CN116536229A - 一种利用甘油生产乳酸单体的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵工程和基因工程技术领域，涉及一种可利用甘油高转化率合成乳酸单体的生产菌株及其获得方法，具体为细胞生长相关关键调控基因的克隆、表达、删除和以甘油为原料的乳酸单体的发酵生产。本发明体提供的工程菌以具有乳酸生产能力的菌株为宿主，通过温敏型质粒在宿主内游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因，获得细胞生长和增殖可以通过培养温度进行调控的乳酸单体生产新菌种，该菌种在配套的变温微好氧发酵工艺条件下甘油到乳酸的转化率提高到96％以上。

Description

一种利用甘油生产乳酸单体的菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及发酵工程和基因工程技术领域，涉及一种可利用甘油高转化率合成乳酸单体的生产菌株及其获得方法，具体为细胞生长相关关键调控基因的克隆、表达、删除和以甘油为原料的乳酸单体的发酵生产。
背景技术：
油脂水解工业和生物柴油副产的甘油是理想的发酵工业大宗原料之一。甘油作为原料应用于乳酸的发酵生产既有助于解决油脂水解工业和生物柴油工业副产物综合利用的问题，也有助于丰富乳酸单体发酵生产工业原料来源。与葡萄糖、木糖、乳糖等糖类物质相比较，甘油具有更高的还原性(Yazdani SS,Gonzalez R,Anaerobic fermentation ofglycerol:a path to economic viability for the biofuels industry[J].Curr OpinBiotechnol,2007,18(3):213-219)。因此，甘油作为原料用于产物合成时，如何提供足够的还原力受体，实现氧化还原力的平衡，是保证甘油到目标产物高转化效率的关键所在。通过甘油代谢途径的重构，选育适用于厌氧条件下利用甘油发酵生产乳酸的菌种是解决甘油代谢还原力不平衡的方法之一(Mazumdar et al.Engineered Escherichia coli strainsfor the homofermentative production of D-lactic acid from glycerol[J].ApplEnviron Microbiol,2010,76(13):4327-4336；Mazumdar et al.Efficient synthesis ofL-lactic acid from glycerol by metabolically engineered Escherichiacoli.Microbial Cell Factories 2013,12:7)。该策略实施过程中存在两个问题，一是甘油到D-乳酸的转化率较低，且发酵周期长乳酸合成速率低。除了甘油代谢途径改造的策略外，通过发酵产酸过程中限量供氧并配合乳酸合成途径强化和变温发酵工艺可以实现快速合成乳酸单体的目的(田康明,等.利用温度调节实现新型重组菌高效转化甘油为D-乳酸[J].生物工程学报,2013,29(1):111-114；田康明,等.代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸[J].生物工程学报,2013,29(9):1-10)。
本发明选择了对PDH复合体关键酶的表达进行调控。通过温敏型游离质粒表达PDH复合体的关键酶编码基因，同时删除染色体上原有的PDH复合体的关键酶编码基因。实现在低培养温度下游离质粒存在时，PDH复合体关键酶的表达可以正常进行，而在升高培养温度后，随着游离质粒的丢失，PDH复合体的关键酶也不再表达，进而实现对细胞生长和增殖的限制。即使在甘油为原料发酵合成乳酸单体的通风条件下，由于细胞中缺少PDH复合体的关键酶，其生长和增殖仍然受到限制。甘油最大限度的流向乳酸的合成，实现甘油为原料高转化率高合成速率发酵生产乳酸单体，发酵产酸阶段甘油到乳酸单体的转化率在96％以上。
发明内容：
本发明目的是通过基因克隆与基因重组技术在乳酸单体生产菌株中借助游离性温敏质粒和强启动子组合调控乳酸单体生产菌种的生长关键酶表达过程，实现甘油为发酵原料时在微好氧发酵条件下可以通过提高发酵温度最大限度限制细胞的生长，高转化率利用甘油合成乳酸单体。并配合变温微好氧发酵工艺建立了适用于甘油为原料的高效合成乳酸单体的发酵生产技术。
本发明提供的技术方案之一，是一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，所述工程菌以具有乳酸生产能力的菌株为宿主，通过温敏型质粒在宿主内游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因，获得细胞生长和增殖可以通过培养温度进行调控的乳酸单体生产新菌种，该菌种在配套的变温微好氧发酵工艺条件下甘油到乳酸的转化率提高到96％以上；
进一步地，所述PDH复合体中的关键酶，是催化丙酮酸为乙酰辅酶A过程中的酶，包括丙酮酸脱氢酶(E1p)、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)，aceE、aceF和lpdA基因分别编码这3种蛋白；
