CN105051181B - 2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2，3‑丁二醇生成能力增强的重组微生物，在具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径的微生物中，上述2，3‑丁二醇生成能力增强的重组微生物的丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径或丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。

Description

2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁 二醇的制备方法
技术领域
本发明涉及2，3-丁二醇的生成能力增强的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法。
背景技术
作为具有四个碳和两个羟基(-OH)的乙醇(alcohol)的一种(CH3CHOHCHOHCH3)的2，3-丁二醇可以通过作为合成橡胶制备工序的原料物质的1，3-丁二烯(1，3-butadiene)和用作燃料添加剂及溶剂的甲基乙基甲酮(MEK，Methyl ethyl ketone)进行化学性的催化转化(Ji et al.，Biotechnol.Adv.，29：351，2011)。并且，由于2，3-丁二醇可以与汽油(Gasoline)相混合，来适用为辛烷助推器(octane booster)，因而是工业上非常重要的中间体(Celinska et al.，Biotechnol.Adv.，27：715，2009)。
2，3-丁二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序来生产。但是，由于通过上述工序生产的2，3-丁二醇的生产价格非常高，因而无法生产工业性规模的2，3-丁二醇。另一方面，最近，随着与微生物发酵工序的2，3-丁二醇生产技术的飞跃发展，强化对化石原料物质的急剧的上涨和国际环境污染的规定，对通过微生物发酵来生产生物基2，3-丁二醇的关心和研发的重要性增大。
生物基2，3-丁二醇的制备方法为通过发酵具有2，3-丁二醇生产能力的微生物，将可再生的生物原料物质(Biomass)转化为2，3-丁二醇。2，3-丁二醇通过克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、杆菌(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)种类(Species)等各种微生物来生产(Maddox IS，Biotechnol.，6：269，1996)。尤其，克雷白氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)、产酸克雷白氏菌(K.oxytoca)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)生产相对多的2，3-丁二醇，尤其，克雷白氏肺炎杆菌和产酸克雷白氏菌容易培养，且生长速度快，并具有从各种生物原料物质中能够生产2，3-丁二醇的优点，上述生物原料物质包含来源于木质类的戊糖(Ji et al.，Biotechnol.Adv.，29：351，2011；Chandel etal.，Sustainable Biotechnol.，63，2010；Jansen et al.，Biotechnol.Bioeng.，26：362，1984；Jansen et al.，Adv.Biochem.Eng.，27：85，1983)。
基于微生物发酵工序的生物基2，3-丁二醇的生产研究分为发酵工序最优化(温度、pH、溶解氧等)和微生物开发(微生物发掘、掌握生理特征、突变、基因操作等)等领域。在发酵工序最优化方面，规定有可有效地生产2，3-丁二醇的温度、pH、溶解氧浓度等各种条件(Ji et al.，Bioresour.Technol.，100：3410，2009；Nakashimada et al.，J.Biosci.Bioeng.，90：661，2000；Nakashimada et al.，Biotechnol.Lett.，20：1133，1998)。但在上述条件下，基于微生物发酵工序的2，3-丁二醇的生产仍然存在生产率(Productivity)及收率(Yield)低，且难以直接适用于工业工序的问题。并且，在发酵过程中，存在与2，3-丁二醇一同生成包含乳酸的有机酸(Organic acids)和包含乙醇的乙醇等各种副产品(By-products)的缺点。副产品的生成不仅降低对生物原料物质的2，3-丁二醇的收率，而且在从培养液回收2，3-丁二醇的过程中需要巨大的分离及纯化费用。
