CN114854658A - 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法 - Google Patents

一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114854658A
CN114854658A CN202210572578.9A CN202210572578A CN114854658A CN 114854658 A CN114854658 A CN 114854658A CN 202210572578 A CN202210572578 A CN 202210572578A CN 114854658 A CN114854658 A CN 114854658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
arginine
escherichia coli
recombinant
coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210572578.9A
Other languages
English (en)
Inventor
徐美娟
饶志明
吴洁琴
汤佳冰
张显
杨套伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202210572578.9A priority Critical patent/CN114854658A/zh
Publication of CN114854658A publication Critical patent/CN114854658A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01017—Ornithine decarboxylase (4.1.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01019—Arginine decarboxylase (4.1.1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产L‑精氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过将巴氏醋酸杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶ACS在pET28a载体上进行了成功表达，随后将重组质粒转入改造后的大肠杆菌ARG‑4中。将重组大肠杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中摇瓶发酵48h，即可使发酵液中L‑精氨酸的产量高达7.51g/L，同时副产物乙酸含量2.53g/L。将此重组大肠杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中发酵罐发酵48h，即可使发酵液中L‑精氨酸的产量高达15.07g/L，同时，副产乙酸的含量仅为0.41g/L，并且，整个发酵过程能有效利用乙酸生成乙酰辅酶A，原料成本低、副产物少且易于操作的优势。

Description

一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产L-精氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产L-精氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-精氨酸是一种重要的食物添加剂，常用于食品、医药及化工领域中，已经被人所知的是在治疗肝脏疾病及伤口愈合中有重要价值。L-精氨酸风险系数低，在化妆品中使用L-精氨酸非常安全，既能软化皮肤角质层，保持皮肤水分，还能缓解肌肤炎症，改善皮肤粗糙和干燥。由于L-精氨酸呈碱性，对头发没有伤害，因此工业上还可以代替氨水添加至染发剂，改善发质。还能利用L-精氨酸制剂制备精酮合剂、精氨酸琥珀酸盐、精氨酸葡萄糖醛酸盐、精天冬氨酸和磷葡精氨酸等生物试剂。
L-精氨酸生产方法有水解法和发酵法，水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，同时因为存在严重的污染而不适用于大规模的生产。微生物法生产精氨酸相对于化学合成具有低耗能、环保、易分离提取的优势，更具有工业化生产的应用价值，现今，微生物发酵是工业生产精氨酸的主要来源。在大肠杆菌的精氨酸的生物合成途径中，每消耗1摩尔的乙酸辅酶A，将释放1摩尔的乙酸和产生1摩尔的精氨酸。乙酰辅酶A作为细胞内代谢的重要中间产物，是合成多种生物基化学品的重要前体。而同时乙酸的积累一方面会抑制大肠杆菌的生长和代谢，另一方面会导致碳原子损失和目标产物产率降低。因此急需找到一种降低乙酰COA的分解途径，减少乙酸积累，并能提高大肠杆菌产L-精氨酸的方法。
发明内容
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了来源于Acetobacterpasteurianus的乙酰辅酶A合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌ARG-4为宿主，所述大肠杆菌ARG-4是以大肠杆菌BL21为出发菌株，敲除其基因组上的adiA，speA，speC，speF基因得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌ARG-4宿主菌株为一株敲除L-精氨酸支路代谢改造菌株。
在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酰辅酶A合成酶的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述adiA基因在NCBI上的登录号为：948638，所述speA基因在NCBI上的登录号为：947432，所述speC基因在NCBI上的登录号为：947457，所述speF基因在NCBI上的登录号为：945297。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET系列载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌杆菌以大肠杆菌ARG-4为宿主，以pET28a质粒为载体过表达乙酰辅酶A合成酶ACS基因。
