CN112501105B

CN112501105B - 一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株及其获得方法

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Publication number: CN112501105B
Application number: CN202011610612.4A
Authority: CN
Inventors: 王正祥; 田康明; 牛丹丹; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112501105A

Abstract

本发明公开了一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株及其获得方法，包括在现有合成乳酸单体的代谢工程大肠杆菌中表达蔗糖酶，获得了高效代谢蔗糖的菌种，此菌种能够直接发酵蔗糖高效合成乳酸单体，其蔗糖到乳酸单体的转化率达到102%以上。

Description

一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株及其获得方法

技术领域

本发明涉及发酵工程和基因工程技术领域，具体涉及一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株及其获得方法，具体为蔗糖酶编码基因的克隆、表达、蔗糖代谢和以蔗糖为原料的乳酸单体的发酵生产。

背景技术

乳酸分子具有旋光性，其光学构型包括D型和L型，是聚乳酸合成的关键单体和原料。运用代谢工程酵母（以酿酒酵母为代表）或细菌（以大肠杆菌为代表）以葡萄糖（淀粉）或甘油为原料发酵生产乳酸单体（D-乳酸或L-乳酸），是现今乳酸单体的主要生产方式。

由于聚乳酸的需求量极大，加之蔗糖消费结构的改变，蔗糖作为原料生产乳酸单体具有工业可行性和实际应用价值。但是，现有乳酸单体生产菌种不能直接利用蔗糖或利用蔗糖的方式不适合用于乳酸单体的生产。例如，酿酒酵母具有利用蔗糖的能力，在水解蔗糖为葡萄糖和果糖的同时，由于其含有10种以上的蔗糖水解相关酶分子，会导致有10%~50%的蔗糖会被转化合成为果聚糖或低聚果糖，不再被菌体利用，由此极大地影响了原料的利用率和糖酸转化率。再如，经过代谢工程改造和优化的大肠杆菌是乳酸单体生产的主力菌种（ZL201510262769.5； ZL201210102731.8；Tian, et al, BiotechnologyBioengineering, 113: 181-188；Niu, et al, Microbial Cell Factories, 13: 78-88；Chen, et al, Green Chemistry, 16: 342-350；Zhou, et al. Metabolic Engineering,14: 560-568），但是大多数大肠杆菌不具有利用蔗糖的能力（Jahreis, et al. Adaptionof sucrose metabolism in the Escherichia coli wild-type strain EC3132. JBacteriol 2002; 184:5307–5316）。尽管从自然界中发现了在其基因组中具有代谢蔗糖相关编码的野生大肠杆菌（Sahin-Toth, et al. Cloning, sequencing, and expressionof cscA invertase from Escherichia coli B-62. Can J Microbiol 1999; 45:418–422），并且利用这一属性进一步所构建的大肠杆菌HBUT-D，可以利用蔗糖为D-乳酸，但是D-乳酸的转化率仅为85%，光学纯度为98.3%，特别是发酵强度较低，仅为~1 g/(L·h),（Wang,et al. Homofermentative production of D-lactic acid from sucrose by ametabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol Lett 2012; 34:2069–2075）；利用重组技术获得能够代谢蔗糖的重组大肠杆菌HBUT-L，以蔗糖为碳源发酵96 h后L-乳酸的转化率仅为74.0％，产量仅为60 g/L，生产强度仅为0.389 g/(L·h)，（赵锦芳等.大肠杆菌工程菌利用甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸研究. 湖北农业科学, 2016）。可见，现有乳酸单体代表性的生产菌种，皆不能高效利用蔗糖并高效转化为乳酸单体。

发明内容

本发明目的是，通过基因克隆与基因重组技术在乳酸单体生产菌种中实现蔗糖酶分子的分泌表达，获得具有代谢蔗糖能力的乳酸单体生产菌种，所获得的菌种能够直接以蔗糖为原料高效合成乳酸单体，由此可拓展乳酸单体大规模生产的原料供给，优化蔗糖原料生产乳酸单体的生产技术，应用于蔗糖为原料的乳酸单体的规模化生产。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一，是通过分子克隆与基因重组技术获得水解蔗糖为葡萄糖和果糖的蔗糖酶，其编码基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1、3或5的序列特征，其氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2、4或6的序列特征。

本发明提供的技术方案之二，是含有上述蔗糖酶编码基因的重组质粒或重组表达盒以及乳酸单体生产重组菌株。

优选地，所述重组质粒采用的表达载体包括但不限于pUC18，pUC19，pBR322，pBlueScript SK(-)，pMD18，pMD19，pMD20，pHY300PLK，pET20a，pET20b，pET22a，pET22b，pET28a，pET28b、pND113、pHY-WZX或pBL-WZX；

更优选地，所述重组载体采用的表达载体，含有来源于地衣芽胞杆菌淀粉酶启动子P_amyL（Niu DD & Wang ZX, 2007, 34:357–362）、T7启动子（GenBank登录号：M38302.1）、Tet启动子（GenBank登录号：K01791.1）、枯草杆菌木糖启动子P_xyl启动子、巨大芽胞杆菌木糖P_xyl启动子或地衣芽胞杆菌启动子P_xyl（王珊瑛. 江南大学, 2016）或乳糖诱导启动子P_lac（Dickson RC. 1975, 187:27-35），含有来源于地衣芽胞杆菌淀粉酶amyL的信号肽（Niu DD& Wang ZX, 2007, 34:357–362）；碱性蛋白酶aprE的信号肽（王倩. 中国农业科技导报,2019, 21:61-69）或pelB信号肽（吴若凡. 生物加工过程, 2016,14:45-50）及ompA信号肽（杨涛. 过程工程学报, 2020, 20:1210-1217）编码序列所得；进一步为pHY-WZX和pBL-WZX(ZL200510051648)，进一步为pBL-WZX(ZL200510051648)；

