CN105647953A - 高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法 - Google Patents

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法 Download PDF

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Abstract

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建；二、pack-L和pack-R质粒构建；三、pack-LR质粒构建；四、pT-Kanr质粒构建；五、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建；六、K.oxytoca？HD79-01/pKD46菌株构建；七、ackL-Kanr-ackR转化K.oxytoca？HD79-01/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明用于生产2,3-丁二醇。

Description

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
技术领域
本发明涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
背景技术
产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3-丁二醇产量提高的主要因素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了2,3-丁二醇的产量，同时增加了后续对2,3-丁二醇分离纯化的复杂性。
另外，还存在2,3-丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。
发明内容
本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题，提供高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
本发明高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建：
二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建：
以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别用ack-L1、ack-L2和ack-R1、ack-R2引物进行PCR反应；
三、pack-L和pack-R质粒构建：
向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq(5U/μL)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将片段ack-L和ack-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R；
四、pack-LR质粒构建；
以pack-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和BglII对质粒载体pldh-L进行双酶切，选用限制性内切酶XhoI和BamHI对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4DNA连接酶将pack-R的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR；
五、pT-Kanr质粒构建：
以pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物，对Kanr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Kanr质粒；
六、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建：
以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Kanr和pack-LR进行酶切，将获得的Kanr片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR；
选择限制性内切酶BglII和BamHI对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段ackL-Kanr-ackR；
七、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建：
将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79-01感受态细胞，得到K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株；
八、同源重组片段ackL-Kanr-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46：
将同源重组片段ackL-Kanr-ackR电转化到K.oxytocaHD79-01/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-02。
步骤一所述产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)HD79已在文献《KlebisellaoxytocaHD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析》(中国农学通报，2015。31(14):83-88)中公开。
上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：
一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytocaHD79-02的单菌落接种到种子液培养基中，30℃，150r/min培养至对数生长期，得种子液；
二、然后将种子液以5％的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中，于30℃，150r/min发酵156h后结束；
步骤一中所述种子液培养基配方：(NH4)2SO41g/L、K2HPO4·3H2O3.4g/L、KH2PO41.3g/L、MgSO40.2g/L、酵母提取物1g/L、微量元素2mL/L和铁溶液1mL/L，调pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，之后向每100mL种子培养基中加入经108℃高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末；
步骤二中所述发酵培养基配方：(NH4)2SO46.6g/L、K2HPO4·3H2O8.7g/L、KH2PO46.8g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L、ZnSO4·7H2O0.001g/L、MnSO4·7H2O0.001g/L和CaCl2·2H2O0.001g/L，调整溶液的pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，然后在其中加入经108℃高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
本发明的原理：
本发明是针对已经敲除了乳酸脱氢酶基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株KlebisellaoxytocaHD79-01，其酸性副产物乙酸的积累仍然限制2,3-丁二醇产量提高的问题而设计的。ack基因编码的乙酸激酶是乙酸代谢途径的关键酶，本发明利用λRed同源重组技术对K.oxytocaHD79-01中ack基因敲除，阻断乙酸的生成途径，促使碳流量更多流向2,3-丁二醇，以期获得2,3-丁二醇高产菌株。
首先，通过PCR技术扩增得到乙酸激酶基因的同源左右两臂片段，然后将该两臂片段连接到卡那霉素抗性基因的左右两翼，形成一个表达盒ackL-Kanr-ackR。将该表达盒转入产酸克雷伯氏菌K.oxytocaHD79-01中，通过同源重组的方式，以卡那霉素抗性基因替代乙酸激酶基因，从而完成对乙酸激酶基因的敲除。获得突变株由于不能有效的产生乙酸，使菌株代谢通路发生改变，提高了2,3-丁二醇的产量。
本发明的有益效果：
本发明成功敲除产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)HD-79的ldh基因和ack基因，构建KlebisellaoxytocaHD-79-02菌株，减少乙酸和乳酸的产量，提高了2,3-丁二醇的产量。
其中2,3-丁二醇的产量由29.83g/L提高到46.21g/L，提高了54.9％。而乳酸则由4.94g/L下降到2.45g/L，降低了48.2％。乙酸则由4.28g/L下降到1.59g/L，降低了62.8％.