优选地，所述PDH复合体中的关键酶是二氢硫辛酰胺转乙酰基酶E2p，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；E2p由aceF基因编码，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述E2p的编码基因aceF通过克隆入温敏型质粒在宿主中进行游离表达，所述温敏型质粒具备编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质的功能；
更进一步地，所述温敏型质粒选自pKD3，pKD4，pKD46，pKD20或pKD13；
优选地，所述温敏型质粒为pKD46；
进一步地，温敏型质粒上还包含的启动子和终止子序列，用于控制PDH复合体中的关键酶的表达；所述启动子和终止子的来源包括但不限于大肠杆菌乳酸脱氢酶(LdhA)的启动子PldhA，地衣芽胞杆菌淀粉酶启动子PamyL(Niu DD&Wang ZX,2007,34:357–362)、T7启动子(GenBank登录号：M38302.1)、Tet启动子(GenBank登录号：K01791.1)、枯草杆菌木糖启动子Pxyl启动子、巨大芽胞杆菌木糖Pxyl启动子或地衣芽胞杆菌启动子Pxyl(王珊瑛.江南大学,2016)或乳糖诱导启动子Plac(Dickson RC.1975,187:27-35)，以及上述启动子对应终止子；
优选地，所述温敏型质粒上，含有来源于地衣芽胞杆菌淀粉酶启动子PamyL和终止子TamyL，PamyL的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，TamyL的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
进一步地，所述缺失PDH复合体中的关键酶的编码基因的表达的方式包括但不限于基因敲除、基因失活等方式，所述基因失活包括通过删除、敲除或插入片段使其功能失活的方式；
优选地，所述缺失PDH复合体中的关键酶的编码基因的表达的方式为基因敲除；
更优选地，借助温敏型质粒辅助同源重组的功能对宿主染色体上PDH复合体中关键酶的编码基因进行敲除；
进一步地，所述具有乳酸单体生产能力的宿主菌株包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、凝结芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌等；
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌CGMCC NO.11059或CGMCC NO.11060；
更优选地，所述利用甘油生产乳酸单体的基因工程菌，是以大肠杆菌CGMCC 11059或CGMCC11060为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PldhA和终止子TldhA克隆至温敏型质粒pKD46中，获得重组质粒pKD-PldhA-aceF，并将重组质粒pKD-PldhA-aceF转化至上述宿主中，同时敲除宿主菌中染色体上的aceF基因，获得高产D-乳酸和L-乳酸的重组大肠杆菌GSFD和GSFL；将重组大肠杆菌GSFD和GSFL经过42℃传代培养丢失重组质粒pKD-PldhA-aceF，获得重组菌GDFD和GDFL；进而以重组大肠杆菌GDFD或GDFL为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PamyL和终止子TamyL克隆至由pKD46质粒去除部分序列后获得的简化质粒pKDM中(与质粒pKD46比较，pKDM质粒删除了序列位置3391-6329的编码Exo、Beta、Gam三种蛋白的核酸序列片段)，获得重组质粒pKDM-PamyL-aceF，并将重组质粒pKDM-PamyL-aceF转化至上述宿主GDFD或GDFL中，获得重组大肠杆菌；
进一步地，以大肠杆菌CGMCC NO.11060为最初的宿主，获得可代谢利用甘油高转化率合成L-乳酸单体的大肠杆菌GYSFL；
进一步地，以大肠杆菌CGMCC NO.11059为最初的宿主，获得可代谢利用甘油高转化率合成D-乳酸单体的大肠杆菌GYSFD；
大肠杆菌GYSFL、GYSFD均具有细胞生长过程可通过温度改变精确调控的特征。
本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌在生产乳酸中的应用；
进一步地，采用上述基因工程菌通过发酵罐发酵生产乳酸的方法如下：
在无机盐培养基中添加2～5wt.％的甘油，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％培养4～16h，过程中通过流加5～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后将通风量调整为0.1～1.5vvm并降低转速到100～600r/min以维持溶解氧浓度为1～10％，提高发酵温度到35～55℃进入乳酸合成阶段，期间补加甘油，甘油补加总量为200～270g/L发酵液(以起始发酵体积计算)；乳酸合成阶段通过流加5～30wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0～7.5；当甘油浓度低于0.5g/L时，或甘油消耗速率低于1g/(L·h)时，或发酵液固形物含量过高难以搅拌时，结束发酵，整个发酵周期为30～40h；