本发明还提供了一种生产L-精氨酸的方法，所述方法为先将上述重组大肠杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，获得含有L-精氨酸的发酵液，然后将含有L-精氨酸的发酵液进行分离，获得L-精氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌种子液的添加量至少为：10％～15％。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30～37℃、转速为180～250rpm、pH为7.0～7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为37℃、转速为200rpm、pH为7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖20～40g/L、(NH4)2SO4 30～40g/L、酵母浸粉5～10g/L、KH2PO4 1～1.5g/L、MgS04·7H2O 0.5～11g/L、MnS04·H2O 0.3～0.4g/L、FeS04·7H2O 0.01～0.02g/L以及CaCO3 15～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖40g/L、(NH4)2SO430g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgS04·7H2O 1.0g/L、MnS04·H2O 0.3g/L、FeS04·7H2O 0.02g/L以及CaCO3 15g/L。
本发明还提供了上述大肠杆菌或上述方法在制备L-精氨酸或含有L-精氨酸的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明成功的实现了重组大肠杆菌有效利用乙酸，并能发酵产生L-精氨酸。本发明采用的大肠杆菌ARG-4是以Escherichia coli BL21为出发菌株，在敲除adiA、speA、speC、speF基因后得到的，通过在大肠杆菌ARG-4中异源表达乙酰辅酶A合成酶，降低了胞内乙酸对大肠杆菌的影响。
(2)经过本实验室筛选得到的精氨酸敲除菌株大肠杆菌ARG-4，通过基因工程方法加强大肠杆菌菌株产L-精氨酸途径，就能够构建一株发酵生成L-精氨酸的产酸菌株，既能降低了乙酸对大肠杆菌生长毒害作用，也能有效利用乙酸生成乙酰辅酶A，在L-精氨酸的生产中具有较高的应用价值。
(3)本发明分别构建不四种同来源的乙酰辅酶A合成酶过表达质粒pET28a-acs，测定的四种乙酰辅酶A合成酶的重组质粒在大肠杆菌菌中酶活，结果所示，巴氏醋酸杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶编码基因Apacs1比酶活最高，为784.59±9.62U/mL，在大肠杆菌中的表达效果最好，因此，选择过表达巴氏醋酸杆菌的乙酰辅酶A合成酶编码基因Apacs1作为过表达基因。
(4)本发明提供了一株重组大肠杆菌ARG-4/pET28a-Apacs1，将此重组大肠杆菌ARG-4/pET28a-Apacs1接种至含有葡萄糖的发酵培养基中摇瓶发酵48h，即可使发酵液中L-精氨酸的产量高达7.51g/L，同时副产物乙酸含量2.53g/L；
将此重组大肠杆菌ARG-4/pET28a-Apacs1接种至含有葡萄糖的发酵培养基中发酵罐发酵48h，即可使发酵液中L-精氨酸的产量高达15.07g/L，同时，副产乙酸的含量仅为0.41g/L。可见，使用此重组大肠杆菌ARG-4/pET28a-Apacs1发酵生产L-精氨酸具有原料成本低、副产物少且易于操作的优势。
(5)采用本发明的方法，不仅降低了副产物乙酸对菌株生长的毒害作用，还能有效利用乙酸提高乙酰辅酶A合成，大大降低了生产成本，为L-精氨酸工业化生产奠定了良好的基础。
附图说明
图1：乙酰辅酶A合成酶编码基因acs扩增结果。
图2：重组质粒pET28a-Apacs1的PCR验证结果。
图3：大肠杆菌重组质粒pET28a-Apacs1表达图。
图4：大肠杆菌adiA、speA、speC、speF融合片段扩增结果。
图5：大肠杆菌adiA、speA、speC、speF基因敲除菌落验证结果。
图6：精氨酸标准品HPLC液相图。
图7：发酵液中精氨酸HPLC液相图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地阐述。
下述实施例中涉及的L-精氨酸购自麦克林公司；下述实施例中涉及的pET28a质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，pCas9与sgRNA大肠杆菌编辑质粒均购自英茂盛业生物科技有限公司；下述实施例中涉及的Bacillus subtilis subsp 168、Escherichia coli BL21购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；述实施例中涉及的Acetobacter pasteurianus ATCC 33445购自德国DSMZ菌种保藏中心；本发明采用的大肠杆菌ARG-4是本实验室通过敲除adiA、speA、speC、speF基因得到的大肠杆菌敲除菌株。
下述实施例中涉及的培养基及所需溶液如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L。
种子培养基：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 20g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgS04·7H2O 1.0g/L、MnS04·H2O 0.3g/L、FeS04·7H2O 0.02g/L、CaCO3 1g/L，氨水调节pH为7.0。
发酵培养基：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgS04·7H2O 1.0g/L、MnS04·H2O 0.3g/L、FeS04·7H2O 0.02g/L、CaCO3 15g/L，氨水调节pH为7.0。
发酵罐种子培养基：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 20g/L、酵母浸粉10g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 1.5g/L、MgS047H2O 0.4g/L，氨水调节pH为7.0。