2,3-丁二醇转化率提高了20.5％；2,3-丁二醇的生产强度提高了106.5％。另外，利用该菌株获得的2,3-丁二醇纯度由57.9％增加到71.2％。同时敲除ldh和ack会对菌体的OD600nm值降低，但是单一的凭借OD值并不能判断重组菌株的产2,3-BD的能力，本发明就是为此提供了一个很好的证明。
本发明关于基因敲除高效生产2,3-丁二醇的构建研究将为今后基因功能的研究提供理论依据。
附图说明
图1为ack-L基因和ack-R基因PCR扩增产物电泳图；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1为ack-L基因PCR产物，泳道2为ack-R基因PCR产物；
图2为ack-L基因阳性克隆菌液PCR验证结果；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
图3为ack-R基因阳性克隆菌液PCR验证结果；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
图4为Kan-up、Kan-down引物对的PCR扩增结果；其中M为DNAMarkerDL2000；泳道1-2为Kanr基因的PCR产物；
图5为Kanr基因阳性克隆菌液PCR验证结果；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
图6为ack-L1、ack-R2引物对PCR结果；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1-2为PCR产物
图7为出发菌株和重组菌株的pH值及OD值对比，其中●表示出发菌株K.oxytocaHD79的OD值，○表示重组菌K.oxytocaHD79-02的OD值，▲表示出发菌株K.oxytocaHD79的pH值，△表示重组菌K.oxytocaHD79-02的pH值；
图8为出发菌株和重组菌株的葡萄糖消耗及2,3-丁二醇产量对比，其中●表示出发菌株K.oxytocaHD79的葡萄糖消耗，○表示重组菌K.oxytocaHD79-02的葡萄糖消耗，▲表示出发菌株K.oxytocaHD79的2,3-丁二醇产量，△表示重组菌K.oxytocaHD79-02的2,3-丁二醇产量。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式提高2,3-丁二醇产量的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建；
二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建；
三、pack-L和pack-R质粒构建；
四、pack-LR质粒构建；
五、pT-Kanr质粒构建；
六、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建；
七、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建；
八、同源重组片段ackL-Kanr-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46。
本实施方式首先PCR扩增ack基因同源左臂片段ack-L产物与目的片段大小相符约308bp，将ack-L基因片段连接入pMD18-T质粒载体，构建pack-L质粒，经PCR验证及BglII、XhoI双酶切验证上述质粒载体构建正确。PCR扩增ack基因同源右臂片段ack-R产物与目的片段大小相符约312bp，将ack-R基因片段连接入pMD18-T质粒，构建pack-R质粒，经PCR验证及XhoI、BamHI双酶切验证上述质粒载体构建正确。以质粒载体pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为引物对卡那霉素抗性基因进行PCR扩增。PCR扩增卡那霉素抗性基因(Kanr)产物与目的片段大小相符约813bp,与设计的预期相符。将Kanr基因片段连接入pMD18-T质粒载体，构建pT-Kanr质粒，经PCR验证及XhoI酶切验证质粒载体构建正确。以pack-LR为骨架，在ack基因同源臂插入打断基因Kanr；经XhoI与EcoRI酶切验证正确。电转化质粒pKD46到KlebisellaoxytocaHD-79-01构建KlebisellaoxytocaHD-79-02/pKD46；将同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化到经L-阿拉伯糖诱导的K.oxytocaHD-79/pKD46中，以达到敲出乳酸脱氢酶基因的目的。
本实施方式中每个步骤的具体内容及结果如下：
1、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建：
一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：
以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L1、ldh-L2和ldh-R1、ldh-R2引物进行PCR反应；
二、pldh-L和pldh-R质粒构建：
向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL5U/μL的TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；
三、pldh-LR质粒构建：
以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组质粒pldh-LR；
四、pT-Cmr质粒构建：
以pGP704-Cm为模板(质粒pGP704-Cm购买自普如汀生物技术有限公司，货号3617178)，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cmr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Cmr质粒；
五、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建：
