacatcat cggcgtcatc 1080

ctgtgcatcc agtggattct cctgatgtac ctgatggtcc gcgccttcct ggtcaacgac 1140

ctctgctacc ccggcaagga cgaggacgcc cacccccccc ccaagcccaa cacgggcgtc 1200

ctgaacccca ccttcccccc cgagaaggcc cccgcctcgc tggagaaggt tgatacgcac 1260

gtcaccagca cgggcggcga gagcgacccc cccagctccg agcacgagtc ggtctga 1317

<210> 7

<211> 1193

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Ala Pro Phe Arg Gln Pro Glu Glu Ala Val Asp Asp Thr Glu

1 5 10 15

Phe Ile Asp Asp His His Glu His Leu Arg Asp Thr Val His His Arg

20 25 30

Leu Arg Ala Asn Ser Ser Ile Met His Phe Gln Lys Ile Leu Val Ala

35 40 45

Asn Arg Gly Glu Ile Pro Ile Arg Ile Phe Arg Thr Ala His Glu Leu

50 55 60

Ser Leu Gln Thr Val Ala Ile Tyr Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Met

65 70 75 80

His Arg Gln Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Met Ile Gly His Arg Gly Gln

85 90 95

Tyr Thr Pro Val Gly Ala Tyr Leu Ala Gly Asp Glu Ile Ile Lys Ile

100 105 110

Ala Leu Glu His Gly Val Gln Leu Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu

115 120 125

Ser Glu Asn Ala Asp Phe Ala Arg Lys Val Glu Asn Ala Gly Ile Val

130 135 140

Phe Val Gly Pro Thr Pro Asp Thr Ile Asp Ser Leu Gly Asp Lys Val

145 150 155 160

Ser Ala Arg Arg Leu Ala Ile Lys Cys Glu Val Pro Val Val Pro Gly

165 170 175

Thr Glu Gly Pro Val Glu Arg Tyr Glu Glu Val Lys Ala Phe Thr Asp

180 185 190

Thr Tyr Gly Phe Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly

195 200 205

Arg Gly Met Arg Val Val Arg Asp Gln Ala Glu Leu Arg Asp Ser Phe

210 215 220

Glu Arg Ala Thr Ser Glu Ala Arg Ser Ala Phe Gly Asn Gly Thr Val

225 230 235 240

Phe Val Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Lys His Ile Glu Val Gln Leu

245 250 255

Leu Gly Asp Ser His Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys

260 265 270

Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Val Ala Pro Ala Lys

275 280 285

Asp Leu Pro Ala Asp Val Arg Asp Arg Ile Leu Ala Asp Ala Val Lys

290 295 300

Leu Ala Lys Ser Val Asn Tyr Arg Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu

305 310 315 320

Val Asp Gln Gln Asn Arg His Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile

325 330 335

Gln Val Glu His Thr Ile Thr Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val

340 345 350

Ala Ala Gln Ile Gln Ile Ala Ala Gly Ala Ser Leu Glu Gln Leu Gly

355 360 365

Leu Thr Gln Asp Arg Ile Ser Ala Arg Gly Phe Ala Ile Gln Cys Arg

370 375 380

Ile Thr Thr Glu Asp Pro Ala Lys Gly Phe Ser Pro Asp Thr Gly Lys

385 390 395 400

Ile Glu Val Tyr Arg Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Arg Leu Asp Gly

405 410 415

Gly Asn Gly Phe Ala Gly Ala Ile Ile Thr Pro His Tyr Asp Ser Met

420 425 430

Leu Val Lys Cys Thr Cys Arg Gly Ser Thr Tyr Glu Ile Ala Arg Arg

435 440 445

Lys Val Val Arg Ala Leu Val Glu Phe Arg Ile Arg Gly Val Lys Thr

450 455 460

Asn Ile Pro Phe Leu Thr Ser Leu Leu Ser His Pro Thr Phe Val Asp

465 470 475 480

Gly Asn Cys Trp Thr Thr Phe Ile Asp Asp Thr Pro Glu Leu Phe Ser

485 490 495

Leu Val Gly Ser Gln Asn Arg Ala Gln Lys Leu Leu Ala Tyr Leu Gly

500 505 510

Asp Val Ala Val Asn Gly Ser Ser Ile Lys Gly Gln Ile Gly Glu Pro

515 520 525

Lys Leu Lys Gly Asp Val Ile Lys Pro Lys Leu Phe Asp Ala Glu Gly

530 535 540

Lys Pro Leu Asp Val Ser Ala Pro Cys Thr Lys Gly Trp Lys Gln Ile

545 550 555 560

Leu Asp Arg Glu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Lys Ala Val Arg Ala Asn