发酵罐发酵培养基：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 35g/L、酵母浸粉10g/L、KH2PO4 2g/L、MgS04·7H2O 0.5g/L、MnS04·H2O 0.02g/L、FeS04·7H2O 0.02g/L，氨水调节pH为7.0。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-精氨酸检测方法：选择C18色谱柱；0.05mol/L的醋酸盐缓冲液(pH6.4)-50％乙腈溶液(75:25)为流动相；检测波长362nm；柱温30℃。
乙酸检测方法：选择有机酸色谱柱；3mmol/L的稀硫酸为流动相；检测波长为210nm；柱温35℃。
实施例1：乙酰辅酶A合成酶的筛选
具体步骤如下：
(1)分别以Escherichia coli、Bacillus subtilis、Acetobacter pasteurianus的基因组DNA为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，分别得到核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示的编码乙酰辅酶A合成酶基因acs1～acs4；其中，PCR扩增引物如表1所示：
表1：PCR引物
Figure BDA0003648336610000041
Figure BDA0003648336610000051
PCR扩增条件为：95℃预变性，3min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR扩增体系为：模板0.5μL，上下游引物各0.5μL，灭菌的双蒸水23.5μL，PrimerStarDNA聚合酶25μL。
(2)将步骤(1)获得的编码乙酰辅酶A合成酶的基因acs 1～acs 4(扩增结果如图1所示)与pET28a质粒经限制性内切酶EcoRI和HindⅢ酶切后进行连接，得到连接产物(pET28a-Apacs1扩增结果如图2所示)；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有10μg·mL-1卡纳霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；菌落PCR验证，挑取验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h，菌落PCR验证，挑取验证正确的转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确，即分别获得转化成功的重组质粒pET28a-acs 1，pET28a-acs 2，pET28a-acs 3，pET28a-acs 4。
实施例2：乙酰辅酶A合成酶表达载体的构建
具体步骤如下：
将实施例1获得的重组质粒pET28a-acs 1～pET28a-acs 4分别化学转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有10μg·mL-1卡纳霉素)，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；菌落PCR验证，挑取验证正确的转化子接种至LB液体培养基(含有10μg·mL-1卡纳霉素)中，于37℃恒温培养箱中、120～180rpm的条件下摇瓶培养12h后提取质粒进行PCR验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-acs 1～E.coli BL21(DE3)/pET28a-acs 4；测定不同来源的四种乙酰辅酶A合成酶的重组质粒pET28a-acs 1～pET28a-acs 4在大肠杆菌菌中酶活，结果如表2所示。
表2不同来源乙酰辅酶A合成酶酶活
Figure BDA0003648336610000052
结果显示，巴氏醋酸杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶编码基因Apacs1比酶活最高，表达效果最好，因此选择巴氏醋酸杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶编码基因Apacs1(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)在大肠杆菌杆菌中过表达(表达结果如图3所示)。
实施例3：宿主细胞的构建
具体步骤如下：
(1)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为DNA模板，利用表3引物分别扩增出adiA，speA，speC，speF基因的同源臂融合片段(adiA，speA，speC，speF基因扩增结果如图4所示)。
表3引物
Figure BDA0003648336610000061
PCR扩增条件为：95℃预变性，3min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR扩增体系为：模板0.5μL，上下游引物各0.5μL，灭菌的双蒸水23.5μL，PrimerStarDNA聚合酶25μL。
(2)将大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，通过电击转化将pCas9质粒导入BL21中，涂布平板，挑取阳性转化子接种于LB液体培养基中30℃培养，将adiA同源臂融合片段与sgRNA质粒导入大肠杆菌中，涂布平板，30℃过夜培养，利用表2中引物，挑取阳性转化子菌落验证，验证结果正确，表明adiA基因敲除成功。用上述同样的方法逐一敲除speA、speC、speF基因，将adiA，speA，speC，speF基因敲除后的菌株命名为大肠杆菌重组菌株E.coli ARG-4(验证结果如图5所示)。
(3)将重组大肠杆菌E.coli ARG-4接种于单菌落接种至种子培养基中，于温度为37℃、转速为180rpm的摇床培养12h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的摇床培养5h后，在培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下继续诱导发酵48h，获得发酵液，测定E.coliARG-4中L-精氨酸的积量为3.98g/L。