以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cmr和pldh-LR进行酶切，将获得的Cmr片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；
选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR；
六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：
将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；(质粒pKD46购买自普如汀生物技术有限公司，货号BioVector1058)
七、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：
将同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。
步骤一中ldh-L1引物序列为5’-GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3’，ldh-L2引物序列为5’-CCGCTCGAGACCGAAGCCTTTAAGAATGCGCAGC-3’，ldh-R1引物序列为5’-CCGCTCGAGCTTCGGTATGCGCCTGCT-3’，ldh-R2引物序列为5’-GGAGGATCCTCAGACCAGCGCGTTAGGG-3’。
步骤一中PCR反应体系如下：
PCR反应体系组分 加入体积 终浓度
10×Pfu Buffer with MgSO4 5μL 1×
dNTPs 5μL 各0.2mmol/μL
上游引物 2μL 0.4μmol/μL
下游引物 2μL 0.4μmol/μL
模板DNA 10μL —
Pfu DNAPolymerase 1μL 0.05U/μL
ddH2O 25μL —
PCR扩增的反应程序为：
步骤四中Cm-up引物序列为5’-CCGCTCGAGGCTTGCGCAGACCAAAACG-3’和Cm-down引物序列为5’-CCGCTCGAGGCAGGCATGCAAGCTTGGT-3’。
步骤四中PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
2、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建
以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别用ack-L1、ack-L2和ack-R1、ack-R2引物进行PCR反应，引物序列如表1，反应体系如表2，反应程序如表3，结果如图1。
表1引物序列
引物 序列5’-3’
Kan-up CCGCTCGAGTACATAAACAGTAATACAAGGGGTG
Kan-down CCGCTCGAGATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGA
ack-L1 GGAAGATCTTGAACTGCGGTAGCTCCTCTCTGAA
ack-L2 CCGCTCGAGCTGAATTACGGACTCGTCGATCACC
ack-R1 CCGCTCGAGCAGACCATGCCGGAAGAATCCTATC
ack-R2 CGCGGATCCGGTGTCGTGCAGATGGAAGATGATG
表2ack左臂和右臂扩增的PCR反应体系组分
表3右臂和左臂PCR扩增的反应程序
3、pack-L和pack-R质粒构建
向含有乙酸激酶基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq(5U/μL)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min。将目的条带胶回收纯化，获得的ack的左臂和右臂与pMD18-T载体在16℃水浴中过夜连接，即进行“TA”克隆，反应体系如表4。获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R。将其转入到转化至E.coliDH5α中。分别挑取5株白色菌株进行PCR鉴定和酶切验证，反应体系如表5和表6。PCR验证ack-L结果如图2所示：1-5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与ack-L片段大小相符，为308bp；ack-R结果如图3所示：1-5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与ack-R片段大小相符，为312bp。质粒载体pack-L与pack-R构建成功。
表4ack的左臂和右臂连接体系组分
连接反应体系组分 加入体积(μL)
pMD18-T Vector 1
PCRPurified product 3
Ligation Solution I 5
ddH2O Up to 10
表5ldh的左臂和右臂菌液PCR验证反应体系组分
表6pack-L和pack-R酶切验证反应体系
4、pack-LR质粒构建
以pack-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和BglII对质粒载体pack-L进行酶切，选用限制性内切酶XhoI和BamHI对质粒载体pack-R进行酶切，用T4DNA连接酶将pack-R(XhoI/BglII)的酶切产物连接到pack-L(XhoI/BamHI)质粒载体上。连接反应在16℃条件下过夜进行，连接反应体系如表7，反应程序：16℃，过夜。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，抗生素筛选终浓度为(Amp,Kan100μg/mL)。对重组质粒的阳性转化子以引物分别是ackL1和ack-R2进行菌液PCR验证及用限制性内切酶BglII和BamHI酶切验证。根据图上结果表明重组质粒pldh-LR构建成功。
表7骨架载体pack-L与目的基因ack-R连接反应体系
连接反应体系组分 加入体积(μL)
10×T4DNA ligase buffer 1.0
Vector DNA 1.0
Insert DNA 6.0
T4DNA ligase(5U/μL) 0.5
ddH2O Up to 10
