JP6305511B2 - 2,3‐ブタンジオールの生成能が増強された組換え微生物およびこれを用いた2,3‐ブタンジオールの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明の組換え微生物は、アセチルCoAおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、ピルビン酸をアセチルCoAに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路またはピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されている2,3‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物である。
本発明のアセチルCoA(Acetyl‐CoA)生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物からアセチルCoAが合成される経路を意味する。本発明のアセチルCoA生合成経路は、ピルビン酸(pyruvate)からアセチルCoAが合成される経路などであってもよい。
本発明の乳酸(lactate)生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物から乳酸が合成される経路を意味する。本発明の乳酸生合成経路は、ピルビン酸(pyruvate)から乳酸が合成される経路などであってもよい。
本発明のアセチルCoA生合成経路および乳酸生合成経路を有する微生物は、上述の前記生合成経路を有する微生物であればよく、特に限定されない。また、本発明の微生物は、アセチルCoA生合成経路および乳酸生合成経路を野生型として有している微生物または遺伝子組換えにより有するようになる組換え微生物であってもよい。例えば、本発明の微生物は、クレブシエラ(Klebsiella)属、バチルス(Bacillus)属、セラチア(Serratia)属またはエンテロバクター(Enterobacter)属の微生物であってもよく、好ましくは、クレブシエラオキシトカ(K.oxytoca)、クレブシエラニューモニエ(K.pneumoniae)等であり、最も好ましくは、クレブシエラオキシトカ(K.oxytoca)である。
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ(pyruvate‐formate lyase)は、ピルビン酸のアセチルCoAへの転換を調節する。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することにより、ピルビン酸をアセチルCoAに転換する経路が抑制されることができる。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの抑制は、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの発現抑制、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの酵素活性の抑制などにより行われることができる。例えば、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるpflBを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異(一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異)を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することができる。
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ(pyruvate‐formate lyase)は、ピルビン酸のギ酸への転換を調節する。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することにより、ピルビン酸をギ酸に転換する経路が抑制されることができる。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの抑制は、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの発現抑制、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの酵素活性抑制などにより行われることができる。例えば、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるpflBを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異(一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異)を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することができる。
乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase)は、ピルビン酸の乳酸への転換を調節する。前記乳酸脱水素酵素を抑制することにより、ピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されることができる。前記乳酸脱水素酵素の抑制は、乳酸脱水素酵素の発現抑制、乳酸脱水素酵素の酵素活性抑制などにより行われることができる。例えば、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるldhAを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異(一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異)を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、乳酸脱水素酵素を抑制することができる。
アルコール脱水素酵素(アルデヒド/アルコール脱水素酵素)は、アセチルCoAをエタノールに転換する経路を調節する。そのため、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるadhEを欠損させてエタノール生産を阻害することにより、2,3‐ブタンジオールの生産の増加を図る場合もある(Ji et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,85:1751,2010)。しかしながら、本発明の組換え微生物の場合、adhEが追加に欠損される場合、2,3‐ブタンジオールの生産量、選択度および生産性が著しく低下する問題がある。そのため、本発明では、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるadhEを欠損させない。
本発明の2,3‐ブタンジオールの生産方法は、本発明の組換え微生物を培養する段階と、前記培養液から2,3‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む。
‐2,3‐ブタンジオールの濃度(g/L):単位体積当たり生産される2,3‐ブタンジオールの量
‐2,3‐ブタンジオールの収率(g/g):2,3‐ブタンジオール生産量(g)/炭素源(g)×100
‐2,3‐ブタンジオールの生産性(g/L/h):単位時間、単位体積当たり生産される2,3‐ブタンジオールの量
‐2,3‐ブタンジオールの選択度(%):2,3‐ブタンジオール生産量(g)/(2,3‐ブタンジオール、エタノール、アセトイン、こはく酸、乳酸、ギ酸および酢酸の生産量)(g)×100