因此，主要以减少副产品的方向进行与2，3-丁二醇的生产相关的微生物的研发。代表性地，Ji等是在野生型产酸克雷白氏菌株照射作为物理/化学突变方法之一的紫外线(UV)，来成功抑制一部分生成作为副产品的有机酸的(Ji et al.，Biotechnol.Lett.，30：731，2008)。除此之外，还有将离子束(Ion beam)方式适用于克雷白氏肺炎杆菌株，来增加生物能源的消耗速度，从而提高2，3-丁二醇生产的试图(Ma et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，82：49，2009)。但是，在2，3-丁二醇生产率、最终浓度(Concentration)及收率方面，将所开发的上述菌株适用于工业工序依然存在缺点。
为此，本发明人在研究2，3-丁二醇的生产率、浓度及收率高，且因2，3-丁二醇的选择性高而生成少量的副产品的重组微生物中，发现特定基因缺失的重组微生物的2，3-丁二醇的选择性及生产率高，且生成少量的副产品。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法。
技术方案
用于实现上述目的的本发明提供2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径，在上述2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物中，丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径或丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。
并且，本发明提供2，3-丁二醇的制备方法，上述2，3-丁二醇的制备方法包括：培养本发明的重组微生物的步骤；以及从上述培养液中回收2，3-丁二醇的步骤。
有益效果
本发明的重组微生物能够以高的选择性及浓度生产2，3-丁二醇。
附图说明
图1为表示在克雷伯氏菌属菌株中合成2，3-丁二醇的途径的示意图。
图2为为了确认去除作为与乳酸的生成相关的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)的基因的ldhA而在进行聚合酶链式反应(PCR)增幅后进行电泳来拍摄的琼脂糖凝胶(Agarose gel)照片。
图3为为了确认去除作为与甲酸的生成有关的丙酮酸甲酸分解酶(pyruvate-formate lyase)的基因的pflB而在进行聚合酶链式反应增幅后进行电泳来拍摄的琼脂糖凝胶照片。
图4为比较例1的奥克西托克雷白杆菌菌株的发酵结果。
图5为比较例2的重组奥克西托克雷白杆菌菌株的发酵结果。
图6为实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌菌株的发酵结果。
图7至图11为基于搅拌速度(150rpm(图7)、250rpm(图8)、350rpm(图9)及450rpm(图10))的实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌菌株的分批式发酵结果(图11：基于搅拌速度的每小时的2，3-丁二醇的浓度)。
图12为维持450rpm的搅拌速度，并在好氧条件下的实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌菌株的分批式发酵结果。
图13为调节搅拌速度来执行实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌菌株的分批式发酵结果。
具体实施方式
本发明涉及2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径，在上述2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物中，丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径或丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。
并且，本发明涉及2，3-丁二醇的制备方法，上述2，3-丁二醇的制备方法包括：培养本发明的重组微生物的步骤；以及从上述培养液中回收2，3-丁二醇的步骤。
以下，对本发明进行详细说明。
2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物
本发明的重组微生物为2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径，在2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物中，丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径或丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。