实施例4：重组大肠杆菌的构建
具体步骤如下：
将实施例1获得的重组质粒pET28a-Apacs1化学转化至实施例3制备得到的大肠杆菌E.coli ARG-4，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有10μg·mL-1卡纳霉素)，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；菌落PCR验证，挑取验证正确的转化子接种至LB液体培养基(含有10μg·mL-1卡纳霉素))中，于37℃恒温培养箱中，120～180rpm的条件下摇瓶培养12h后提取质粒进行PCR验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌E.coli ARG-4/pET28a-Apacs1。
实施例5：L-精氨酸的生产(摇瓶生物发酵法)
具体步骤如下：
挑取实施例4获得的重组大肠杆菌E.coli ARG-4/pET28a-Apacs1单菌落接种至种子培养基中，于温度为37℃、转速为180rpm的摇床培养12h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的摇床培养5h后，在培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下继续诱导发酵48h，获得发酵液。
检测发酵液中L-精氨酸(如图6～7所示)、乙酸的含量，检测结果为：重组大肠杆菌E.coli ARG-4/pET28a-Apacs1发酵获得的发酵液中L-精氨酸的含量为7.51g/L、乙酸含量2.53g/L。
实施例6：L-精氨酸的生产(发酵罐生物发酵法)
具体步骤如下：
挑取实施例4获得的重组大肠杆菌E.coli ARG-4/pET28a-Apacs的单菌落接种至发酵罐种子培养基中，于温度为37℃、转速为180rpm的摇床培养12h，得到一级种子液；
将一级种子液以10％(v/v)接种量接种至发酵罐种子培养基中，于温度为37℃、转速为180rpm的摇床培养8h，得到二级种子液；
将二级种子液全部接入装有1.5L发酵罐发酵培养基的5L发酵罐中，于温度为37℃、转速为600r/min、通气量为1vvm的条件下发酵8h，添加终浓度为0.5mM的诱导剂，之后再培养至48h获得发酵液；发酵过程中，通过自动添加50％(v/v)的氨水控制pH值维持在7.0，通过流加控制葡萄糖浓度不大于5g/L。
检测发酵液中L-精氨酸、乙酸的含量，检测结果为：大肠杆菌E.coli ARG-4/pET28a-Apacs1发酵获得的发酵液中L-精氨酸的含量为15.07g/L、乙酸含量仅仅为0.41g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产L-精氨酸的方法
<130> BAA220036A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagccaaa ttcacaaaca caccattcct gccaacatcg cagaccgttg cctgataaac 60
cctcagcagt acgaggcgat gtatcaacaa tctattaacg tacctgatac cttctggggc 120
gaacagggaa aaattcttga ctggatcaaa ccttaccaga aggtgaaaaa cacctccttt 180
gcccccggta atgtgtccat taaatggtac gaggacggca cgctgaatct ggcggcaaac 240
tgccttgacc gccatctgca agaaaacggc gatcgtaccg ccatcatctg ggaaggcgac 300
gacgccagcc agagcaaaca tatcagctat aaagagctgc accgcgacgt ctgccgcttc 360
gccaataccc tgctcgagct gggcattaaa aaaggtgatg tggtggcgat ttatatgccg 420
atggtgccgg aagccgcggt tgcgatgctg gcctgcgccc gcattggcgc ggtgcattcg 480
gtgattttcg gcggcttctc gccggaagcc gttgccgggc gcattattga ttccaactca 540
cgactggtga tcacttccga cgaaggtgtg cgtgccgggc gcagtattcc gctgaagaaa 600
aacgttgatg acgcgctgaa aaacccgaac gtcaccagcg tagagcatgt ggtggtactg 660
aagcgtactg gcgggaaaat tgactggcag gaagggcgcg acctgtggtg gcacgacctg 720
gttgagcaag cgagcgatca gcaccaggcg gaagagatga acgccgaaga tccgctgttt 780
attctctaca cctccggttc taccggtaag ccaaaaggtg tgctgcatac taccggcggt 840
tatctggtgt acgcggcgct gacctttaaa tatgtctttg attatcatcc gggtgatatc 900
tactggtgca ccgccgatgt gggctgggtg accggacaca gttacttgct gtacggcccg 960
ctggcctgcg gtgcgaccac gctgatgttt gaaggcgtac cgaactggcc gacgcctgcc 1020
cgtatggcgc aggtggtgga caagcatcag gtcaatattc tctataccgc gcccacggcg 1080
attcgcgcgc tgatggcgga aggggataaa gcgattgaag gcaccgaccg atcgtcgctg 1140
cgcattctcg gttccgtggg cgagccaatc aacccggaag cgtgggagtg gtactggaaa 1200
aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aactggcggt 1260