標的遺伝子の相同部位を含むDNA断片で作製されたクレブシエラオキシトカの標的遺伝子を不活性化させるためにバクテリアの組換えメカニズムを用いており、除去しようとする遺伝子の相同部位(homologous region)をPCRで増幅した。その後、相同部位を含む当該DNA断片をバクテリアに伝達した後、DNA断片に存在する遺伝子の相同部位とクレブシエラオキシトカの染色体に存在する遺伝子の間にリコンビナーゼ(recombinase)による組換えメカニズムで標的遺伝子を除去することになる。
前記作製されたDNA断片を電気穿孔法(electroporation、25μF、200Ω、18kV/cm)を用いてクレブシエラオキシトカに伝達し、微生物の組換えメカニズムを用いて標的遺伝子を除去することができた。
実験例1で準備した実施例1、比較例1および比較例2の微生物を用いて回分式培養を行った。先ず、前記クレブシエラ菌株を9g/Lブドウ糖(50mM、glucose)を含む250mlの複合培地に接種して37℃で16時間培養した後、この培養液を3L複合培地に接種して培養した。この際、醗酵条件は、微好気条件(micro‐aerobic condition;好気速度1vvm、撹拌速度150rpm)、90g/L初期ブドウ糖濃度、pH6.8、培養温度37℃とした。醗酵中にpHの調整のために5N NH4OHを使用した。前記クレブシエラ菌株に対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のOD600(optical density)を測定して生長速度を測定し、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および2,3‐ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。
2,3‐ブタンジオール生産微生物で2,3‐ブタンジオール生合成と競争して副産物の生産に関与する遺伝子を除去する場合、2,3‐ブタンジオールの生産能が改善するか否かを試験した。adhEは2,3‐ブタンジオール生産において副産物であるエタノールの生産に直接関与するアルコール脱水素酵素(アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ)をコードする遺伝子である。そのため、ldhAおよびadhEが除去された比較例3の組換えクレブシエラオキシトカを培養して、実施例1と比較した。この際、比較例3の組換え微生物の培養条件は、前記実験例2と同様に行った。
実施例1の組換えクレブシエラオキシトカを用いて、培養の際に撹拌速度による培地の溶存酸素量の変化が、2,3‐ブタンジオールの生産収率、生産性および選択度に及ぼす影響を評価した。
実験例4の結果に基づき生産性が最も改善した450rpmに撹拌速度を維持して2,3‐ブタンジオール生産のための流加式醗酵を実施例1の菌株を用いて行った。
実施例1の組換えクレブシエラ菌株を9g/Lブドウ糖(50mM、glucose)を含む250mlの複合培地に接種して37℃で16時間培養した後、この培養液を3L複合培地に接種して流加式培養を行った。この際、醗酵条件は、微好気条件(micro‐aerobic condition;好気速度1vvm)、90g/L初期ブドウ糖濃度、pH6.8、培養温度37℃、撹拌速度450rpmとした。醗酵中にpHの調整のために5N NH4OHを使用した。醗酵中にブドウ糖濃度が10g/L以下に低下すると、700g/L以上のブドウ糖溶液をフィード(feeding)した。また、副産物の一つであるアセトイン(acetoin)の濃度が7g/Lになる時点で撹拌速度を450rpmから350rpmに転換して醗酵を行った。前記組換えクレブシエラに対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のOD600(optical density)を測定して生長速度を測定した、採取された試料は13,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および2,3‐ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。
Claims (16)
- アセチルCoAおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、
前記微生物はクレブシエラであり、
ピルビン酸をアセチルCoAに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路およびピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されており、
野生型のクレブシエラよりも乳酸、コハク酸およびエタノールの生成量が少ない、
2,3‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物。 - ピルビン酸‐ギ酸リアーゼが抑制されることにより、ピルビン酸をアセチルCoAに転換する経路およびピルビン酸をギ酸に転換する経路が抑制されることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 乳酸脱水素酵素が抑制されることにより、ピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるpflBおよび乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるldhAのいずれもが欠損または抑制されることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- アセチルCoAをエタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が欠損されていないことを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- ギ酸または酢酸の生成能が抑制されていることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 回分式培養を基準として2,3‐ブタンジオールの選択度が70%以上であることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 回分式培養を基準として2,3‐ブタンジオールの収率が0.35g/g以上であることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 流加式培養を基準として2,3‐ブタンジオールの選択度が70%以上であることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 流加式培養を基準として2,3‐ブタンジオールの選択度が80%以上であることを特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 請求項1から10のいずれか1項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
前記培養液から2,3‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む、2,3‐ブタンジオールの生産方法。 - 好気条件で培養することを特徴とする、請求項11に記載の生産方法。
- 450rpm以下の攪拌速度で撹拌を行いながら培養することを特徴とする、請求項11に記載の生産方法。
- 前記培養は、撹拌を行いながら行われ、
培養途中にアセトインの濃度が5g/L以上に増加する場合に撹拌速度を減少させることを特徴とする、請求項11に記載の生産方法。 - 前記培養は、酸素供給量を調節することにより、2,3‐ブタンジオールの生産性を調節することを特徴とする、請求項11に記載の生産方法。
- 前記培養は、撹拌を行いながら行われ、
前記培養は、撹拌速度を調節することにより、2,3‐ブタンジオールの生産性を調節することを特徴とする、請求項11に記載の生産方法。
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