优选地，所述重组菌株包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、凝结芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌等；

更优选地，所述重组菌株是在乳酸单体生产菌株大肠杆菌CGMCC 11059和CGMCC11060的基础上，通过分子克隆与基因重组技术获得的；

更优选地，本发明提供了一种代谢蔗糖高产L-乳酸单体的大肠杆菌SEC168L、SEC168L1和SEC168L2；提供了一种代谢蔗糖高产D-乳酸单体的大肠杆菌SEC168D、SEC168D1和SEC168D2；所述菌株是将蔗糖酶编码基因克隆在pBL-WZX质粒中，并分别在大肠杆菌CGMCC 11059和大肠杆菌CGMCC 11060中进行表达所得；重组大肠杆菌SEC168L、SEC168L1、SEC168L2、SEC168D、SEC168D1和SEC168D2具有合成和分泌蔗糖酶的能力并且具有代谢蔗糖的能力；

更优选地，本发明提供了一种代谢蔗糖高产L-乳酸单体的大肠杆菌SEC368L、SEC368L1和SEC368L2；提供了一种代谢蔗糖高产D-乳酸单体的大肠杆菌SEC368D、SEC368D1和SEC368D2；所述菌株是通过将蔗糖酶的表达盒整合到大肠杆菌CGMCC 11059或大肠杆菌CGMCC 11060的基因组中进行表达所得；重组大肠杆菌SEC368L、SEC368L1、SEC368L2、SEC368D、SEC368D1和SEC368D2具有合成和分泌蔗糖酶的能力并且具有代谢蔗糖的能力；

利用乳酸单体生产重组菌株以蔗糖为原料生产乳酸单体的方法为：在无机盐培养基中添加2~5wt%的蔗糖，以1%~10%的接种量接入生产菌株，在25~37℃、通风0.1~2 vvm和1-1000 r/min下培养6~12 h，然后关闭通风并降低转速到1~200 r/min，提高发酵温度到37~50℃，然后分批补加终浓度为3~10 wt.%的蔗糖溶液或以3~25 g/(L*h)的流加速度流加10~60 wt.%蔗糖溶液，过程中通过流加5~20wt.%氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0~7.5。

有益效果：

本发明提供的从蔗糖生产乳酸单体的高效生产菌种，能够在深层发酵时代谢蔗糖高效合成高光学纯度和高化学纯度的乳酸单体（D-乳酸或L-乳酸），乳酸单体的发酵水平可以达到150 g/L以上，光学纯度可以达到99.9%以上，化学纯度可以达到98%以上，蔗糖到乳酸单体的转化率可以达到102%以上。本发明有助于拓展乳酸单体大规模生产的原料供给，优化蔗糖原料生产乳酸单体的生产技术，应用于蔗糖为原料的乳酸单体的规模化生产，可进一步改善甘蔗种植业和甜菜种植业的经济效益与产业结构。本发明也可直接用于其他原料如糖蜜、菊竽、牛蒡、甘蔗汁、甜菜汁等的乳酸单体的生产；其中的L-乳酸生产技术还可以经过简单工艺调整后，用于如以甘蔗、甜菜、菊竽、牛蒡等为粗原料的新产品如乳酸饮品的开发。

附图说明

图1分泌表达蔗糖酶重组质粒的物理图谱， a：重组表达质粒pBL-SucSc，b：重组表达质粒pBL-SucAn，c：重组表达质粒pBL-SucAo。

图2重组菌在蔗糖为唯一碳源的培养基上的生长情况， A：1：CGMCC 11059，2：SEC168D，3：SEC168D1，4：SEC168D2；B：a：CGMCC 11060，b：SEC168L，3：SEC168L1，4：SEC168L2。

图3表达蔗糖酶的定点整合表达盒，a：dld::sucSc-difGm，b：dld::sucSc-difGm，c：dld::sucSc-difGm，A：lldD::sucSc-difGm，B：lldD::sucSc-difGm，C：lldD::sucSc- difGm。

图4 定点整合重组菌在蔗糖为唯一碳源的培养基上的生长情况，A：a：CGMCC11059，b：SEC368D，c：SEC368D1，d：SEC368D2；B：i：CGMCC 11060，ii：SEC368L，iii：SEC368L1，iv：SEC368L2。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所采用的出发菌株为代谢工程大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC NO.11059和CGMCC NO.11060（已公开于ZL201580000781.7中），分别为D-乳酸单体生产菌和L-乳酸单体生产菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏日期均为2015年7月7日。

本发明所采用的蔗糖酶，是酿酒酵母、黑曲霉或米曲霉来源的蔗糖酶，其编码基因为通过密码子优化后经化学合成获得，其核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1、3或5的序列特征，其氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2、4或6的序列特征。

本发明所使用的质粒pBL-WZX为现有技术，其构建方法已通过中国发明专利（王正祥，牛丹丹. 中国发明专利，ZL200510051648）公开；

本发明用于能够代谢蔗糖合成乳酸单体的菌种的构建方法，是通过基因克隆与基因重组技术，在表达载体中进行克隆和获得蔗糖酶的表达质粒，并转化入乳酸单体生成菌株中获得重组菌，实现蔗糖酶的分泌表达；或通过基因的定点整合将蔗糖酶表达盒整合到乳酸单体生成菌株的基因组中获得重组菌，实现蔗糖酶的分泌表达；进一步通过建立并优化发酵条件与工艺，用于以蔗糖为原料的乳酸单体的工业化制造。