进一步地，通过分批补加浓度为3～70wt.％的甘油溶液或以3～30g/(L·h)的流加速度流加10～70wt.％甘油溶液来补加甘油；
进一步地，所述无机盐培养基组成为(w/v)：十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，其余为水；
优选地，在无机盐培养基中添加3～4wt.％的甘油，以5％～8％的接种量接入生产菌株，在30～35℃、通风0.3～2vvm和200～1000r/min下培养6～8h，过程中通过流加15～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.5～7.0，然后将通风量调整为0.3～1.0vvm并降低转速到100～400r/min，提高发酵温度到40～50℃，然后分批补加浓度为50～60wt.％的甘油溶液或以8～20g/(L·h)的流加速度流加50～60wt.％甘油溶液使得甘油补加总量为230～240g/L发酵液(以起始发酵计算)，这一过程中通过流加20～25wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH6.5～7.0。
进一步地，采用上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产乳酸的方法如下：
按初始OD600为0.05～0.2将种子液结接种至摇瓶发酵培养基中，先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入微好氧产乳酸阶段，微好氧产乳酸阶段，按每L发酵液(发酵液初始体积)加入10～80g的甘油和20～60g的CaCO3，37～50℃、10～100r/min培养12～50h。
更进一步地，所述摇瓶发酵培养基组成如下：十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，甘油0.1％～1.0％；pH 7.0。
有益效果：
本发明提供的重组菌具有明显的利用甘油高转化率合成乳酸单体的能力。大规模发酵生产体系下，乳酸单体发酵水平达到155g/L以上，光学纯度99.9％以上，化学纯度98％以上，发酵产酸阶段甘油到乳酸的转化率由出发菌株的90％左右，提高到96％以上。本发明提供的技术在乳酸单体发酵生产过程中，有助于提高原料到乳酸单体的转化率，有效降低了发酵生产成本和产品提取精制成本。同时，本发明技术实现了以发酵温度为调控手段，精确控制乳酸单体生产过程中的细胞生长和增殖情况，无需外源限制性添加营养物。简洁控制工艺有助于实现乳酸单体发酵生产体系的智能化控制和无人工厂的建立。本发明也可直接应用于粗甘油作为原料的乳酸单体发酵生产，或经过适当调整后应用于葡萄糖、蔗糖、淀粉以及糖蜜、菊芋、牛蒡、甘蔗汁、甜菜汁、甘蔗渣酶解液、秸秆酶解液、竹叶酶解液和玉米芯酶解液等其他原料的乳酸单体发酵生产。
附图说明：
图1质粒pKD-PldhA-aceF的物理图谱质粒。
图2质粒pKD-PldhA-aceF经BamHI线性化后的电泳图谱。
图3质粒pMD-aceF(Ed)-difGm经HindIII线性化后的电泳图谱。
图4染色体基因组上aceF基因删除过程示意图。
图5重组菌GSFL和GSFD经引物aceFE-p1和aceFd-p2菌落PCR验证凝胶电泳图谱。
图6重组菌GSFL、GDFL(左)和GSFD、GDFD(右)在LB平板上30℃培养24h对比图。
图7质粒pKDM-PamyL-aceF的物理图谱质粒。
图8质粒pKDM-PamyL-aceF经BamHI线性化后的电泳图谱。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明优选的出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.11059和CGMCCNo.11060(已公开于ZL201580000781.7中)，分别为D-乳酸单体生产菌和L-乳酸单体生产菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏日期均为2015年7月7日。
本发明优选的丙酮酸形成乙酰辅酶A的关键酶(PDH复合体)是编码二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2p)的aceF基因，其编码基因通过PCR方式获得，其核苷酸序列具有SEQ IDNO.1的序列特征，其氨基酸序列具有SEQ ID NO.2的序列特征。
本发明所使用的质粒pKD46为现有技术，可通过商业途径进行购买，其构建方法也已通过文献(Datsenko and Wanner，PNAS.2000,97(12):6640-6645)公开。本发明所使用的PamyL启动子和TamyL终止子序列在前期研究中已完成功能验证(Niu DD&Wang ZX,2007,34:357-362)，其核苷酸序列具有SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。