并且，本发明的重组微生物不缺失用于对醇脱氢酶(醛/抗利尿激素)进行编码的基因，即，adhE。
优选地，如图1所示，本发明的重组微生物具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径，并抑制丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径及丙酮酸盐转化为乳酸的途径的重组微生物。
并且，本发明的重组微生物的2，3-丁二醇的选择性、收率、浓度及生产率高。即，以分批培养或补料分批培养为基准，本发明的重组微生物的2，3-丁二醇的选择性为70％以上，优选为80％以上，2，3-丁二醇的收率为0.35g/g以上。并且，由于上述重组，与野生型微生物相比，本发明的重组微生物的甲酸、乙酸或乙醇的生成能力得到抑制。
乙酰辅酶A的生物合成途径
本发明的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)生物合成途径意味着从微生物内的特定代谢产物中合成乙酰辅酶A的途径。本发明的乙酰辅酶A生物合成途径可以为从丙酮酸盐(pyruvate)中合成乙酰辅酶A的途径等。
乳酸生物合成途径
本发明的乳酸(lactate)生物合成途径意味着从微生物内的特定代谢产物中合成乳酸的途径。本发明的乳酸生物合成途径可以为从丙酮酸盐中合成乳酸的途径等。
具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径的微生物
本发明的具有乙酰辅酶A生物合成途径及乳酸生物合成途径的微生物只要是具有如上所述的上述生物合成途径的微生物，就没有特别限制。并且，本发明的微生物可为通过以野生型的方式具有乙酰辅酶A生物合成途径及乳酸生物合成途径的微生物或基因重组来具有的重组微生物。例如，本发明的微生物可为克雷伯氏菌属、杆菌属、沙雷氏菌属或肠杆菌属的微生物，优选地，本发明的微生物为奥克西托克雷白杆菌、克雷伯氏菌属等，更优选地，本发明的微生物为奥克西托克雷白杆菌。
抑制丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径
丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)调节丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A。可通过抑制上述丙酮酸甲酸裂解酶，来抑制丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径。可通过抑制丙酮酸甲酸裂解酶的表达、丙酮酸甲酸裂解酶的酶活性等来实现上述丙酮酸甲酸裂解酶的抑制。例如，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择可使作为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因pflB缺失或在上述基因中引起突变(通过使一部分碱发生变异、取代或删除，或者导入一部分碱，来抑制正常的基因的表达等突变)，或者调节转录过程或翻译过程中的基因表达等适当的方法，来抑制丙酮酸甲酸裂解酶。
抑制丙酮酸盐转化为甲酸的途径
丙酮酸甲酸裂解酶调节丙酮酸盐转化为甲酸。通过抑制上述丙酮酸甲酸裂解酶，可以抑制丙酮酸盐转化为甲酸的途径。可通过抑制丙酮酸甲酸裂解酶的表达、抑制丙酮酸甲酸裂解酶的酶活性等来实现上述丙酮酸甲酸裂解酶的抑制。例如，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择可使作为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因pflB缺失或在上述基因中引起突变(通过使一部分碱发生变异、取代或删除，或者导入一部分碱，来抑制正常的基因的表达等突变)，或者调节转录过程或翻译过程中的基因表达等适当的方法，来抑制丙酮酸甲酸裂解酶。
抑制丙酮酸盐转化为乳酸的途径
乳酸脱氢酶调节丙酮酸盐转化为乳酸。可通过抑制上述乳酸脱氢酶，来抑制丙酮酸盐转化为乳酸的途径。可通过抑制乳酸脱氢酶的表达、乳酸脱氢酶的酶活性等来实现上述乳酸脱氢酶的抑制。例如，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择可使作为对乳酸脱氢酶进行编码的基因的ldhA缺失或在上述基因中引起突变(通过使一部分碱发生变异、取代或删除，或者导入一部分碱，来抑制正常的基因的表达等突变)，或者调节转录过程或翻译过程中的基因表达等适当的方法，来抑制乳酸脱氢酶。
醇脱氢酶
醇脱氢酶(醛/抗利尿激素)调节将乙酰辅酶A转化为乙醇的途径。因此，使作为对醇脱氢酶进行编码的基因的adhE缺失，来妨碍乙醇的生产，从而还存在谋求增加2，3-丁二醇的生产的情况(Ji et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，85：1751，2010)。但在本发明的重组微生物的情况下，若还生成adhE，则存在2，3-丁二醇的生产量、选择性及生产率明显降低的问题。因而，在本发明中，并不使对醇脱氢酶进行编码的基因adhE缺失。