5、pT-Kanr质粒构建
本发明克隆卡那霉素抗性基因(Kanr)将其作为打断基因，插入乙酸激酶基因的同源序列中，使乙酸激酶基因失活。同时，Kanr也可作为后续工程菌株的筛选标记。以pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物(序列如表1)，对Kanr进行PCR扩增。PCR反应体系如表2，反应程序如表8。PCR结果见图4。PCR产物加“A”、目的条带胶回收纯化、“TA”连接、E.coliDH5α感受态细胞的制备及连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选(含Amp，Kan终浓度为100μg/mL)菌落，接种到LB液体培养基培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。用限制性内切酶XhoI对阳性重组质粒进行酶切验证，酶切反应体系见表9。菌液PCR结果见图5。
表8Kanr扩增的PCR反应程序
表9pT-Kanr酶切验证反应体系
酶切体系组分 体积(μL)
10×buffer 1.0
质粒DNA 2.5
Enzyme I 2
ddH2O Up to10
结果如图5所示：1-5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与Kanr片段大小相符，为813bp。重组质粒pT-Kanr构建成功。
6、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建
构建最终的同源重组片段ackL-Kanr-ackR前，先行构建了pack-LR、pT-LKR，其中pack-LR是将部分ack左右同源臂基因整合在一起的质粒，已构建完；pT-LKR是以pack-LR为骨架载体，在ack同源臂中间插入了打断基因Kanr；然后通过酶切的方法获得同源重组片段ackL-Kanr-ackR。
(1)以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Kanr和pack-LR进行酶切，将获得的Kanr片段插入质粒载体pack-LR中，构建成质粒载体pT-LKR。pack-LR和pT-Kanr选择二者共有酶切位点XhoI，对重组质粒pack-LR和pT-Kanr分别进行酶切，酶切反应体系见表8。酶切反应条件均为37℃下作用4h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，胶回收并纯化目的条带。经酶切反应后，条带大小与重组质粒pack-LR(3322bp)相符，说明pack-LR酶切成功。条带大小分别与Kanr片段(813bp)和pMD18-T(2692bp)相符，说明pT-Kanr酶切成功。两者的酶切产物pack-LR和Kanr经胶回收纯化后可用于后续构建pT-LKR试验。
用T4DNA连接酶将pT-Kanr(XhoI)的酶切产物Kanr连接到pack-LR(XhoI)质粒载体上，连接反应在16℃条件下过夜进行，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，抗生素筛选终浓度为Amp100μg/mL和Kan100μg/mL。挑取菌落，接种到LB液体培养基(含Amp100μg/mL和Kan100μg/mL)中，37℃，150r/min过夜培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。结果见图6。引物分别是ack-L1和ack-R2。用限制性内切酶BglII和BamHI对阳性重组质粒进行酶切验证。验证正确阳性重组质粒命名为pT-LKR。
如图6所示：泳道1-2均在1000bp和2000bp之间有一清晰的条带，与ackL-Kanr-ackR(去除骨架pMD18-T部分)即ack-LR、Kanr片段大小之和相符，为1433bp，初步说明目的基因ackL-Kanr-ackR连接到pMD18-T克隆载体上。用限制性内切酶BglII和BamHI酶切重组质粒pT-LKR，结果显示重组质粒pT-LKR被BglII和BamHI完全酶切在约1000bp和2500bp处产生两条清晰的条带，其大小分别与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ackL-Kanr-ackR(1433bp)相符，进一步证明重组质粒pT-LKR构建成功。
(2)构建的质粒载体pT-LKR含有完整的基因敲除序列，即同源基因中插入了打断基因的序列。对质粒载体pT-LKR进行酶切，可获得用于ack基因敲除的同源序列，即为同源重组片段ackL-Kanr-ackR。选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LKR进行酶切。验证正确的线性片段命名为ackL-Kanr-ackR。
选用限制性内切酶BglII和BamHI对重组质粒pT-LKR进行酶切，其结果显示重组质粒pT-LKR被BglII和BamHI完全酶切在2500bp左右处产生两条清晰的条带，其大小分别与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ackL-Kanr-ackR(1433bp)相符，对目的片段进行胶回收并纯化可用于后续电转化试验。
7、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建
本实施方式选用的同源辅助质粒pKD46(购买自普如汀生物技术有限公司，货号BioVector1058)不仅编码λRed重组系统Exo、Bet和Gam三种蛋白因子，并受到L-阿拉伯糖的诱导表达，而且其本身含有氨苄青霉素抗性基因筛选标记。K.oxytocaHD79-01电转化感受态细胞的制备，取纯化后pKD4610μL与50μLK.oxytocaHD79-01感受态细胞充分混合后，转移至0.2cm预冷电转化杯中电击。电转化仪电击参数设置为电压1.8kV，电容25μF，电阻200Ω。电击结束后，立即用1mL新鲜LB液体培养基悬浮电转化杯内的菌液，30℃、150r/min摇床培养4h。菌液6000r/min离心3min收集菌体。用100μLLB液体培养基重悬浮沉淀，然后涂布于含有2mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃恒温培养过夜。挑取转化的单菌落，接种于20mLLB培养基中(含2mg/mLAmp和150ug/mLKan)，30℃振荡培养12-16小时或过夜，保菌。