565 570 575

Lys Gly Cys Leu Ile Met Asp Thr Thr Trp Arg Asp Ala His Gln Ser

580 585 590

Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Thr Ile Asp Leu Leu Asn Ile Ala His

595 600 605

Glu Thr Ser Tyr Ala Tyr Ser Asn Ala Tyr Ser Leu Glu Cys Trp Gly

610 615 620

Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Tyr Glu Asp Pro Trp

625 630 635 640

Asp Arg Leu Arg Lys Met Arg Lys Ala Val Pro Asn Ile Pro Phe Gln

645 650 655

Met Leu Leu Arg Gly Ala Asn Gly Val Ala Tyr Ser Ser Leu Pro Asp

660 665 670

Asn Ala Ile Tyr His Phe Cys Lys Gln Ala Lys Lys Cys Gly Val Asp

675 680 685

Ile Phe Arg Val Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Asp Gln Leu Glu Val

690 695 700

Gly Ile Lys Ala Val His Ala Ala Glu Gly Val Val Glu Ala Thr Met

705 710 715 720

Cys Tyr Ser Gly Asp Met Leu Asn Pro His Lys Lys Tyr Asn Leu Glu

725 730 735

Tyr Tyr Met Ala Leu Val Asp Lys Ile Val Ala Met Lys Pro His Ile

740 745 750

Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly Val Leu Lys Pro Gln Ala Ala Arg

755 760 765

Leu Leu Val Gly Ser Ile Arg Gln Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile His

770 775 780

Val His Thr His Asp Ser Ala Gly Thr Gly Val Ala Ser Met Ile Ala

785 790 795 800

Cys Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Ala Ala Thr Asp Ser Met

805 810 815

Ser Gly Met Thr Ser Gln Pro Ser Ile Gly Ala Ile Leu Ala Ser Leu

820 825 830

Glu Gly Thr Glu Gln Asp Pro Gly Leu Asn Leu Ala His Val Arg Ala

835 840 845

Ile Asp Ser Tyr Trp Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr Ser Pro Phe Glu