本发明采用的主要实验方法如下：

1、基因克隆、基因重组与表达质粒的构建

常规分子克隆操作参考文献方法（Sambrook等。Molecular Cloning：ALaboratory Manual, 1989）进行。蔗糖酶编码基因作为本发明中的目标基因；基础表达载体为pBL-WZX (王正祥，牛丹丹。中国发明专利，ZL200510051648)。蔗糖酶的编码基因经PCR扩增后克隆入pBL-WZX的表达载体中，获得表达蔗糖酶的重组质粒。

2、染色体DNA的提取

大肠杆菌染色体DNA提取方法按文献（诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994）进行。

3、质粒DNA的提取

质粒DNA的提取在用一定浓度的溶菌酶裂解细胞壁后使用Sigma公司的质粒小提试剂盒进行。

4、基因扩增

DNA扩增在0.2 mL PCR薄壁管中进行。PCR扩增条件为：1×(95℃ 5 min)；30×(94℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30~ 300 s)；1×(72℃ 10 min)。依据不同扩增长度，PCR反应的延伸温度和时间有所不同。除特别注明外，所有PCR反应皆使用Pfu DNA聚合酶进行。

5、大肠杆菌定点整合

参照文献（周丽等. 基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法. 微生物学通报, 2010, 37:923−928）介绍的方法进行。主要步骤如下：(1) 以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因序列并克隆入合适载体中，选择合适的酶切位点酶切或通过反向PCR扩增去除该基因序列中部的部分序列，同步克隆入difGm片段，获得突变盒片段(即：同源臂1-dif-Gm-dif-同源臂2)；进一步通过在dif序列的外侧存在的Stu1位点，将待表达的外源基因表达盒克隆入其中，由此获得带有外源基因表达盒的定点整合序列。(2) 采用PCR扩增技术制备上述定点整合表达盒序列，将该片段纯化后电转化含有辅助质粒pKD46的受体菌株。(3) 在辅助质粒pKD46所产生的Red重组酶的作用下，上述DNA片段与染色体上的目的基因进行双交换，替换目的基因的同时带入目的基因表达盒序列，重组转化子可利用突变盒上带有的庆大霉素抗性标记筛选出。该突变株再在自身产生的Xer重组酶的作用下进行两个dif位点的重组，环化去除抗生素抗性基因。正确转化子经菌落PCR验证、质粒提取酶切、发酵验证功能等方法验证。

6 、重组菌以蔗糖为碳源的生长情况及蔗糖酶酶活检测

（1）在以蔗糖为碳源的M9培养基（田康明等，生物工程学报, 29: 111-114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1-10, 2013）上，通过划线或点种接入重组菌，37℃下培养24 h，观察生长情况。

（2）在以蔗糖为碳源的M9培养液（田康明等，生物工程学报, 29: 111-114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1-10, 2013）中，接入重组菌，37℃和200 r/min下培养36h，取样测定OD，观察其生长情况。

（3）在LB培养液中接入重组菌，37℃下200 r/min培养24 h，离心取上清。基本方法是，将800 μL 6.75%（w/v）蔗糖液置于37℃条件下预热5 min，取200 μL酶液加入其中，37℃下准确反应30 min，85℃加热10 min灭活酶，冷却至室温。使用生物传感仪测定葡萄糖含量。

蔗糖酶活定义：在37℃，pH 6.5条件下，每分钟水解产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

7 、摇瓶发酵试验

在250 mL三角瓶中装50~100 mL发酵培养基（十二水磷酸氢二钠0.5%~2.5%，氯化钠0.02%~0.1%，磷酸二氢钾0.1%~1.0%，氯化铵0.01%~0.5%，蔗糖0.1%~1.0%；pH 7.0），接种重组菌，30℃~37℃、pH 5.5~7.5、100~250 r/min摇床培养下培养5~15 h。分别补加终浓度为1%~7%的蔗糖和1.0~5.0 g碳酸钙后进入静置培养厌氧产酸阶段，取样测定发酵液中菌体量、残糖和L-乳酸或D-乳酸的含量。

8、发酵罐发酵试验

取发酵菌种的单个菌落，接种于50 mL的LB液体培养基（诸葛健王正祥工业微生物实验技术手册，北京：中国轻工业出版社，1994）中，30℃~37℃、100~250 r/min摇床培养5~15 h，作为一级种子液。将一级种子液接种于150 mL以蔗糖为碳源的M9液体培养基（田康明等，生物工程学报, 29: 111-114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1-10, 2013）中，起始糖浓度均为0.1%~1.0%，30℃~37℃、100~250 r/min摇床培养5~15 h，作为二级种子液。将二级种子液按照起始OD值0.1~1.0的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后发酵罐初始体积为工作体积的25%-60%，发酵按照两阶段发酵法进行（田康明等，生物工程学报, 29: 111-114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1-10, 2013）。发酵中的菌体生长阶段，温度控制30℃~37℃，维持pH 5.5~7.5，通气量为0.1 vvm~2.0 vvm，转速为1~1000 r/min；当菌体浓度达到OD₆₀₀为10~50，进入乳酸发酵阶段，温度控制37℃~50℃，搅拌转速调为1~200 r/min，流加5%~35%氢氧化钙悬浊液维持pH在6.0~7.5。发酵产酸阶段的蔗糖采用分批补料工艺或流加补料方法进行，其中，分批补料方法中，分四次补加终浓度1%~7%的糖液，总补加量为10%~25%（以起始发酵体积计）；流加补料方法中，通过糖液流加速度的控制，维持一定糖浓度，糖液总量为10%~25%（以起始发酵体积计）。