本发明通过基因克隆与基因重组技术，首先将来源于大肠杆菌的二氢硫辛酰胺转乙酰基酶编码基因aceF(SEQ ID NO.1)，以及D-乳酸脱氢酶的启动子PldhA(SEQ ID NO.19)和终止子TldhA(SEQ ID NO.20)克隆入温度敏感型表达载体pKD46中，获得表达质粒pKD-PldhA-aceF，并转化入乳酸单体生产菌株中，然后通过同源重组将该菌株中染色体上原有aceF基因完整删除，获得细胞生长可通过培养温度调控的乳酸单体合成的重组菌，通过传代培养丢失质粒pKD-PldhA-aceF，获得aceF基因缺失菌株。将aceF基因，以及淀粉酶的启动子PamyL(SEQ ID NO.17)和终止子TamyL(SEQ ID NO.18)克隆入去除多余结构(编码Exo、Beta、Gam蛋白的基因)的温度敏感型表达载体pKDM中，获得的表达质粒pKDM-PamyL-aceF，并转化入上述aceF基因缺失菌株中，获得细胞生长可通过培养温度调控的乳酸单体合成的重组菌；进一步建立并优化发酵条件与工艺，通过控制发酵温度，实现在菌体生长阶段获得高活性的细胞工厂，且在乳酸发酵阶段限制细胞增殖，最大限度引导碳源流向产物合成，提高乳酸单体工业化制造的转化率。
本发明采用的主要实验方法如下：
1、基因克隆、基因重组与表达质粒的构建常规分子克隆操作参考文献方法(Sambrook等。Molecular Cloning：ALaboratory Manual,1989)进行。二氢硫辛酰胺转乙酰基酶编码基因aceF作为本发明中的目标基因；基础表达载体为pKD46，大肠杆菌基因组DNA作为模板，扩增目的基因序列，所得产物经合适的酶酶切消化后，和带有合适启动子的载体连接并化转，选择合适的酶切位点酶切或通过PCR扩增得到带有特定启动子的序列，克隆入质粒pKD46中。
2、染色体DNA的提取
大肠杆菌染色体DNA提取方法按文献(诸葛健王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)进行。
3、质粒DNA的提取
质粒DNA的提取在用一定浓度的溶菌酶裂解细胞壁后使用Sigma公司的质粒小提试剂盒进行。
4、基因扩增
DNA扩增在0.2mL PCR薄壁管中进行。PCR扩增条件为：11(95℃5min)；301(94℃30s，58℃30s，68℃30～300s)；11(68℃10min)。依据不同扩增长度，PCR反应的延伸温度和时间有所不同。
5、大肠杆菌定点整合
参照文献(周丽等.微生物学通报,2010,37:923-928)介绍的方法进行。主要步骤如下：(1)以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因aceF序列并克隆入合适载体中，选择合适的酶切位点酶切或通过反向PCR扩增去除该基因的部分序列，同步克隆入difGm片段，获得突变盒片段(即：同源臂1-dif-Gm-dif-同源臂2)。(2)采用PCR扩增技术制备上述定点整合突变盒序列，将该片段纯化后电转化含有辅助质粒pKD46的受体菌株。(3)在辅助质粒pKD46所产生的Red重组酶的作用下，上述DNA片段与染色体上的目的基因进行双交换，替换目的基因序列，重组转化子可利用突变盒上带有的庆大霉素抗性标记筛选出。该突变株再在自身产生的Xer重组酶的作用下进行两个dif位点的重组，环化去除抗生素抗性基因。正确转化子经菌落PCR验证、发酵验证功能等方法验证。
6、摇瓶发酵试验
从保藏于-70℃的甘油管接种菌株至相应抗性LB平板，25～37℃培养箱静置18～24h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中(诸葛健王正祥工业微生物实验技术手册，北京：中国轻工业出版社，1994)，25～37℃摇床，100～250r/min，12～24h，生长至菌体OD600为3.0以上。取大约50～150μL菌悬液接种于50mL的摇瓶发酵培养基(十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，甘油0.1％～1.0％；pH 7.0)中，控制接种量使初始OD600均为0.05～0.2。先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入微好氧产乳酸阶段。微好氧产乳酸阶段，加入终浓度为10～80g/L的甘油和20～60g/L CaCO3，37～50℃、10～100r/min培养12～50h。
7、发酵罐发酵试验