2，3-丁二醇的制备方法
本发明的2，3-丁二醇的制备方法包括：培养本发明的重组微生物的步骤；以及从上述培养液中回收2，3-丁二醇的步骤。
在好氧条件下执行上述培养，优选地，在微氧条件下(microaerobic condition)执行上述培养。例如，当进行培养时，上述培养以供氧，即，提供空气的方式执行，作为具体例，可通过搅拌来进行上述培养。优选地，上述培养通过以450rpm以下的速度搅拌来执行，更优选地，以50～450rpm的速度进行搅拌来执行上述培养，最优选地，以150～450rpm的速度执行上述培养。
优选地，上述培养可通过调节氧的供给量来调节2，3-丁二醇的生产率。本发明作为培养时调节供氧量的方法，例如，一边进行搅拌，一边进行本发明的培养，而在培养过程中，可通过调节搅拌速度来调节2，3-丁二醇的生产率。例如，当乙偶姻(acetoin)的浓度增加5g/L以上，优选地，乙偶姻的浓度增加10g/L以上时，减少搅拌速度，这有利于增加2，3-丁二醇的浓度及生产率，并抑制副产品的生成。
以下，参照附图详细说明的实施例会让本发明的优点和特征以及实现这些优点和特征的方法更加明确。但是，本发明并不局限于以下所公开的实施例，能够以各种方式实施，本实施例只用于使本发明的公开内容更加完整，有助于本发明所属技术领域的普通技术人员完整地理解本发明的范畴，本发明根据发明要求保护范围而定义。
具体实施例
材料及方法
-2，3-丁二醇浓度(g/L)：每单位体积生产的2，3-丁二醇的量
-2，3-丁二醇收率(g/g)：2，3-丁二醇生产量(g)/碳源(g)×100
-2，3-丁二醇生产率(g/L/h)：每单位时间、单位体积生产的2，3-丁二醇的量
-2，3-丁二醇选择性(％)：2，3-丁二醇生产量(g)/(2，3-丁二醇、乙醇、乙偶姻、丁二酸、乳酸甲酸及乙酸的生产量)(g)×100
<实验例1>：重组微生物的制备
为了使包含靶基因的同源部分的脱氧核糖核酸(DNA)片段的制备奥克西托克雷白杆菌的靶基因非活性化，利用了细菌的重组机制，并通过聚合酶链式反应来增幅所要去除的基因的同源部分(homologous region)。之后，向细菌传递包含同源部分的脱氧核糖核酸片段后，在存在于脱氧核糖核酸片段的基因的同源部分和奥克西托克雷白杆菌的染色体的基因之间，通过重组酶的重组机制来去除靶基因。
首先，为了克隆奥克西托克雷白杆菌的乳酸脱氢酶，利用SEQ ID NO.3及SEQ IDNO.4的引物，通过聚合酶链式反应来对作为靶基因的ldhA(SEQ ID NO.1)的同源部分1(SEQID NO.2)进行增幅。并且，利用SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7的引物，通过聚合酶链式反应来对同源部分2(SEQ ID NO.5)进行增幅。之后，同时将同源部分1和同源部分2作为模板，通过聚合酶链式反应来进行增幅，从而完成了同源部分1和同源部分2所包含的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.8)。
另一方面，为了克隆奥克西托克雷白杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶的同源部分，利用SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12的引物，通过聚合酶链式反应来对靶基因的pflB(SEQ IDNO.9)的同源部分1(SEQ ID NO.10)进行增幅。并且，利用SEQ ID NO.14及SEQ ID NO.15的引物，通过聚合酶链式反应来对同源部分2(SEQ ID NO.13)进行增幅。之后，同时将同源部分1和同源部分2为模板，通过聚合酶链式反应来进行增幅，从而使同源部分1和同源部分2完成脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.16)(表1)。为了提高靶基因的重组率，所完成的上述脱氧核糖核酸片段可包含耐抗生素基因等，而为了去除在染色体内重组的耐抗生素基因，可包含涂敷果聚糖蔗糖酶的sacB基因。
表1
重组微生物的制备
所制备的上述脱氧核糖核酸片段利用电穿孔(electroporation，25uF，200Ω，18kV/cm)来向奥克西托克雷白杆菌传递，并利用微生物的重组机制来可去除了靶基因。
向野生型奥克西托克雷白杆菌传递包含ldhA基因的同源部分的脱氧核糖核酸片段，来制备已去除ldhA基因的重组奥克西托克雷白杆菌(比较例2)。另一方面，在野生型奥克西托克雷白杆菌中去除ldhA基因后，通过传递包含pflB基因的同源部分的脱氧核糖核酸片段，来制备在ldhA基因中还去除pflB基因的奥克西托克雷白杆菌(实施例1)。