850 855 860

Ala Gly Leu Thr Gly Pro Asp Pro Glu Val Tyr Glu His Glu Ile Pro

865 870 875 880

Gly Gly Gln Leu Thr Asn Leu Ile Phe Gln Ala Ser Gln Leu Gly Leu

885 890 895

Gly Gln Gln Trp Ala Glu Thr Lys Lys Ala Tyr Glu Ala Ala Asn Asp

900 905 910

Leu Leu Gly Asp Ile Val Lys Val Thr Pro Thr Ser Lys Val Val Gly

915 920 925

Asp Leu Ala Gln Phe Met Val Ser Asn Lys Leu Thr Pro Glu Asp Val

930 935 940

Val Glu Arg Ala Gly Glu Leu Asp Phe Pro Gly Ser Val Leu Glu Phe

945 950 955 960

Leu Glu Gly Leu Met Gly Gln Pro Phe Gly Gly Phe Pro Glu Pro Leu

965 970 975

Arg Ser Arg Ala Leu Arg Asp Arg Arg Lys Leu Glu Lys Arg Pro Gly

980 985 990

Leu Tyr Leu Glu Pro Leu Asp Leu Ala Lys Ile Lys Ser Gln Ile Arg

995 1000 1005

Glu Lys Phe Gly Ala Ala Thr Glu Tyr Asp Val Ala Ser Tyr Ala Met

1010 1015 1020

Tyr Pro Lys Val Phe Glu Asp Tyr Lys Lys Phe Val Gln Lys Phe Gly

1025 1030 1035 1040

Asp Leu Ser Val Leu Pro Thr Arg Tyr Phe Leu Ala Lys Pro Glu Ile

1045 1050 1055

Gly Glu Glu Phe His Val Glu Leu Glu Lys Gly Lys Val Leu Ile Leu

1060 1065 1070

Lys Leu Leu Ala Ile Gly Pro Leu Ser Glu Gln Thr Gly Gln Arg Glu

1075 1080 1085

Val Phe Tyr Glu Val Asn Gly Glu Val Arg Gln Val Ala Val Asp Asp

1090 1095 1100

Asn Lys Ala Ser Val Asp Asn Thr Ser Arg Pro Lys Ala Asp Val Gly

1105 1110 1115 1120

Asp Ser Ser Gln Val Gly Ala Pro Met Ser Gly Val Val Val Glu Ile

1125 1130 1135

Arg Val His Asp Gly Leu Glu Val Lys Lys Gly Asp Pro Leu Ala Val

1140 1145 1150

Leu Ser Ala Met Lys Met Glu Met Val Ile Ser Ala Pro His Ser Gly

1155 1160 1165

Lys Val Ser Ser Leu Leu Val Lys Glu Gly Asp Ser Val Asp Gly Gln

1170 1175 1180

Asp Leu Val Cys Lys Ile Val Lys Ala

1185 1190

<210> 8

<211> 3582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccgccc ccttccgcca gcccgaggag gccgtagatg acacggagtt catcgacgac 60