8、同源重组片段ackL-Kanr-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46
将同源重组片段ackL-Kanr-ackR电转化到含有经过5mML-阿拉伯糖诱导的同源辅助质粒pKD46的K.ocytocaHD79-01宿主菌中，使其与宿主菌中的乙酸激酶基因发生区域同源重组，以达到敲除乙酸激酶基因的目的。ackL-Kanr-ackR电转化K.oxytocaHD79-01/pKD46方法同质粒pKD46转化K.ocytocaHD79-01。得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-02。
9、重组菌株K.oxytocaHD79-01产2,3-丁二醇实验
重组菌株K.oxytocaHD79-02和出发菌株K.oxytocaHD79分别接种到种子培养基中30℃，150r/min培养至对数生长期，以5％接种量分别转接到，装液量为150mL/500mL发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，30℃，150r/min发酵156h后结束。每隔12h取样，测定其pH和OD600nm值。样品经处理后，经高效液相色谱检测乳酸、乙酸、2,3-丁二醇产量和葡萄糖浓度。结果如图7和图8。
由图7可知原始菌株K.oxytocaHD79生长速率快，在60h达到最大OD600nm为0.820，但随着发酵时间的延长逐渐趋于平稳。而重组菌株K.oxytocaHD79-02生长缓慢，在60h后便趋于稳定，但均小于相应时刻的对照菌株。两者的pH值变化均处于下降趋势，但是重组菌株K.oxytocaHD79-02发酵液中的pH略高于原始菌株，介于0.005和0.235之间，原因可能是重组菌株K.oxytocaHD79-02敲除ldh和ack基因致使酸性产物乳酸和乙酸的产量下降，导致发酵液中pH略微升高。
从图8可知，重组菌株的葡萄糖消耗速率明显高于原始菌株，重组菌株在发酵84h时葡萄糖消耗量达到最大值为97.4g，而原始菌株在发酵156h，达到最大值为90.5g。对2,3-丁二醇的产量变化来说，重组菌株K.oxytocaHD79-02在72h，2,3-丁二醇的产量最大值为46.21g/L，而此时对于同等条件下发酵的重组菌株K.oxytocaHD79-01来说，其2,3-丁二醇的产量为33.94g/L，说明由于乙酸代谢途径的敲除，将多余碳流量也流向了2,3-丁二醇途径。原始菌株K.oxytocaHD79则在发酵96h时2,3-丁二醇产量达到最大值为29.83g/L，重组菌株的2,3-丁二醇的产量为38.81g/L，重组菌株是原始菌株的1.3倍。同样是选取2,3-丁二醇产量最高的时间点作比较，即重组菌株72h的2,3-丁二醇产量是原始菌株96h的2,3-丁二醇1.55倍，差异显著(p<0.05)。此时，重组菌株2,3-丁二醇的产量的生产强度为0.64g/L·h，转化率为0.47g/g，原始菌株的2,3-丁二醇的产量的生产强度为0.31g/L·h，转化率为0.39g/g，分别提高了106.5％和20.5％。差异显著(p<0.05)。在2,3-丁二醇产量出现峰值以后，葡萄糖还继续消耗，这是由于葡萄糖继续用于其它代谢产物的生成。另外，2,3-丁二醇纯度由57.9％增加到71.2％。

Claims (7)

1.高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建；
二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建：
以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别用ack-L1、ack-L2和ack-R1、ack-R2引物进行PCR反应；
三、pack-L和pack-R质粒构建：
向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq5U/μL的DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将片段ack-L和ack-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R；
四、pack-LR质粒构建：
以pack-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和BglII对质粒载体pldh-L进行双酶切，选用限制性内切酶XhoI和BamHI对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4DNA连接酶将pack-R的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR；
五、pT-Kanr质粒构建：
以pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物，对Kanr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Kanr质粒；
六、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建：
以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Kanr和pack-LR进行酶切，将获得的Kanr片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR；
选择限制性内切酶BglII和BamHI对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段ackL-Kanr-ackR；
七、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建：
将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79-01感受态细胞，得到K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株；