执行电穿孔后，在30℃温度下，将上述重组微生物培养1个小时并实现稳定化，之后，在37℃温度下，分别撒布(spreading)于具有抗生素(卡那霉素或氯霉素等)的贝尔塔尼(LB)复合固体培养基中进行培养。
之后，利用生长于固体培养基的菌落(colony)来执行菌落聚合酶链式反应，并确认在上述菌落中是否去除上述基因(分别为图2及图3)。此时，为了确认去除ldhA基因，利用SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18的引物，通过聚合酶链式反应来执行，并为了确认去除pflB基因，利用SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20的引物，通过聚合酶链式反应来执行(表2)。
表2
之后，在试验中，将野生型奥克西托克雷白杆菌使用为比较例1。另一方面，在去除ldhA的比较例2的重组奥克西托克雷白杆菌中，还缺失作为对直接参与乙醇生成的醇脱氢酶(醛/抗利尿激素)进行编码的基因的adhE，制备缺失ldhA及adhE的重组奥克西托克雷白杆菌，并将其作为比较例3来执行试验。以与去除上述ldhA或pflB基因相同的方法去除adhE基因。向去除ldhA的奥克西托克雷白杆菌传递包含adhE基因的同源部分的脱氧核糖核酸片段，来制备在ldhA基因中还去除adhE基因的奥克西托克雷白杆菌。
<实验例2>
利用在实验例1中准备的实施例1、比较例1及比较例2的微生物来执行分批培养。首先，将上述克雷伯氏菌属菌株接种于包含9g/L葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，并在37℃温度下培养16小时后，使上述培养液接种于3L的复合培养基来进行培养。此时，发酵条件为微氧条件(micro-aerobic condition；有氧速度为1vvm、搅拌速度为150rpm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃。在发酵过程中，为了调整pH，使用5N的NH4OH。对于上述克雷伯氏菌属菌株，采取发酵过程中的样品，测定采取的试样的OD600(光密度(optical density))，来测定生长速度，采取的试样在13000rpm的速度中离心分离10分钟后，通过高效液相色谱法(HPLC)来分析上层液的代谢产物及2，3-丁二醇浓度。
结果，在比较例2的情况下，2，3-丁二醇生产量为29.91g/L，2，3-丁二醇生产率为(2，3-丁二醇g/葡萄糖g)0.32。并且，比较例2的菌株的2，3-丁二醇的生产率为(g/L/h)1.07，2，3-丁二醇的选择性为59％。当与野生型奥克西托克雷白杆菌的比较例1相比时，可确认比较例2的重组菌株的乳酸生产率减少，2，3-丁二醇的生产能力增加，2，3-丁二醇的生产浓度、生产率、生产性及选择性均得到改善。但是，比较例2的重组奥克西托克雷白杆菌依然生产过量的作为副产品的甲酸及乙醇，而这被认定为抑制比较例2的2，3-丁二醇生产浓度、生产率、选择性等的要因(图4：比较例1、图5：比较例2)。
相反，与比较例2(奥克西托克雷白杆菌ΔldhA，2，3-BDO 29.91g/L)比较，实施例1的重组菌株的2，3-丁二醇生产量增加为39.17±1.51g/L。并且，确认实施例1的重组菌株的甲酸为90％以上，乙醇生成量减少73％以上，而2，3-丁二醇生产率(2，3-丁二醇g/葡萄糖g)从0.32大幅增加至0.45。若考虑2，3-丁二醇的理论收率(在假设向奥克西托克雷白杆菌供给的全部葡萄糖转化为2，3-丁二醇情况下的收率)为0.5，则实施例1的收率(理论收率的90％)相当高。
因而，通过去除ldhA及pflB基因，同时去除甲酸、乙醇之类的副产品，从而可确认大幅减少副产品的生成，并生产高纯度的2，3-丁二醇。由此，去除对克雷伯氏菌属的乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldhA)及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pflB)在2，3-丁二醇生产途径的多个步骤中，对2，3-丁二醇的生产非常重要(图6)(表3)。
表3
<实验例3>
在生产2，3-丁二醇微生物中去除与2，3-丁二醇生物合成竞争来参与副产品的生产的基因的情况下，试验了2，3-丁二醇的生产能力是否得到改善。在2，3-丁二醇生产中，adhE为对直接参与作为副产品的乙醇的生产的醇脱氢酶(醛/抗利尿激素)进行编码的基因。因此，培养去除ldhA及adhE的比较例3的重组奥克西托克雷白杆菌，来与实施例1进行比较。此时，比较例3的重组微生物的培养条件与上述实验例2相同的培养条件相同。
结果，在奥克西托克雷白杆菌中同时去除ldhA和adhE的比较例3的情况下，当与比较例2(奥克西托克雷白杆菌ΔldhA，2，3-BDO 29.91g/L)相比较时，2，3-丁二醇的生产量反而减少为25.96g/L。并且，比较例3的2，3-丁二醇生产率从比较例2的0.32减少至0.27，选择性从比较例2的59％减少至55％，生产率(g/L/h)从比较例2的1.07明显减少至0.36。并且，当与比较例2相比较时，比较例3的乙醇的生产量减少，但2，3-丁二醇的生产能力反而恶化。
并且，与实施例1相比较，也可确认比较例3的2，3-丁二醇的生产能力明显低(表4)。因此，可确认即使去除参与生产副产品的基因，也并非始终对2，3-丁二醇生产有利。
表4
<实验例4>：基于供氧量变化的2，3-丁二醇的生产变化
利用实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌，评价了培养时基于搅拌速度的培养基的溶解氧含量的变化对2，3-丁二醇的生产率、生产性及选择性的影响。
首先，将实施例1的重组微生物接种于包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基中，在37℃温度先培养16小时后，将上述培养液接种于3L的复合培养基来执行分批式发酵。发酵条件为微氧条件(micro-aerobic condition；有氧速度为1vvm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃，搅拌速度分别为150、250、350、450rpm。为了调整发酵过程中的pH，使用5N的NH4OH。对于上述克雷伯氏菌属菌株，采取发酵过程中的样品，测定采取的试样的OD600(光密度)，来测定生长速度，采取的试样在13000rpm的速度中离心分离10分钟后，通过高效液相色谱法来分析上层液的代谢产物及2，3-丁二醇浓度。
结果，呈现出在实施例1的重组奥克西托克雷白杆菌中，根据搅拌速度的变化，2，3-丁二醇的生产率(g/L/h)有很大不同。即，可确认以450rpm的速度进行搅拌时的2，3-丁二醇的生产率比以150rpm的速度进行搅拌时的2，3-丁二醇的生产率增加5倍以上(表5，图7至图11)。由此，可确认可通过改变根据搅拌速度的供氧量来改善实施例1的生产率。
表5
<实验例5>：在好氧条件(以450rpm的速度搅拌)下，通过分批式发酵来生产2，3-丁二醇
基于实验例4的结果，使搅拌速度维持生产率得到最佳改善的450rpm的速度，并利用实施例1的菌株来执行用于生产2，3-丁二醇的分批式发酵。
将实施例1的克雷伯氏菌属菌株接种于包含9g/L葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，并在37℃温度下培养16小时后，将上述培养液接种于3L的复合培养基来进行补料分批培养。此时，发酵条件为微氧条件(micro-aerobic condition；有氧速度为1vvm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃。搅拌速度继续维持450rpm。在发酵过程中，为了调整pH，使用5N的NH4OH。若在发酵过程中，葡萄糖浓度下降至10g/L以下，则添加(feeding)700g/L以上的葡萄糖溶液。对于上述克雷伯氏菌属菌株，采取发酵过程中的样品，测定采取的试样的OD600(光密度)，来测定生长速度，采取的试样在13000rpm的速度中离心分离10分钟后，通过高效液相色谱法来分析上层液的代谢产物及2，3-丁二醇浓度。
结果，确认当搅拌速度维持450rpm时，无法持续维持2，3-丁二醇的生产能力(表6)。尤其，可确认当乙偶姻浓度大于10g/L时，2，3-丁二醇的生产能力明显下降(图12)。可知需要基于维持450rpm的搅拌速度的补料分批培养结果，来进行通过调节搅拌速度的补料分批培养，并可知基于所积累的乙偶姻浓度，来决定调节搅拌速度的时点。
表6
<实验例6>：通过分批式发酵的2，3-丁二醇的生产
将实施例1的克雷伯氏菌属菌株接种于包含9g/L葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，并在37℃温度下培养16小时后，将上述培养液接种于3L的复合培养基来进行补料分批培养。此时，发酵条件为微氧条件(micro-aerobiccondition；有氧速度为1vvm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃、搅拌速度为450rpm。在发酵过程中，为了调整pH，使用5N的NH4OH。发酵过程中，若葡萄糖浓度下降至10g/L以下，则添加(feeding)700g/L以上的葡萄糖溶液。并且，在作为副产品的一种的乙偶姻的浓度为7g/L的时点中，将搅拌速度从450rpm转化为350rpm来进行发酵。对于上述重组克雷伯氏菌属菌株，采取发酵过程中的样品，测定采取的试样的OD600(光密度)，来测定生长速度，采取的试样在13000rpm的速度中离心分离10分钟后，通过高效液相色谱法来分析上层液的代谢产物及2，3-丁二醇浓度。
结果，与实验例5中以维持450rpm的恒定搅拌速度来进行补料分批培养情况相比，2，3-丁二醇的浓度为74.5％、生产率为29.7％、收率为55.2％、选择性为27.0％，而大幅增加。因此，可确认调节搅拌速度的溶解氧含量对利用实施例1的重组菌株来生产2，3-丁二醇产生大影响。因而，可通过调节搅拌速度来调节培养基内的溶解氧含量，从而改善2，3-丁二醇的生产率(表7，图13)。
表7
工业实用性
本发明涉及2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，在具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径的微生物中，上述2，3-丁二醇生成能力增强的重组微生物的丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径或丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。本发明的重组微生物可生产选择性及浓度高的2，3-丁二醇。

Claims (16)

1.一种2，3-丁二醇生成能力增加的重组克雷伯氏菌属微生物，具有乙酰辅酶A及乳酸生物合成途径，其特征在于，丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径、丙酮酸盐转化为甲酸的途径以及丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。
2.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，随着丙酮酸甲酸裂解酶得到抑制，丙酮酸盐转化为乙酰辅酶A的途径以及丙酮酸盐转化为甲酸的途径得到抑制。
3.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，随着抑制乳酸脱氢酶得到抑制，丙酮酸盐转化为乳酸的途径得到抑制。
4.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，缺失或抑制作为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因pflB及作为对乳酸脱氢酶进行编码的基因ldhA中的一种。
5.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，甲酸、乙酸或乙醇的生成能力得到抑制。
6.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，不缺失对用于将乙酰辅酶A转化为乙醇的酶进行编码的基因。
7.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，以分批培养为基准，2，3-丁二醇的选择性为70％以上。
8.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，以分批培养为基准，2，3-丁二醇的收率为0.35g/g以上。
9.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，以补料分批培养为基准，2，3-丁二醇的选择性为70％以上。
10.根据权利要求1所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物，其特征在于，以补料分批培养为基准，2，3-丁二醇的选择性为80％以上。
11.一种2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，包括：
培养权利要求1至10项中任一项所述的2，3-丁二醇生成能力增加的重组微生物的步骤；以及
从培养液中回收2，3-丁二醇的步骤。
12.根据权利要求11所述的2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，在好氧条件下进行培养。
13.根据权利要求11所述的2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，以450rpm以下的速度进行搅拌，并进行培养。
14.根据权利要求11所述的2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，一边进行搅拌，一边进行上述培养，在培养过程中，乙偶姻的浓度增加5g/L以上的情况下，降低搅拌速度。
15.根据权利要求11所述的2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，在上述培养中，通过调节供氧量来调节2，3-丁二醇的生产率。
16.根据权利要求11所述的2，3-丁二醇的制备方法，其特征在于，一边进行搅拌，一边进行上述培养，在上述培养中，通过调节搅拌速度来调节2，3-丁二醇的生产率。
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