caccacgagc acctccgcga cacggtccac caccgcctgc gcgccaacag ctccatcatg 120

cacttccaga agatcctggt cgccaaccgc ggcgagatcc ccatccgcat cttccgcacc 180

gcccacgaac tctccctcca aacggtcgcc atctactccc acgaggaccg cctctcgatg 240

caccgccaga aggccgacga ggcctacatg atcggccacc gcggccagta cacccccgtc 300

ggcgcctacc tggccggcga cgagatcatc aagatcgccc tggagcacgg cgtccagctg 360

atccaccccg gctacggctt cctctcggag aacgccgact tcgcccgcaa ggtcgagaac 420

gccggcatcg tcttcgtcgg ccccaccccc gacaccatcg actcgctggg cgacaaggtc 480

agcgcccgcc gcctggccat caagtgcgag gtccccgtcg tccccggcac ggagggcccc 540

gtcgagcgct acgaggaggt caaggccttc acggacactt atggcttccc catcatcatc 600

aaggccgcct tcggcggcgg gggaagaggg atgcgcgtcg tccgcgacca ggccgagctg 660

cgcgactcgt tcgagcgcgc cacctcggag gcccgctcgg ccttcggcaa cggcacggtc 720

ttcgtcgagc gcttcctgga caagcccaag cacatcgagg tccagctgct gggcgactcg 780

cacggcaacg tcgtccacct gttcgagcgc gactgctcgg tccagcgccg ccaccagaag 840

gtcgtcgagg tcgcccccgc caaggacctg cccgccgacg tccgcgaccg catcctggcc 900

gacgccgtca agctggccaa gagcgtcaac taccgcaacg ccggcacggc cgagttcctc 960

gttgaccagc agaaccgcca ctacttcatc gagatcaacc cccgcatcca ggtcgagcac 1020

acgatcacgg aggagatcac gggcatcgac atcgtcgccg cccagatcca gatcgccgcc 1080

ggcgcctcgc tggagcagct gggcctcacg caggaccgca tctccgcccg cggcttcgcc 1140

atccagtgcc gcatcaccac ggaggacccc gccaagggct tcagccccga cacgggcaag 1200

atcgaggtct accgcagcgc cggcggcaac ggcgtccgcc tggacggcgg caacggcttc 1260

gccggcgcca tcatcacccc ccactacgac tcgatgctgg tcaagtgcac gtgccgcggc 1320

agcacctatg agatcgcccg ccgcaaggtc gtccgcgccc tcgtcgagtt ccgcatccgc 1380

ggcgtcaaga cgaacatccc cttcctcacc tccctgctct cgcaccccac gttcgttgac 1440

ggcaactgct ggaccacgtt catcgacgac acccccgagc tgttctcgct ggtcggctcg 1500

cagaaccgcg cccagaagct gctggcctac ctgggcgacg tcgccgtcaa cggcagcagc 1560

atcaagggcc agatcggcga gcccaagctg aagggcgacg tcatcaagcc caagctgttc 1620

gacgccgagg gcaagcccct ggacgtcagc gccccctgca cgaagggctg gaagcagatc 1680

ctggaccgcg agggccccgc cgccttcgcc aaggccgtcc gcgccaacaa gggctgcctg 1740

atcatggaca ccacctggcg cgacgcccac cagtccctgc tggccacgcg cgtccgcacg 1800

atcgacctcc tgaacatcgc ccacgagacc agttatgcct actccaacgc ctactccctg 1860

gagtgctggg gcggcgccac gttcgacgtc gccatgcgct tcctctacga ggacccctgg 1920

gaccgcctgc gcaagatgcg caaggccgtc cccaacatcc ccttccagat gctgctccgc 1980

ggcgccaacg gcgtcgccta cagctcgctg cccgacaacg ccatctacca cttctgcaag 2040

caggccaaga agtgcggcgt agacatcttc cgcgtcttcg acgccctgaa cgacgtggac 2100

cagctggagg tcggcatcaa ggccgtccac gccgccgagg gcgtcgtcga ggccaccatg 2160

tgctactcgg gcgacatgct gaacccccac aagaagtaca acctggagta ctacatggcc 2220

ctggtagata agatcgtcgc catgaagccc cacatcctgg gcatcaagga catggccggc 2280

gtcctgaagc cccaggccgc ccgcctcctc gtcggctcga tccgccagcg ctaccccgac 2340

ctgcccatcc acgtccacac gcacgacagc gccggcacgg gcgtcgcctc gatgatcgcc 2400

tgcgcccagg ccggcgccga cgccgtggat gccgccacgg actcgatgtc gggcatgacc 2460

tcgcagccct ccatcggcgc catcctggcc tcgctggagg gcacggagca ggaccccggc 2520

ctgaacctgg cccacgtccg cgccatcgac tcgtactggg cccagctgcg cctgctctac 2580

agccccttcg aggccggcct gacgggcccc gaccccgagg tctacgagca cgagatcccc 2640

ggcggccagc tcacgaacct gatcttccag gcctcgcagc tgggcctcgg ccagcagtgg 2700

gccgagacga agaaggccta cgaggccgcc aacgacctgc tgggcgacat cgtcaaggtc 2760

acccccacct cgaaggtcgt cggcgacctg gcccagttca tggtgtccaa caagctcacc 2820

cccgaggacg tcgtcgagcg cgccggcgag ctggacttcc ccggctcggt cctggagttc 2880

ctggagggcc tcatgggcca gcccttcggc ggcttccccg agcccctgcg ctcccgcgcc 2940

ctgcgcgacc gccgcaagct ggagaagcgc cccggcctgt acctggagcc cctggacctg 3000

gccaagatca agtcccagat ccgcgagaag ttcggcgccg ccacggagta cgacgtcgcc 3060

tcctacgcca tgtaccccaa ggtcttcgag gactacaaga agttcgtcca gaagttcggc 3120

gacctctcgg tcctgcccac gcgctacttc ctggccaagc ccgagatcgg cgaggagttc 3180

cacgtcgagc tggagaaggg caaggtcctc atcctgaagc tgctggccat cggccccctc 3240

tcggagcaga cgggccagcg cgaggtcttc tacgaggtca acggcgaggt ccgccaggtc 3300

gccgtcgatg acaacaaggc ctcggtagac aacacctccc gccccaaggc cgacgtcggc 3360

gactcctccc aggtcggcgc ccccatgtcg ggcgtcgtcg tcgagatccg cgtccacgac 3420

ggcctggagg tcaagaaggg cgaccccctg gccgtcctca gcgccatgaa gatggagatg 3480

gtcatcagcg ccccccactc gggcaaggtc agctcgctcc tggtcaagga gggcgactcg 3540

gtagacggcc aggacctggt ctgcaagatc gtcaaggcct ga 3582

<210> 9

<211> 1474

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caactccttg acgccaaacg gcccgataga attgccctgc ccctgatcgc tcgacagcct 60