9、发酵过程分析

样本制备：取1 mL需检测的发酵液与50 μL的10 mol/L硫酸混匀后12000 r/min离心5 min，吸取适量的上清液并加入等体积浓度为20%的三氯乙酸，混匀后在4℃静置4 h，12000 r/min离心5 min，上清液用ddH₂O适当稀释后经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，进行相关组分的分析测定。

（1）葡萄糖浓度测定：将样品适当稀释后使用SBA-40C型生物传感仪进行葡萄糖浓度的测定，取三次平行数据的平均值。

（2）果糖浓度测定：用3,5-二硝基水杨酸法（DNS）法测定还原糖的浓度，测定值减去其中的葡萄糖含量即为样品中果糖的浓度，取三次平行数据的平均值。

（3）蔗糖浓度测定：采用HPLC方法进行测定，色谱分析条件：色谱柱为graceprevail carbohydrate ES 5u液相色谱柱，柱温为30℃，柱压为90 bar，流动相为65％乙腈（v/v），流速为1.0 mL/min，检测器漂移管温度为90℃，空气载气流速为2.2 mL/min，进样量为15 μL。

（4）D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、甲酸、乙酸和丁二酸含量测定：采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为HPX-87H有机酸分析柱，柱温为65℃，检测波长为210 nm，流动相为5mmol/L浓度的硫酸溶液，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。

（5）乳酸单体光学纯度测定：采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为AstecCLC-L光学纯度分析柱，柱温为25℃，检测波长为254 nm，流动相为5 mmol/L浓度的硫酸铜溶液，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

实施例1 游离分泌表达蔗糖酶

分别对来源于酿酒酵母、黑曲霉和米曲霉的蔗糖酶编码基因（分别如SEQ IDNO.1、3、5所示）进行密码子优化和化学合成，将合成的基因序列通过PCR扩增（引物见表1），PCR扩增产物用EcoRI酶切后克隆入pBL-WZX中，分别获得重组表达质粒pBL-SucSc（附图1a）、pBL-SucAn（附图1b）和pBL-SucAo（附图1c）。

将表达质粒pBL-SucSc、pBL-SucAn和pBL-SucAo分别转化入乳酸单体生产菌株CGMCC 11059，获得了相应的重组菌SEC168D、SEC168D1和SEC168D2；转化入乳酸单体生产菌株CGMCC 11060，获得了相应的重组菌SEC168L、SEC168L1和SEC168L2。

表1 本发明使用的引物序列

将上述重组菌在唯一碳源的培养基上培养36 h，转化入上述表达质粒的重组菌皆能够以蔗糖为唯一碳源良好生长，进一步证明了表达了蔗糖酶的乳酸单体生产菌株具有了代谢蔗糖的能力。通过摇瓶发酵制备其发酵上清并测定其蔗糖酶酶活，蔗糖酶的酶活表达水平在120~230 U/mL（表2），进一步说明了蔗糖酶在乳酸单体生产菌株中实现了分泌表达。

表2 重组菌分泌表达蔗糖酶的酶活水平

实施例2 整合分泌表达蔗糖酶

用引物Pec1和Pec2（表1）分别扩增出实施例1中构建的重组分泌表达蔗糖酶的sucSc、sucAn和sucAo表达盒，包括启动子、信号肽序列、蔗糖酶编码基因和终止子序列。

以大肠杆菌染色体DNA为模板，用引物P7和P8（表1）扩增出大小约0.9 kb的dld基因片段，用EcoRV酶切去除dld基因中部约0.4 kb片段，将来源于pSK-difGm的difGm克隆入其中，获得带有dld同源臂的重组片段dld::difGm；将上述获得的蔗糖酶的sucSc、sucAn和sucAo表达盒插入difGm外侧的StuI位点，获得表达蔗糖酶的定点整合表达盒dld::sucSc- difGm（附图3a），dld::sucSc-difGm（附图3b）和dld::sucSc-difGm（附图3c），采用电转化方法将其分别转化入乳酸单体生产菌株CGMCC 11059中，通过筛选，获得了蔗糖酶表达盒正确整合到乳酸单体生产菌株的基因组中重组菌SEC368D、SEC368D1和SEC368D2。

相似地，以大肠杆菌染色体DNA为模板，用引物P9和P10及P11和P12（表1）制备lldD基因片段并克隆入difGm，获得带有lldD同源臂的重组片段lldD::difGm；将上述获得的蔗糖酶的sucSc、sucAn和sucAo表达盒插入含有同源重组片段lldD::difGm中difGm外侧的StuI位点，获得表达蔗糖酶的定点整合表达盒lldD::sucSc-difGm（附图3A），lldD::sucSc- difGm（附图3B）和lldD::sucSc-difGm（附图3C），采用电转化方法将其分别转化入乳酸单体生产菌株CGMCC 11060中，通过筛选，获得了蔗糖酶表达盒正确整合到乳酸单体生产菌株的基因组中重组菌SEC368L、SEC368L1和SEC368L2。

将上述所获得的重组菌在以蔗糖为唯一碳源的培养基上培养36 h，上述重组菌皆能够以蔗糖为唯一碳源生长（附图4），表达了蔗糖酶的乳酸单体生产菌株具有了代谢蔗糖的能力。通过摇瓶发酵制备其发酵上清并测定其蔗糖酶酶活，蔗糖酶的酶活表达水平在20~75 U/mL（表3），进一步说明了蔗糖酶在乳酸单体生产菌株中实现了分泌表达。