ttcatgatca cgccgctgcc tggcgctacc gagctgaaag ccggttcggc aacacgtccg 1320
ttcttcggcg tgcaaccggc gctggtcgat aacgaaggta acccgctgga aggcgctacc 1380
gaaggcagcc tggtgatcac cgactcctgg ccgggtcagg cgcgtacgct gtttggcgat 1440
cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500
ggcgcgcgtc gcgatgaaga tggctattac tggataaccg ggcgtgtgga cgatgtgctg 1560
aacgtctccg gtcaccgtct gggaacggcg gagattgagt cggcgctggt ggcgcatccg 1620
aagattgccg aagccgccgt agtaggtatt ccgcacaata ttaaaggtca ggcgatctac 1680
gcctacgtca cgcttaatca cggggaggaa ccgtcaccag aactgtacgc agaagtccgc 1740
aactgggtgc gtaaagagat tggcccgctg gcgacgccag acgtgctgca ctggaccgac 1800
tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860
ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920
ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaa 1959
<210> 2
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaacttga aagcgttacc agcaatagag ggggatcata acttaaaaaa ctatgaagaa 60
acgtaccggc attttgattg ggccgaggca gagaaacatt tctcttggca tgagacaggg 120
aaactgaatg cggcgtatga agcgattgac cgccatgccg aatcgtttcg aaaaaacaaa 180
gtagcgcttt attataaaga cgcaaaaagg gatgaaaaat acacatttaa agaaatgaag 240
gaagaatcaa acagagccgg gaatgtgctg agacggtatg gaaatgtgga aaaaggggac 300
cgcgttttta tttttatgcc gagatcaccc gagctttatt ttattatgct tggcgcaatc 360
aaaattggcg ccatcgccgg gccgctgttc gaagcattta tggagggagc ggtgaaagac 420
cggcttgaaa acagtgaggc aaaggttgtt gtcacaacgc ctgagctgct ggagagaata 480
ccggtagaca aactgcctca cttgcagcat gtcttcgtag tcgggggaga ggctgagagc 540
ggcacgaata tcatcaatta tgatgaagca gcgaaacagg aaagcacaag attggatatc 600
gaatggatgg ataaaaaaga cggctttctg cttcactata catcaggttc cactggtacg 660
ccaaagggcg tgttgcatgt ccatgaagcg atgattcagc aatatcaaac aggaaagtgg 720
gtccttgatt taaaggaaga agacatttat tggtgcacgg ctgatccagg ctgggtgaca 780
ggtacggtat acggcatttt tgcaccgtgg ctgaacggag cgacaaatgt catcgtcggc 840
ggacgtttca gcccggaaag ctggtatgga acgattgaac agcttggcgt caatgtctgg 900
tacagcgcgc cgacagcttt tcggatgctg atgggagcgg gagatgaaat ggctgcgaaa 960
tatgatctaa cttcactccg gcatgtgctc agtgtcggtg agccgctaaa tccggaagtc 1020
atcagatggg gacataaagt ttttaacaaa cgaatccatg atacctggtg gatgaccgaa 1080
acgggcagtc agctcatctg caactatcct tgcatggata ttaaaccggg ttcaatgggt 1140
aagccgattc caggagtgga ggcagcgatc gttgacaatc aaggcaacga gctaccgccg 1200
taccgaatgg gcaatctcgc catcaaaaag ggctggcctt ccatgatgca taccatttgg 1260
aataaccctg aaaagtatga atcgtatttc atgccgggcg gctggtatgt gtctggggat 1320
tctgcttaca tggatgaaga gggatacttt tggttccaag gcagagttga tgacgtcatc 1380
atgacctccg gtgagcgcgt cggcccattt gaagtggaaa gcaagcttgt cgaacatccg 1440
gctattgcag aagcaggcgt tatcggaaag cctgacccgg tgcgtggaga aatcattaaa 1500
gcctttattg cactcaggga aggatttgag ccgtctgata aactgaaaga agagatccgc 1560
ctatttgtaa agcagggtct tgcagcccat gcggctccgc gtgagatcga atttaaagat 1620
aagcttccga aaaccagaag cggaaagatc atgaggcgcg tgctgaaggc atgggagctt 1680