发酵菌种的平板培养、液体LB培养和摇瓶无机盐培养过程同摇瓶操作。取100～500μL菌悬液接种至150mL以甘油为碳源的无机盐培养液中，25～37℃摇床，100～250r/min，12～24h，作为二级种子接种50L发酵罐，初始工作体积为25L。在无机盐培养基中添加2～5wt.％的甘油，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下控制溶氧不低于20％，培养4～16h，过程中通过流加5～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后，通风0.1～1.5vvm并降低转速到100～600r/min维持溶解氧浓度1～10％，提高发酵温度到35～55℃，然后分4批补加3～70wt.％的甘油溶液或以3～30g/(L·h)的流加速度流加10～70wt.％甘油溶液(以起始发酵体积计算，甘油补加总量为200～270g/L发酵液)，这一过程中通过流加5～30wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0～7.5。
8、发酵过程分析
(1)甘油浓度测定：发酵过程中取样测定甘油浓度，需要先离心弃菌体取上清，并适当稀释至甘油测定试剂盒(FG0100-1KT；Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,USA)可检测范围内进行测定，取三次平行数据的平均值。
(2)L-乳酸和D-乳酸及其他发酵产物测定方法
发酵液样品处理方法：按1mL发酵液加50μL浓硫酸的比例，去酸化处理发酵液，以释放被中和的有机酸，然后离心取上清，除去产生的CaSO4沉淀。将处理完的样品与100g/L的三氯乙酸等体积混匀，4℃放置2h，12000r/min离心6min，将上清适当倍数稀释，0.22μm微孔滤膜过滤，然后进行高效液相分析。
L-乳酸、D-乳酸、丙酮酸、甲酸、乙酸和丁二酸含量测定：样品用HPLC紫外检测器检测，检测流动相使用5mM的稀硫酸溶液，流动相流速设置为0.8mL/min，采用HPX-87H有机酸分析柱，波长210nm，柱温65℃，进样量为10μL。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。
乳酸单体光学纯度测定：采用HPLC进行，检测流动相为5mM的CuSO4溶液，流动相流速1mL/min，采用光学纯度手型分析柱Astec CLC-L(D-乳酸先出峰，L-乳酸后出峰)，柱温25℃，紫外检测，波长254nm，进样量为10μL。
本发明及实施例涉及的引物对照表如下：
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1aceF基因表达质粒及重组大肠杆菌的构建
对来源于大肠杆菌的编码二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的aceF基因(GenBank登录号:944794，核酸序列SEQ ID No.1)，以大肠杆菌CGMCC No.11059的染色体基因组作为模板通过PCR扩增aceF基因(上下游引物分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，aceFp1和aceFp2)。将获得的大小约为1.9kb的PCR产物经BamHI和EcoRI消化后克隆入pLDHex质粒(该质粒构建过程公开于文献Niu etal.Highly efficient L-lactate production using engineeredEscherichia coli with dissimilar temperature optima for L-lactate formationand cell growth，Microbial Cell Factories 2014,13:78)的PldhA启动子的下游和TldhA终止子上游的BglII和EcoRI位点，获得重组质粒pT-PldhA-aceF。
以质粒pT-PldhA-aceF作为模板，经PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，ldhA2-p1/ldhARew-p2)获得包括D-乳酸脱氢酶编码基因启动子和终止子以及aceF基因大小约为2.5kb的表达盒PldhA-aceF片段。将获得的表达盒PldhA-aceF片段经BamHI消化后克隆入pKD46质粒的BamHI位点，获得重组表达质粒pKD-PldhA-aceF(物理图谱见图1)。该重组质粒BamHI线性化后，经琼脂糖凝胶电泳确认如图2所示，获得两条片段大小分别为6.3kb和2.5kb的条带。可知重组表达质粒pKD-PldhA-aceF构建成功。
采用电击转化的方法将上述构建的aceF基因表达质粒pKD-PldhA-aceF分别转化入D-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11059和L-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11060中，获得了相应的重组菌GOFD和GOFL。
实施例2aceF基因突变盒构建及重组大肠杆菌染色体上aceF基因的删除
以大肠杆菌CGMCC No.11059的染色体基因组作为模板PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，aceFE-p1和aceFd-p2)aceF基因及其上下游各约500bp的片段。将获得的大小约为2.9kb的PCR产物经HindIII消化后克隆入pMD18-T质粒(该质粒可在宝生物公司采购)的HindIII位点获得重组质粒pMD-aceF(Ed)。
以pMD-aceF(Ed)质粒作为模板，经PCR反向扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，RaceFE-p1和RaceFd-p2)除去aceF基因片段，获得含有aceF基因上下游同源臂的质粒RpMD-aceF(Ed)，将反向PCR获得的片段RpMD-aceF(Ed)与difGm片段(该片段采购自江苏锐阳生物的大肠杆菌基因删除试剂盒)进行连接，获得包含aceF基因突变盒的重组质粒pMD-aceF(Ed)-difGm(图3，质粒pMD-aceF(Ed)-difGm经HindIII线性化后的电泳图谱)。以质粒pMD-aceF(Ed)-difGm为模板，经PCR扩增(引物aceFE-p1和aceFd-p2)，获得aceF基因突变盒aceF(Ed)::difGm(包括aceF基因上下游同源臂和difGm片段：同源臂1-dif-Gm-dif-同源臂2)。
将突变盒aceF(Ed)::difGm分别采用电击转化实施例1构建的重组菌GOFL和GOFD中，在温敏型质粒的辅助下完成染色体基因组上的aceF基因的删除(在辅助质粒pKD46所产生的Red重组酶的作用下，aceF(Ed)::difGm与染色体上的aceF基因进行双交换)，分别获得染色体上aceF基因删除后的重组菌GSFL和GSFD(染色体基因组上aceF基因删除过程示意图见图4)，重组菌GSFL和GSFD的验证图如图5所示。进一步通过42℃条件下的传代培养获得aceF基因表达质粒pKD-PldhA-aceF丢失的重组菌GDFL和GDFD(重组菌GSFL、GDFL和GSFD、GDFD在LB平板上30℃培养24h对比图如图6所示)。
实施例3aceF基因表达质粒及重组大肠杆菌的再次构建
以大肠杆菌CGMCC No.11059的染色体基因组作为模板通过PCR扩增aceF基因(上下游引物分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，aceFp1和aceFp2)。以质粒pBL-WZX(Niu DD&Wang ZX,2007,34:357–362；公开于ZL200510081648.7，pBL-WZX质粒上包含有淀粉酶启动子PamyL和终止子TamyL)为模板反向PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12，RPamyL-1和RTamyL-2)去掉淀粉酶信号肽SamyL，获得将质粒pBL-WZX去除淀粉酶信号肽SamyL序列的线性化质粒骨架片段，经BamHI消化后与同样经BamHI消化后的aceF基因片段连接，获得重组质粒pBL-PamyL-aceF。以质粒pBL-PamyL-aceF为模板PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，PamyL-1和TamyL-2)获得包含淀粉酶启动子PamyL和终止子TamyL以及aceF基因大小为3053bp的表达盒片段PamyL-aceF。将质粒pKD46进行PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16，RKD-1和RKD-2)删除pKD46质粒序列位置3391-6329的编码Exo、Beta、Gam三种蛋白的核酸序列片段，获得pKDM片段2951bp，扩增产物经DpnI酶消化模板并纯化后，与表达盒PamyL-aceF片段连接，获得重组表达质粒pKDM-PamyL-aceF(物理图谱见图7)。该重组质粒BamHI线性化后，经琼脂糖凝胶电泳确认如图8所示，获得一条片段大小约为6.0kb的条带。可知重组表达质粒pKDM-PamyL-aceF构建成功。
采用电击转化的方法将上述构建的aceF基因表达质粒pKDM-PamyL-aceF，分别转化入上述构建菌株GDFD和GDFL中，获得了相应的重组菌GYSFD和GYSFL；
采用电击转化的方法将上述构建的aceF基因表达质粒pKDM-PamyL-aceF，分别转化入D-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11059和L-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11060中，获得了相应的重组菌GYOFD和GYOFL。
实施例4摇瓶培养体系下温度对细胞生长的调控
将出发菌株CGMCC 11059和CGMCC 11060，上述获得的重组菌GSFD、GDFD、GYOFD、GYSFD和GSFL、GDFL、GYOFL、GYSFL，甘油为碳源分别在30℃和42℃温度下培养24h考察菌体生长情况，结果汇总于表1。
出发菌株CGMCC 11059和CGMCC 11060在30℃和42℃条件下均表现出显著生长。游离表达aceF基因后的菌株GYOFD和GYOFL在30℃和42℃条件下均表现出显著生长，这是因为30℃条件下游离质粒正常复制未丢失，染色体上和游离质粒的aceF基因均正常表达了E2p蛋白，而42℃条件下游离质粒虽然丢失，但染色体上的aceF基因正常表达了E2p蛋白。此外，重组菌GYOFD和GYOFL的细胞积累量均高于出发菌株的细胞积累量，说明淀粉酶启动子驱动下aceF的游离表达更利于菌体的生长。在游离表达aceF基因的基础上删除染色体基因组aceF基因的重组菌GYSFD和GYSFL在30℃和42℃条件下则表现出显著的生长差异。其中30℃条件生长显著，而在42℃条件下则表现出明显的细胞增殖抑制，这是因为30℃条件下游离质粒正常复制未丢失，虽然染色体上没有aceF基因，但是游离质粒上的aceF基因正常表达了E2p蛋白，而42℃条件下游离质粒丢失，且染色体上的aceF基因也缺失，最终由于E2p蛋白得不到表达而使得细胞生长受限。重组菌GYOFD和GYOFL的细胞积累量均高于出发菌株以及菌株GYSFD和GYSFL。进一步说明淀粉酶启动子更利于aceF基因的表达。无aceF基因游离表达质粒且染色体基因组aceF基因删除后的重组菌GDFD和GDFL在30℃和42℃条件下均表现出明显的细胞增殖抑制，这是因为两种培养条件下由于染色体上无aceF基因，细胞内也无游离表达aceF基因的质粒，导致E2p蛋白得不到表达而使得细胞生长受限。
表1
实施例5摇瓶发酵体系下发酵产酸阶段甘油酸转化率
将出发菌株CGMCC 11059和CGMCC 11060、上述获得的重组菌GYOFD、GYSFD、GYOFL和GYSFL以及GSFD和GSFL分别从保藏于-70℃的甘油管接种菌株至相应抗性LB平板，30℃培养箱静置20h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中30℃摇床，200r/min，12h。取大约100μL菌悬液接种于50mL的摇瓶发酵培养基(十二水磷酸氢二钠1.5％，氯化钠0.05％，磷酸二氢钾0.3％，氯化铵0.3％，甘油0.5％；pH 7.0)中，使初始OD600为0.05～0.2，30℃、200r/min培养10h，转入微好氧产乳酸阶段。微好氧产乳酸阶段，每升发酵液加入70g的甘油和60g CaCO3，42℃、100r/min培养36h。
发酵结束后，甘油到乳酸转化率汇总于下表2，aceF基因可温敏式丢失后的重组菌GYSFD、GYSFL、GSFD和GSFL甘油到乳酸转化率与出发菌株比较均显著提升，其中，重组菌GYSFD和GYSFL的转化率由原始菌株的约90％提高至96％以上。而游离表达aceF基因的GYOFD、GYOFL菌株，甘油到乳酸转化率较出发菌株略有降低。重组菌GYSFD和GYSFL，与GSFD和GSFL相比，淀粉酶和乳酸脱氢酶两种不同组合的启动子和pKD46质粒骨架游离表达aceF基因存在两个方面的差异性，其一是淀粉酶启动子本身在通风发酵条件下较乳酸脱氢酶启动子转录水平可能更高。而pKD46质粒骨架上辅助同源重组的三种蛋白编码基因的去除，一定程度上减轻了游离质粒在细胞生长过程中的负载。从而可以获得更高活性的细胞，更高效的转化甘油合成乳酸。此外，甘油发酵合成乳酸需要在微量通风的条件下进行，氧气的存在会降低甘油到乳酸的转化率，这一背景下，相较于葡萄糖为原料时的厌氧发酵产酸过程，甘油发酵产乳酸阶段失活E2p蛋白，表现出了更有利于限制甘油用于细胞生长，从而最大限度的实现甘油到乳酸的高转化率。
表2
实施例5变温发酵工艺下高转化率合成乳酸单体
将出发菌株CGMCC 11059和CGMCC 11060、重组菌GYSFD和GYSFL的甘油管冻藏物分别接种菌株至卡那抗性(50μg/mL)LB平板，30℃培养箱静置20h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中，30℃摇床，200r/min，12h。取5mL菌悬液接种至150mL以甘油为碳源的无机盐培养基中(15.113g/LNa2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl，5g/L甘油，调pH为7.0。)，30℃摇床，200r/min，10h，作为二级种子接种50L发酵罐，初始工作体积为25L。在无机盐培养基(15.113g/L Na2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/LNaCl，调pH为7.0。)中添加3wt.％的甘油，33℃、通风2vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％，培养8h，过程中通过流加25wt.％氨水维持发酵液pH 7.0，当菌体OD600达到30后，通风1vvm并降低转速到100～400r/min控制溶解氧浓度为5％，提高发酵温度到42℃，将总量甘油(以发酵起始体积计，甘油的添加总量约为230g/L发酵液)分4批补加入发酵罐，流加25wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 7.0。当残留甘油浓度低于0.5g/L时，结束发酵；
此发酵条件下，发酵周期约36h，重组菌GYSFD和GYSFL的D-乳酸和L-乳酸的生产水平在155～165g/L之间，平均产酸速率达到4.36g/(L·h)～4.55g/(L·h)，发酵产酸阶段甘油到乳酸转化率为96.2％～96.9％，D-乳酸和L-乳酸的光学纯度均高于99.9％，化学纯度均高于98％(表3)。
表3