表3 重组菌分泌表达蔗糖酶的酶活水平

实施例3 补料工艺下重组菌从蔗糖生产乳酸单体

将乳酸生产菌种的种子液（二级种子液），接种于150 mL补加0.5wt.%蔗糖的M9液体培养基中，37℃、200 r/min摇床培养10 h后，取培养液按照起始OD值0.3的接种量接种于蔗糖浓度为30 g/L的M9液体培养基中，接种后50 L发酵罐初始体积为25 L，温度控制为37℃、通气量为1.5 vvm、搅拌转速为1000 r/min，用氨水维持pH 6.5；当菌体浓度达到OD600为30，关闭通风、搅拌转速为200 r/min、发酵温度控制为40℃，将总量蔗糖（以发酵起始体积计，蔗糖的添加总量约为240 g/L）分4次补加入发酵罐，流加25wt.%氢氧化钙悬浊液维持pH在7.0，发酵结束前残糖浓度低于0.5 g/L后结束发酵。

在此发酵条件下，D-乳酸和L-乳酸的生产水平在138-165 g/L之间，平均产酸速率达到4.76 g/(L h)~5.32 g/(L h)，糖酸转化率为98.7%~102.5%，D-乳酸和L-乳酸的光学纯度均高于99.9%，化学纯度均高于98%（表4）。

表4 蔗糖为原料补加工艺下生产D-乳酸和L-乳酸

实施例4 流加工艺下重组菌从蔗糖生产乳酸单体

将乳酸生产菌种的种子液（二级种子液），接种于150 mL M9液体培养基中，起始蔗糖浓度为0.5%，37℃、200 r/min摇床培养10 h后，取培养液按照起始OD值0.3的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后50 L发酵罐初始体积为25 L，初始蔗糖浓度为30g/L。发酵在37℃、1000 r/min和1.5 vvm通气量下开始，用氨水维持pH 6.5；当菌体浓度达到OD600为30时，关闭通风、调节发酵温度至40℃和搅拌转速为200 r/min，按20 g/(L h)速度流加蔗糖溶液（以发酵起始体积计，蔗糖的添加总量约为240 g/L），流加25wt.%氢氧化钙悬浊液维持pH在7.0，发酵结束前残糖浓度低于0.5 g/L后结束发酵。

运用上述发酵技术，发酵结束时，L-乳酸的积累浓度为153.9~168.8 g/L，L-乳酸单体生产的平均发酵强度为6.22-6.77 g/(L·h)，L-乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.4%，糖酸转化率不低于102%；发酵结束时，D-乳酸单体积累浓度为153.5-157.9g/L，D-乳酸单体生产的平均发酵强度为5.04-5.45 g/(L·h)，D-乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.5%，糖酸转化率不低于102%（表5）。

表5 蔗糖为原料流加工艺下生产D-乳酸和L-乳酸

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株及其获得方法

<130> 20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> sucSc 人工序列

<400> 1

gaattcatga ctaacgagac ctctgatcgc ccgctggttc actttactcc gaataaaggt 60

tggatgaacg accctaacgg tctgtggtac gacgccaagg aaggtaagtg gcacctgtac 120

ttccaataca atccaaacga tacggtctgg ggtctgccgc tgttttgggg tcacgcaacg 180

agcaatgacc tgacccactg gcaggacgaa cctgtggcca tcgcaccgaa acgcaacgat 240

agcggtgcat actccggttc tatggttatc gaccataaca acacctctgg tttcttcaac 300

gacaccgttg acccgcgcca gcgctgtgtt gcaatctgga cctacaacac gccggagtct 360

gaggagcagt acatctccta tagcctggac ggcggctaca cgtttaccga gtatcagaag 420

aacccggtac tggcggcgaa ctctacccag tttcgcgatc cgaaagtttt ttggtatgaa 480

ccgtcccaga aatggattat gaccgcagct aaatctcagg attacaagat cgagatctac 540

agctctgacg acctgaaatc ttggaaactg gaatccgcct tcgcgaacga aggtttcctg 600

ggttaccagt acgaatgtcc gggtctgatt gaagtaccga ccgagcagga cccgtctaaa 660

agccattggg ttatgttcat ctccattaac ccaggcgctc cggcgggtgg tagctttaac 720

cagtatttcg tcggttcttt caacggtact cactttgagg cattcgataa ccagtctcgc 780

gtcgtagatt tcggtaagga ctattatgcc ctgcagactt tcttcaacac cgacccaacc 840

tacggttctg ccctgggtat tgcctgggcg tctaactggg aatactccgc ctttgttccg 900

accaacccgt ggcgttcttc tatgtccctg gtgcgcaagt tctccctgaa cactgaatac 960

caggccaacc cggaaaccga actgatcaac ctgaaagcgg aaccgatcct gaacatttcc 1020

aacgcaggtc cgtggctgca cttcgcgtcc aactctacgc tgaccaaagc taacagcttc 1080

agcgttgatc tgtctaacag caccggcacg ctggagttcg agctggtata tgcagtcaac 1140

accacccagt ctgtttctaa aagcgtattc tccgacctga gcctgtggtt caaaggcctg 1200

gaagacccgg aggaatacct gcgtatgggc tttgaagcta gcgcgtcctc tttctttctg 1260

gaccgcggta acagcaaggt gaaatttgtt aaggaaaacc cgtacttcac gaaccgtatg 1320

tccgtgaaca accagccttt taagagcgag aacgatctgt cttactataa agtttatggt 1380

ctgctggacc agaatatcct ggagctgtac ttcaacgacg gcgacgttgt aagcaccaac 1440

acctacttca tgaccactgg caacgcactg ggttctgtta acatgactac gggtgtcgac 1500

aacctgttct atatcgacaa atttcaggtt cgcgaggtta aataa 1545

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 酿酒酵母蔗糖酶

<400> 2

Glu Phe Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr

1 5 10 15

Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Ala

20 25 30

Lys Glu Gly Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Thr

35 40 45

Val Trp Gly Leu Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asn Asp Leu

50 55 60

Thr His Trp Gln Asp Glu Pro Val Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp

65 70 75 80

Ser Gly Ala Tyr Ser Gly Ser Met Val Ile Asp His Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Gly Phe Phe Asn Asp Thr Val Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile

100 105 110

Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser

115 120 125

Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu

130 135 140

Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu

145 150 155 160

Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Lys

165 170 175

Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu Glu Ser

180 185 190

Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly

195 200 205

Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser His Trp Val

210 215 220

Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn

225 230 235 240

Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp

245 250 255

Asn Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln

260 265 270

Thr Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala

275 280 285

Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp

290 295 300

Arg Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr

305 310 315 320

Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile

325 330 335

Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Leu His Phe Ala Ser Asn Ser

340 345 350

Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser Phe Ser Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr

355 360 365

Gly Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Ser

370 375 380

Val Ser Lys Ser Val Phe Ser Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu

385 390 395 400

Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Ala Ser Ala Ser

405 410 415

Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu

420 425 430

Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro Phe Lys

435 440 445

Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu Asp Gln

450 455 460

Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser Thr Asn

465 470 475 480

Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn Met Thr

485 490 495

Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val Arg Glu

500 505 510

Val Lys

<210> 3

<211> 1563

<212> DNA

<213> sucAn 人工序列

<400> 3

gaattcttca actacgatca accttatcgt ggtcagtacc acttttcccc tcagaagaac 60

tggatgaacg atccgaacgg tctgctgtac cataacggta cctatcatct gttcttccag 120

tataacccag gtggcatcga atggggtaac atcagctggg gtcatgcaac ctccgaggat 180

ctgactcatt gggaagaaca gcctgtggca ctgctggctc gtggctacgg tagcgacgta 240

accgaaatgt acttcagcgg ctctgccgta gcggatgtaa acaacacttc cggctttggc 300

aaagacggta aaaccccgct ggtggcaatg tacactagct actacccggt ggcacaaact 360

ctgccgagcg gtcagaccgt gcaggaagac cagcagtctc agtccattgc atattccctg 420

gacgacggtc tgacttggac cacttatgac gctgctaacc cggtcatccc gaatccacca 480

cagccatatc aggcgcagta ccagaacttt cgtgacccgt tcgtcttctg gcacgatgaa 540

tctcacaaat gggtggttgt tacttccatc gctgaactgc acaagctggc gatctacact 600

tctgataacc tgaaagactg gaaactggtc agcgagttcg gcccgtacaa tgcgcagggt 660

ggcgtttggg aatgtcctgg tctgttcaag ctgccgctgg atggtggttc ctccaccaaa 720

tgggtaatta cttctggcct gaatcctggt ggtccgccgg gtactgtagg ctctggtacc 780

cagtactttg tgggtgaatt tgacggtacc accttcaccc cggatgccga cacggtctat 840

ccaggcaact ccactgcgaa ctggatggac tggggtcctg acttttacgc tgcagcaggc 900

tacaatggtc tgtctatcaa agatcacgtc cacatcggct ggatgaacaa ctggcagtac 960

ggtgcgaaca tcccgactta cccgtggcgt agcgcaatgg ctattccgcg tcatctggca 1020

ctgaagacca ttaacaacaa aacgactctg gttcagcaac ctcaggaagc gtggtcctcc 1080

atcagcagca aacacccgct gtacagccgc acctactcca ccttttccga aggttccacc 1140

aacgcctcta ccaccggtga aaccttccgc gtggatctgt ctttctctgc gacgtctaaa 1200

gcaagcacgt tcgctattgc gctgcgtgcg tccgctaact tcactgaaca gaccctggcc 1260

ggttatgact tcgctaaaca gcagatcttc ctggaccgta ccaaatccgg cgatgtaagc 1320

ttcgacaaca ccttcgcgag cgtgtaccat ggtccgctgg ttccggactc tacgggcatg 1380

gttcgcctgt ctatcttcgt agaccgcagc tccgttgaag ttttcggtgg tcagggtgaa 1440

accaccctga ccgctcaaat ctttccgtcc aacgatgctg tacacgcgcg tctggtttct 1500

accggtggtg caaccgaaga cgtgcgtgta gatgtacata atatcacctc cacctggaac 1560

taa 1563

<210> 4

<211> 520

<212> PRT

<213> 黑曲霉蔗糖酶

<400> 4

Glu Phe Phe Asn Tyr Asp Gln Pro Tyr Arg Gly Gln Tyr His Phe Ser

1 5 10 15

Pro Gln Lys Asn Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Leu Tyr His Asn

20 25 30

Gly Thr Tyr His Leu Phe Phe Gln Tyr Asn Pro Gly Gly Ile Glu Trp

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Gly His Ala Thr Ser Glu Asp Leu Thr His Trp

50 55 60

Glu Glu Gln Pro Val Ala Leu Leu Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Asp Val

65 70 75 80

Thr Glu Met Tyr Phe Ser Gly Ser Ala Val Ala Asp Val Asn Asn Thr

85 90 95

Ser Gly Phe Gly Lys Asp Gly Lys Thr Pro Leu Val Ala Met Tyr Thr

100 105 110

Ser Tyr Tyr Pro Val Ala Gln Thr Leu Pro Ser Gly Gln Thr Val Gln

115 120 125

Glu Asp Gln Gln Ser Gln Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Asp Asp Gly Leu

130 135 140

Thr Trp Thr Thr Tyr Asp Ala Ala Asn Pro Val Ile Pro Asn Pro Pro

145 150 155 160

Gln Pro Tyr Gln Ala Gln Tyr Gln Asn Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe

165 170 175

Trp His Asp Glu Ser His Lys Trp Val Val Val Thr Ser Ile Ala Glu

180 185 190

Leu His Lys Leu Ala Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Leu Lys Asp Trp Lys

195 200 205

Leu Val Ser Glu Phe Gly Pro Tyr Asn Ala Gln Gly Gly Val Trp Glu

210 215 220

Cys Pro Gly Leu Phe Lys Leu Pro Leu Asp Gly Gly Ser Ser Thr Lys

225 230 235 240

Trp Val Ile Thr Ser Gly Leu Asn Pro Gly Gly Pro Pro Gly Thr Val

245 250 255

Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Phe Val Gly Glu Phe Asp Gly Thr Thr Phe

260 265 270

Thr Pro Asp Ala Asp Thr Val Tyr Pro Gly Asn Ser Thr Ala Asn Trp

275 280 285

Met Asp Trp Gly Pro Asp Phe Tyr Ala Ala Ala Gly Tyr Asn Gly Leu

290 295 300

Ser Ile Lys Asp His Val His Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Gln Tyr

305 310 315 320

Gly Ala Asn Ile Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Ser Ala Met Ala Ile Pro

325 330 335

Arg His Leu Ala Leu Lys Thr Ile Asn Asn Lys Thr Thr Leu Val Gln

340 345 350

Gln Pro Gln Glu Ala Trp Ser Ser Ile Ser Ser Lys His Pro Leu Tyr

355 360 365

Ser Arg Thr Tyr Ser Thr Phe Ser Glu Gly Ser Thr Asn Ala Ser Thr

370 375 380

Thr Gly Glu Thr Phe Arg Val Asp Leu Ser Phe Ser Ala Thr Ser Lys

385 390 395 400

Ala Ser Thr Phe Ala Ile Ala Leu Arg Ala Ser Ala Asn Phe Thr Glu

405 410 415

Gln Thr Leu Ala Gly Tyr Asp Phe Ala Lys Gln Gln Ile Phe Leu Asp

420 425 430

Arg Thr Lys Ser Gly Asp Val Ser Phe Asp Asn Thr Phe Ala Ser Val

435 440 445

Tyr His Gly Pro Leu Val Pro Asp Ser Thr Gly Met Val Arg Leu Ser

450 455 460

Ile Phe Val Asp Arg Ser Ser Val Glu Val Phe Gly Gly Gln Gly Glu

465 470 475 480

Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ile Phe Pro Ser Asn Asp Ala Val His Ala

485 490 495

Arg Leu Val Ser Thr Gly Gly Ala Thr Glu Asp Val Arg Val Asp Val

500 505 510

His Asn Ile Thr Ser Thr Trp Asn

515 520

<210> 5

<211> 1533

<212> DNA

<213> sucAo 人工序列

<400> 5

gaattcgctt cctattccgg tgacctgcgt ccacagactc atttttctcc gccatctaac 60

tttatgaatg acccgaacgg cctgttctac gattccaaac gtggcgttta tcacctgtat 120

tatcaatata acccgaccgc taccgtagcc ggtaaccagc attggggtca tgcgactagc 180

ccggacctgt accactggac gaatcagccg atcgcactgg cgggcgataa gccagaagag 240

tatatcttct ccggctccgc tgttgtggat tctaacaata cgtctggttt cttcccggac 300

caggatgatg gcgttattgc catctacact gttgacaccc cgaccctgga aactcagcac 360

attgcatatt ctcgtgatgg cggttatacg ttcaccaagt acgaaaacaa cccggttatc 420

gacattggca gcaaacagtt tcgcgatcca caggttgttt ggcacccgga gacgcagcag 480

tgggtaatga ctattgctta cgcacaagac ctggttatcg gtttttacac gagcccgaac 540

ctgaaagatt ggacccacgc ctctaacttc acccaggaag gcctgccggg tgaccaattc 600

gaatgtccga acctggtaaa actgagcgtt gaccgtgcgg tgagcgaaga gactagcaaa 660

tttgttctgt ttatctctgt aaaccctggt gcaccactgg gtggtagcgg tactttttac 720

gtcgttggtg attttaacgg tactcacttc acgagcgagg tagtccagga aaccctgttc 780

gacttcagca aagacaacta tgctgcacaa tggtacagcg gcattccgga gaatgagccg 840

cctgtttcca ttggctgggc atccaattgg gactacaccg aagaagttcc gaccggtccg 900

ctggaaggtt ggcgttctgc tatgactctg ccgcgtgcac atactctgac caaggtaaac 960

ggtgtgtgga ctgtcaccca ctctccgttc gaaggcctgt ctgctctgaa aggccgtcag 1020

ctggtatcca aaagcgtcca ttccggcgac gttaaagcga acttctctgg cgttccatcc 1080

aacgcagtgt acttcgacgt tactctgaaa ggtatcgacg tagctaaacc gaccggccgt 1140

gttaatttta atttcacctc tagcgtcagc ggcgagttcc tggacggtgg tgtgtccctg 1200

gatgacagca gcttttggat ctctcgcgca ggcacccacc tgttcactat cgaagacaac 1260

ggcaattata cttcctcttc caccaccact atcagctctt tcggtaatgg tactttctct 1320

ttcagcggtg ttatcgaccg ctccgtgttc gaagtgttcc tgggtcagga cggcatccag 1380

agcggtacca tgaccttttt cccatcttcc cctctggata ccctggcagt ttctgctgaa 1440

gatctgggtg accgcgcatc tgtaagcgtt aaagcatggg gcctgcagtc tggttggaac 1500

tctactaccg catccaagcg cttccgtgct taa 1533

<210> 6

<211> 510

<212> PRT

<213> 米曲霉蔗糖酶

<400> 6

Glu Phe Ala Ser Tyr Ser Gly Asp Leu Arg Pro Gln Thr His Phe Ser

1 5 10 15

Pro Pro Ser Asn Phe Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Phe Tyr Asp Ser

20 25 30

Lys Arg Gly Val Tyr His Leu Tyr Tyr Gln Tyr Asn Pro Thr Ala Thr

35 40 45

Val Ala Gly Asn Gln His Trp Gly His Ala Thr Ser Pro Asp Leu Tyr

50 55 60

His Trp Thr Asn Gln Pro Ile Ala Leu Ala Gly Asp Lys Pro Glu Glu

65 70 75 80

Tyr Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Val Asp Ser Asn Asn Thr Ser Gly

85 90 95

Phe Phe Pro Asp Gln Asp Asp Gly Val Ile Ala Ile Tyr Thr Val Asp

100 105 110

Thr Pro Thr Leu Glu Thr Gln His Ile Ala Tyr Ser Arg Asp Gly Gly

115 120 125

Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Val Ile Asp Ile Gly Ser

130 135 140

Lys Gln Phe Arg Asp Pro Gln Val Val Trp His Pro Glu Thr Gln Gln

145 150 155 160

Trp Val Met Thr Ile Ala Tyr Ala Gln Asp Leu Val Ile Gly Phe Tyr

165 170 175

Thr Ser Pro Asn Leu Lys Asp Trp Thr His Ala Ser Asn Phe Thr Gln

180 185 190

Glu Gly Leu Pro Gly Asp Gln Phe Glu Cys Pro Asn Leu Val Lys Leu

195 200 205

Ser Val Asp Arg Ala Val Ser Glu Glu Thr Ser Lys Phe Val Leu Phe

210 215 220

Ile Ser Val Asn Pro Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ser Gly Thr Phe Tyr

225 230 235 240

Val Val Gly Asp Phe Asn Gly Thr His Phe Thr Ser Glu Val Val Gln

245 250 255

Glu Thr Leu Phe Asp Phe Ser Lys Asp Asn Tyr Ala Ala Gln Trp Tyr

260 265 270

Ser Gly Ile Pro Glu Asn Glu Pro Pro Val Ser Ile Gly Trp Ala Ser

275 280 285

Asn Trp Asp Tyr Thr Glu Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Glu Gly Trp

290 295 300

Arg Ser Ala Met Thr Leu Pro Arg Ala His Thr Leu Thr Lys Val Asn

305 310 315 320

Gly Val Trp Thr Val Thr His Ser Pro Phe Glu Gly Leu Ser Ala Leu

325 330 335

Lys Gly Arg Gln Leu Val Ser Lys Ser Val His Ser Gly Asp Val Lys

340 345 350

Ala Asn Phe Ser Gly Val Pro Ser Asn Ala Val Tyr Phe Asp Val Thr

355 360 365

Leu Lys Gly Ile Asp Val Ala Lys Pro Thr Gly Arg Val Asn Phe Asn

370 375 380

Phe Thr Ser Ser Val Ser Gly Glu Phe Leu Asp Gly Gly Val Ser Leu

385 390 395 400

Asp Asp Ser Ser Phe Trp Ile Ser Arg Ala Gly Thr His Leu Phe Thr

405 410 415

Ile Glu Asp Asn Gly Asn Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ile Ser

420 425 430

Ser Phe Gly Asn Gly Thr Phe Ser Phe Ser Gly Val Ile Asp Arg Ser

435 440 445

Val Phe Glu Val Phe Leu Gly Gln Asp Gly Ile Gln Ser Gly Thr Met

450 455 460

Thr Phe Phe Pro Ser Ser Pro Leu Asp Thr Leu Ala Val Ser Ala Glu

465 470 475 480

Asp Leu Gly Asp Arg Ala Ser Val Ser Val Lys Ala Trp Gly Leu Gln

485 490 495

Ser Gly Trp Asn Ser Thr Thr Ala Ser Lys Arg Phe Arg Ala

500 505 510

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgaattca tgactaacga gacct 25

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttatttaacc tcgcgaac 18

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagaattct tcaactacga tcaac 25

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttagttccag gtggag 16

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcgaattcg cttcctattc cggtg 25

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttaagcacgg aagcgc 16

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgaaatagac gcagatcggg aa 22

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccttgtctta taagacgg 18

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtacgtctt gataccttcg aagcgg 26

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggattcatgc tgttggtcgg atc 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgattattt ccgcagcca 19

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcaggcaact ctttacccag ccc 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgattattt ccgcagccag cg 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgactatgc cgcattccct ttc 23

Claims

1.一种以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株，其特征在于：所述生产菌株含有具有水解蔗糖为葡萄糖和果糖的蔗糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2、4或6所示，编码所述的蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3或5所示；所述菌株是通过分泌表达了蔗糖酶编码基因获得，具体为在蔗糖酶的N-端加入了信号肽序列和加入启动子序列，编码基因通过基因组定点整合的方式整合到菌种的基因组中或通过游离质粒进行游离表达；所述的生产菌株是以大肠杆菌CGMCC NO. 11059或CGMCC NO. 11060为底盘宿主菌。

2.利用权利要求1所述的生产菌株生产乳酸单体的方法，其特征在于：在无机盐培养基中添加2~5wt%的蔗糖，以1%~10%的接种量接入以蔗糖为原料生产乳酸单体的生产菌株，在25~37℃、通风0.1~2vvm和1~1000r/min下培养6~12h，然后关闭通风并降低转速到1~200r/min，提高发酵温度到37~50℃，然后分批补加终浓度为3~10wt.%的蔗糖溶液或以3~25g/(L*h)的流加速度流加10~60wt.%蔗糖溶液，过程中通过流加5~20wt.%氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0~7.5。