aatctgccgg ctggagatct gtcaacaatg gaggattaa 1719
<210> 3
<211> 1989
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtcggaaa acatcactat cctgcctaca cagtatgcag attacccggc cctgatgcca 60
cctgcggaac tggccgccat gcagcgttat gcacgtcgag acccggatgg tttttggctg 120
caacaggccc ggcgtgtgca ctggcaccgc aagcctaggc gaggctttac gggcagcttt 180
acgggtgatg tgtccgtaag ctggtttgaa gatggcctta tcaacgcatc cgtatgctgt 240
attgataagc atctgacaga caaggctgat cagattgccc ttatcagcca ccgtgaaggc 300
cgggccgagg cagaaaaaat tacatatgcc atgctgcatg aacgggtttg ccgcctgtct 360
aacgcgctgg tgcatttggg ggtggaggaa gggcaccgcg ttgtcatttg cctgcccatg 420
atttcagaag ccgtggtggc catgctggcc tgtgcgcgta ttggcgcggt gcatgtggtg 480
ctgtttggtg gtttttcggc agaaggtatt gcagaacgta ttatagatag cggcgcagtt 540
gcggtaatta ccgccagcga aagcatgcgc ggcaacaaga tcgtgccctt taaagcgatt 600
atggatgaag ccctgtgcaa ggcaggtgca gaaagtggcg tgcgggctgt tctagttgtg 660
cgcacgtctg atgcacctgt tcccatgctg cctggtaggg attacgattt tcatgatttt 720
gtagattcgt ttgaggcaga ttttgtgccc gttgtcatgc gggcagaagc accattattt 780
atgctctaca catctggcag cacaggcaag cccaaagcag ttgtgcatgc cactggtggc 840
tatatggtgt gggcagctta cactatggac atggtgtacc atcatcaacc tggtgatgtg 900
ctgtggtgca cggcagatgt ggcatggata accgggcata catccgttgt gtatggcccg 960
ctggccaatg gcggaaccac catgatttcc gatagcctgc cttcataccc cgctccgggc 1020
agatggttgg atctgataga tgagcataag gtgaccatgc tgtttaccgc ccccacagcc 1080
gtgcgcgcca tgatggccga tggtgatgat gtggtgaacg cccgcaatct ggagtctctg 1140
cgtttgctgg gtgtggcggg ggagcccata agcccggatg cgtggctatg gtatcacgat 1200
gttgtgggta aaaagcgttg ccccgtggtg gatacatggt ggcagacaga aaccgccggc 1260
attgtgctgg ggccagtgcc gggtgtgcaa ccgcttaaac ccggctctgc cagcacgccg 1320
ctgccggggt tggaaatggt catagccgat acgcagggca ggccggtgca ggggcctgca 1380
gaaggtagcc tgtgcattgc gcgttcatgg ccggggcagg cccgcacaat ctggaaagat 1440
catgctcgct tctgccagac atattttggt atggttccgg ggcattattt cacgggtgat 1500
ggcgcacggc gagatgccga tggctattac tggattacgg ggcgcatgga cgatgttatc 1560
aatattgcag ggcaccgttt gggtacagca gaagtggaag atgcgttggc agcagatcat 1620
cgtattgtgg aatctgctgc agtgggcatc ccgcacccgg taaaggggca ggcgctggcg 1680
gtatttgtta tccagcgcca gaacgtggct acggaactga cagaaaaagg cataagccgc 1740
cttatctccg gtatgttggg gcgttatgcc acgccagagg ccgtttatct ggtgccagat 1800
ctgcctcgca cgcgctctgg caagattgta cgccgcctgc tgcgcaaaat tgccagtggg 1860
gaaatggata atctgggaga tctttcatcg ctgaatgatc cttccatcgt gcgtatgctg 1920
tgtgacagag tatggagcca catggctttt gatgaggaat ctgcacctcg cacacaggca 1980
agggcctga 1989
<210> 4
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtggtagatg cgtttttccc cgcaacggat aaccccgttt ctgatcggta tcaggatctt 60
gtgcagcggg cgcaacgtga tccggaggaa ttctggctgg ctcaggcgca aaggctggca 120
tggcatacgc aacccatgca cgcatcccgc tctgacttta ccggcgatgt gcggatttcc 180
tggtatgaag acgggcggct gaatgcggct gaaaactgtc tggaccggca cgttctgtat 240