tgccggccat cgtaagcata ggcacaagat tcgaaccgat ctcgcttctc cctctagttc 120

tgtcgaggct tgatcatgcc ctcctgcacg atgtagtaaa cgacggtaga gtcattgtgc 180

agcgcagcga ggacaatgcg cttcgcccgc ttgcgagcct ccggaagggc gtccatgacg 240

gcggcgaggc tggacagcgt ccacttctcg gcgagatgga cggccagcac ccattcgtac 300

tcggcgtcgt gctgcgccct tgtccctgtt gacttttcat atgcaagcgc tgctatctgg 360

tcgtcggggt ggagatacag aaggcgtggc gggaggccgc ggatcattgg ccgcgacagg 420

cctgggaggc gatggatttg cagcgaggcc cattggtgct gctcttgcag gttctcaaat 480

accgcagagg cgacatcggc cgcgaactga tgtgacgcat ccatgggggg ggggaggctc 540

aatggacgtg taggtactac gtataggcag tactatgtag gaagtaagac aaatgacgag 600

agaatgagaa gcgagaagcg agcgggatca gaaatggtcg caatgatatt acaaagcgct 660

gcgtctttcg tccatgatct tcttcgtatc ttaggtatct gcccgcatca ggccaagcgg 720

ccgctgcgtc gcgatagaaa ctttttcgct gagaggccgg agaaatagga ctagcgtttc 780

tcgctgtcta ccgattcacg taacccggca ggcaagtggc ccaattatta cctcacaagc 840

accccagctg cgcctgccct gccggttgag agctccgttt ctcgttaggt aacttgcagt 900

gctaatccag ttatctgcga gggaaggcat gacttgcccc acccgtctcg ctctctctgg 960

acccctccat ttctctcgac aacaaaaaca ccatccttct tccttttccc tccccaagat 1020

tctctcgact tgctcaatca cgcctcacag caagagcctg agacactcaa tccatttctc 1080

cactacaggt acggtgcctc cctttacttg atctctacaa gaggcagacc ttgttctctg 1140

tcgtccaagc ttctgcccct ctttcccgtt tcagccttcc cagctacccc tccatttggg 1200

ggggcagagc tgctgaaaga cgcggcgtct ggcggaacgt gttgaggcat attctcaata 1260

tacttgtttc gctcctctgg ctggattttg ctatccgcgg gagctcttgt ataccagagg 1320

aatgatgcat tgccatcgaa cttggctccg tcatctcgcg cgggcttcac tttcgatgtc 1380

gtgatcgccc agctacctac ctcccgagat agcttcgaat acacctgcta acagacattg 1440

ggtccatcca gccacctgaa atagcttcaa aatg 1474

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctccgtgg cgaaagcctg acgcaccggt agattcttgg tgagcccgta tcatgacggc 60

ggcgggagct acatggcccc gggtgattta ttttttttgt atctacttct gacccttttc 120

aaatatacgg tcaactcatc tttcactgga gatgcggcct gcttggtatt gcgatgttgt 180

cagcttggca aattgtggct ttcgaaaaca caaaacgatt ccttagtagc catgcatttt 240

aagataacgg aatagaagaa agaggaaatt aaaaaaaaaa aaaaaacaaa catcccgttc 300

ataacccgta gaatcgccgc tcttcgtgta tcccagtacc acggcaaagg tatttcatga 360

tcgttcaatg ttgatattgt tcccgccagt atggctccac ccccatctcc gcgaatctcc 420

tcttctcgaa cgcggtagtg gcgcgccaat tggtaatgac ccatagggag acaaacagca 480

taatagcaac agtggaaatt 500

Claims

1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，以丝状真菌里氏木霉菌为出发菌株经过基因改造导入四碳二元羧酸转运蛋白和丙酮酸羧化酶表达的基因，使不具备生产L-苹果酸的所述出发菌株能够生产L-苹果酸；

所述四碳二元羧酸转运蛋白表达的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述丙酮酸羧化酶表达的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut-C30，RL-P37，NG14以及PC-3-7。

3.一种如权利要求1-2任一项所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含四碳二元羧酸转运蛋白和丙酮酸羧化酶编码基因的载体转入里氏木霉菌中，获得表达四碳二元羧酸转运蛋白和丙酮酸羧化酶的菌株，即为所述里氏木霉工程菌；

所述四碳二元羧酸转运蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述丙酮酸羧化酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.一种生产L-苹果酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的里氏木霉工程菌的孢子接种于液体培养基中，在28℃条件下发酵培养，获取L-苹果酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所用液体培养基包括以下浓度组分：碳源40-100g/L，蛋白胨1-6g/L，KH₂PO₄ 0.15g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，CaCl₂·2H₂O 0.10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.10g/L，碳酸钙80g/L，NaCl 0.05g/L，1mL/L微量元素液；所述微量元素包括以下浓度的组分：1.6g MnSO₄·4H₂O，5g FeSO₄·7H₂O，2g CoCl₂·6H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，用水溶解并定容至1L。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源包括甘油、葡萄糖、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或者葡萄糖/β-二糖混合物任一种。

7.一种如权利要求1-2任一项所述的里氏木霉工程菌，或者权利要求3所述的构建方法在生产L-苹果酸方面的应用。