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以具有乳酸生产能力的菌株为宿主，通过温敏型质粒在宿主内游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因获得的。
2.如权利要求1所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述PDH复合体中的关键酶是二氢硫辛酰胺转乙酰基酶E2p，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；E2p由aceF基因编码，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求2所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述E2p的编码基因aceF通过克隆入温敏型质粒在宿主中进行游离表达，所述温敏型质粒选自pKD3，pKD4，pKD46，pKD20或pKD13。
4.如权利要求3所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述温敏型质粒上，含有来源于地衣芽胞杆菌淀粉酶启动子PamyL和终止子TamyL，PamyL的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，TamyL的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
5.如权利要求1所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌CGMCC NO.11059或CGMCC NO.11060。
6.如权利要求1所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌，是以大肠杆菌CGMCC 11059或CGMCC11060为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PldhA和终止子TldhA克隆至温敏型质粒pKD46中，获得重组质粒pKD-PldhA-aceF，并将重组质粒pKD-PldhA-aceF转化至上述宿主中，同时敲除宿主菌中染色体上的aceF基因，获得高产D-乳酸和L-乳酸的重组大肠杆菌GSFD和GSFL；将重组大肠杆菌GSFD和GSFL经过42℃传代培养丢失重组质粒pKD-PldhA-aceF，获得重组菌GDFD和GDFL；进而以重组大肠杆菌GDFD或GDFL为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PamyL和终止子TamyL克隆至由pKD46质粒去除Exo、Beta、Gam三种蛋白编码序列后获得的简化质粒pKDM的中，获得重组质粒pKDM-PamyL-aceF，并将重组质粒pKDM-PamyL-aceF转化至上述宿主GDFD或GDFL中，获得重组大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的一株利用甘油生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌CGMCC NO.11060为最初的宿主，获得可代谢利用甘油高转化率合成L-乳酸单体的大肠杆菌GYSFL；以大肠杆菌CGMCC NO.11059为最初的宿主，获得可代谢利用甘油高转化率合成D-乳酸单体的大肠杆菌GYSFD。
8.权利要求1-7任意一项所述基因工程菌在利用甘油生产乳酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，通过发酵罐发酵生产乳酸的方法如下：
在无机盐培养基中添加2～5wt.％的甘油，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％培养4～16h，过程中维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后将通风量调整为0.1～1.5vvm并降低转速到100～600r/min以维持溶解氧浓度为1～10％，提高发酵温度到35～55℃进入乳酸合成阶段，期间补加甘油，甘油补加总量为200～270g/L发酵液；乳酸合成阶段维持发酵液pH 6.0～7.5；当甘油浓度低于0.5g/L时，或甘油消耗速率低于1g/(L·h)时，或发酵液固形物含量过高难以搅拌时，结束发酵，整个发酵周期为30～40h。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产乳酸的方法如下：
按初始OD600为0.05～0.2将种子液结接种至摇瓶发酵培养基中，先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入微好氧产乳酸阶段，微好氧产乳酸阶段，按每升发酵液加入10～80g的甘油和20～60g的CaCO3，37～50℃、10～100r/min培养12～50h。
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