cagcccgata atgctgccct gatctggcag gggcaggaag acggccaccg cgaggtactt 300
tcataccgtg aactgcatgc ccgtgtgtgc cgcttgggca atgtgctgcg ccgtctgggt 360
gtgaaaaagg gagaccgcgt ggccatccat ctgcccatgg tggcagaggg tgtgatttcc 420
atgttggcct gcgcccgtat tggggccgtg cacgtggtgc tatttggtgg tttttctgcc 480
gagggtctgg ccgaacggct gacagacagt ggcgctgtgg tggtgattac cgcagatgta 540
gcacgccgtg gccccaagaa aatccccagc aagaccacaa tggatgaggc cataaaattg 600
tgcggggcac aaagtgcggt gcgcaatgtg ctggtggtgc ctgtaacagg tgctgatgtg 660
cccatgcaaa aggggcggga cctgtcctac acagcagaag tggcgcttga aataccggat 720
tgcccgccag aagtgatgaa cgcgtgtgat ccgctgtttc tgctttacac atccggcagc 780
acgggccgcc cgaaggggct ggtgcacagc acgggcgggt atctggtgtg ggcctctttc 840
acgcaggagc tggtgtttga tgccaaaccc agtgatgtgt tctggtgtac agcagataca 900
agctggatta ccggccacac ctatgttgtg tacgggccat tggtaaatgg tggcaccatt 960
cttgtgtatg aaggcctgcc atcgtggcca cagcccggcc gctggtggga tgtgatagac 1020
cagaatcagg tttcggtttt ctatacctct cccacggtta ttcgcgctgc catgcgtgag 1080
gatgattccg tggtgcaaag ccgctctctg tccagcctgc gcgtgctggg cacagtgggt 1140
gagcctatca gcccggaagc atggaagtgg ttttatgcag aagtagggcg caatgcctgc 1200
ccggtggtag atacatggtg gcagacagaa accggcggtg tgatgattac cgcctgcgcc 1260
cagaatgttg ctgctaagcc gggggccgct gggctgcctt tgcctggtgt ggccgctacg 1320
ctgacagata ccaaagggca ggatattgaa ggcgagggcg aaggcctgtt gtgccttgcg 1380
caatcctggc ccggacaggc catgacgctg tggcaggacc acgaacggtt tcgcaaaacc 1440
tatttcacca catgcccggg ccattatttc tcgggtgatg gcgcacgacg ggatgccacc 1500
ggttattact ggattaccgg ccgcgtggat gatgtggtga acgtatctgg ccaccgcatt 1560
ggcacggcag aaattgaaga tgccgtggcc gaagatcatg ccgtggtgga aagtgccgcc 1620
gttggcgtgc cgcatgatct gaaagggcag gcccttgtgg tgtttgtggt gcccaaggcg 1680
gagggcgcgt ttgatgccac agccgtaaac aaggccgtgg ccgcaggcgt gggccgctat 1740
gcggtgccag aaaaaattta cgtggtgccg gatctgccca aaacacgttc gggcaaaatt 1800
gtgcggcgtt tgctgcgcaa aattgcggcg aatgatctgg aaaatatggg ggatctgtcc 1860
actctagcag acccggatat tgtggctgaa ctgataaagc tggtggctca gcagaacggc 1920
tga 1923

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以敲除大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的adiA，speA，speC，speF基因后得到的菌株细胞为表达宿主，表达了来源于Acetobacter pasteurianus的乙酰辅酶A合成酶。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述乙酰辅酶A合成酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述adiA基因在NCBI上的登录号为：948638，所述speA基因在NCBI上的登录号为：947432，所述speC基因在NCBI上的登录号为：947457，所述speF基因在NCBI上的登录号为：945297。
4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pET系列载体为表达载体。
5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pET28a载体为表达载体。
6.一种生产L-精氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-5任一所述的重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将含有L-精氨酸的发酵液进行分离，获得L-精氨酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌种子液的添加量为：10％～15％。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为30～37℃、转速为180～250rpm、pH为7.0～7.5。