八、同源重组片段ackL-Kanr-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46：
将同源重组片段ackL-Kanr-ackR电转化到K.oxytocaHD79-01/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-02。
2.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤一中敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建方法具体为：
①ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：
以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L1、ldh-L2和ldh-R1、ldh-R2引物进行PCR反应；
②pldh-L和pldh-R质粒构建：
向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL5U/μL的TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；
③pldh-LR质粒构建：
以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组质粒pldh-LR；
④pT-Cmr质粒构建：
以pGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cmr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Cmr质粒；
⑤同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建：
以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cmr和pldh-LR进行酶切，将获得的Cmr片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；
选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR；
⑥K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：
将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；
⑦同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：
将同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。
3.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中ack-L1引物序列为5’-GGAAGATCTTGAACTGCGGTAGCTCCTCTCTGAA-3’，ack-L2引物序列为5’-CCGCTCGAGCTGAATTACGGACTCGTCGATCACC-3’，ack-R1引物序列为5’-CCGCTCGAGCAGACCATGCCGGAAGAATCCTATC-3’，ack-R2引物序列为5’-CGCGGATCCGGTGTCGTGCAGATGGAAGATGATG-3’。
4.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系如下：
PCR扩增的反应程序为：
5.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中Kan-up引物序列为5’-CCGCTCGAGTACATAAACAGTAATACAAGGGGTG-3’和Kan-down引物序列为5’-CCGCTCGAGATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGA-3’。
6.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
7.如权利要求1所述的方法构建得到的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：
一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytocaHD79-02的单菌落接种到种子液培养基中，30℃，150r/min培养至对数生长期，得种子液；
二、然后将种子液以5％的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中，于30℃，150r/min发酵156h后结束；
步骤一中所述种子液培养基配方：(NH4)2SO41g/L、K2HPO4·3H2O3.4g/L、KH2PO41.3g/L、MgSO40.2g/L、酵母提取物1g/L、微量元素2mL/L和铁溶液1mL/L，调pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，之后向每100mL种子培养基中加入经108℃高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末；
步骤二中所述发酵培养基配方：(NH4)2SO46.6g/L、K2HPO4·3H2O8.7g/L、KH2PO46.8g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L、ZnSO4·7H2O0.001g/L、MnSO4·7H2O0.001g/L和CaCl2·2H2O0.001g/L，调整溶液的pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，然后在其中加入经108℃高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
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