9.如权利要求8的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖20～40g/L、(NH4)2SO4 30～40g/L、酵母浸粉5～10g/L、KH2PO4 1～1.5g/L、MgS04·7H2O 0.5～11g/L、MnS04·H2O 0.3～0.4g/L、FeS04·7H2O 0.01～0.02g/L、CaCO3 15～20g/L。
10.权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌在制备L-精氨酸或含有L-精氨酸的产品中的应用。
CN202210572578.9A 2022-05-17 2022-05-17 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法 Pending CN114854658A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210572578.9A CN114854658A (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210572578.9A CN114854658A (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114854658A true CN114854658A (zh) 2022-08-05

Family

ID=82639075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210572578.9A Pending CN114854658A (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114854658A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110964683A (zh) * 2019-12-02 2020-04-07 天津科技大学 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110964683A (zh) * 2019-12-02 2020-04-07 天津科技大学 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴洁琴: "钝齿棒杆菌异源表达乙酰辅酶A合成酶对L-精氨酸合成的影响", 食品与发酵工, vol. 48, no. 21, pages 9 - 16 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111019878B (zh) L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN112195110B (zh) 一株重组米曲霉菌株及其曲酸发酵方法与应用
CN111471638A (zh) 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN105051181B (zh) 2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法
CN111394380A (zh) 一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法
CN113073074B (zh) 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用
CN112080452B (zh) 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用
CN112980758A (zh) 一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法
CN112375723A (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN114426983B (zh) 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法
CN110862952B (zh) 5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用
CN113832087B (zh) 一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法
CN114854658A (zh) 一种增强乙酸利用提高大肠杆菌发酵产l-精氨酸的方法
CN107674855A (zh) 一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN113493785A (zh) 一种适用于谷氨酸棒杆菌的高强度启动子及应用
CN106884001B (zh) 一种重组嗜碱芽孢杆菌及其制备方法和应用以及制备d-乳酸的方法
CN115125179B (zh) 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用
CN114015634B (zh) 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN115125180B (zh) 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN116064266B (zh) 盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用
CN112143690B (zh) 一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用
CN116640752A (zh) 乌头酸水合酶突变体及其应用
US20210292716A1 (en) D-xylose dehydrogenase from coryneform bacteria and process for preparing d-xylonate

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination