CN116179386A - 一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用 - Google Patents

一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用。本发明通过系统改造启动子、信号肽及共表达分子伴侣，成功实现了高水平胞外表达右旋糖酐酶，胞外酶活达到159.68U/mL，相较于未改造的出发菌株，酶活提高了2.1倍。进一步通过5L罐上放大发酵，酶活力达到了3257.23U/mL。

Description

一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
右旋糖苷(dextran)，又名α葡聚糖，是一类主要由α-1，6糖苷键，夹杂着α-1，3、α-1，4糖苷键连接而成的葡聚糖大分子，由蔗糖经过肠膜状明串珠菌发酵而得来，其分子量大小随聚合度变化存在差异。
右旋糖酐酶可以专一性切割α-1，6糖苷键，将大分子量葡聚糖水解为低分子量葡聚糖，异麦芽糖等，因此在制糖产业，龋齿防止和医用等领域有着广泛应用。在制糖工业中，右旋糖苷经过细菌从原料中的蔗糖发酵得来，因此右旋糖酐酶在制糖工业应用主要有：1)降低原料损耗；2)防止干扰物料衡算；3)降低因右旋糖苷的产生而引起的粘度增加的现象；4)提高蔗糖结晶质量。在龋齿防治方面，右旋糖酐酶可以降解因为牙床菌体繁殖产生的菌齿斑。在医药方面，低分子量右旋糖苷可以用作血容量补充药。
在自然界存在着众多能够产生右旋糖酐酶的菌株，包括各种原核以及真核生物。其真核来源有青霉以及绒毛小球菌以及斯氏油脂酵母等，近些年来也有报道在海洋微生物链卵菌属中也有发现。原核来源主要是链球菌，拟杆菌等。如今主要商品化右旋糖酐酶主要来源于毛壳菌属和青霉菌属。国内对右旋糖酐酶的菌株筛选主要来自于海洋菌群，主要有交替假单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)、链状菌(Catenovulumsp.DP03)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)。其中大多数酶活力较低，只有来自于交替假单胞菌的右旋糖酐酶在经过优化后达到了270.1U/mL。
目前，商品化的右旋糖酐酶仍旧来自于野生菌，通过自然界筛选，进一步诱变提高酶产量，从而获得形状优良的高产菌株。但是利用野生菌生产右旋糖酐酶的同时，还会产生次级代谢产物，给分离带来一定困难，因此在应用上存在一定限制。近些年来，右旋糖酐酶的异源表达也被广泛研究。因此，构建右旋糖酐酶异源表达的工程菌，简化酶表达纯化工艺，优化成本，得到了越来越多的关注。国内外对右旋糖酐酶的异源表达研究已有20余年，主要的异源表达体系分为原核和真核。在原核表达体系中，主要宿主为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。2019年，王乐怡等以枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达了来自细丽毛壳菌的右旋糖酐酶基因，最终酶活力为21.25U/mL。刘乐等在大肠杆菌中异源表达了来自海洋氧化节杆菌的经过改造的右旋糖酐酶基因，最终酶活力达到了50U/mL。原核表达体系相较于真核表达体系相对周期较短，但是对于真核来源的右旋糖酐酶基因，原核表达体系就存在着无法翻译后修饰的问题。除此之外，大肠体系因为难以实现分泌表达、获得目的蛋白需要对菌体进行破碎，操作繁琐，同时也存在产生内毒素的问题，因此，在真核表达体系中进行右旋糖酐酶的外源表达，受到了广泛关注。
毕赤酵母作为真核表达体系，被认为是GRAS菌株，有着优秀的外源蛋白分表达能力，这使得其分泌的蛋白可以快速高效纯化。除此之外，以毕赤酵母作为表达宿主，可以对重组蛋白进行由内质网到高尔基体的翻译后修饰加工，这对于因此在近年来以毕赤酵母作为宿主进行重组蛋白表达发展迅速。Kang等所构建的斯达油氏酵母(Lipomyces starkeyi)来源的右旋糖酐酶重组毕赤酵母在10L发酵罐中酶活力达到了134U/mL。
总的来看，国内外对微生物右旋糖酐酶的研究已有一定成效，但是仍无法满足工业生产需求。如何构建高水平表达右旋糖酐酶的重组菌株，已经成为当下研究热点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，本发明通过信号肽、启动子改造以及共表达分子伴侣来实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，提供包含本发明基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞。
本发明的第一个目的是提供一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，所述毕赤酵母重组菌株是以毕赤酵母为宿主，以α(Δ57-70)-HL28为信号肽，采用启动子DAS2异源表达了右旋糖酐酶。
进一步地，所述右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述启动子DAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述毕赤酵母重组菌还共表达了分子伴侣。
进一步地，所述分子伴侣为Kar2、Hac1、Ero1、Cne1、Ubc1、Hrd1、Sec1、Bmh2、Sly1、Vps33、Vps45、Sbh1、Sso2、Sec53或Ssa4。
进一步地，所述分子伴侣以质粒pGAPZA为载体。
进一步地，共表达分子伴侣Ssa4的重组质粒序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS115。
进一步地，所述毕赤酵母重组菌株以质粒pPIC9K为表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种采用所述毕赤酵母重组菌株在发酵生产右旋糖酐酶的方法，包括如下步骤：
将毕赤酵母重组菌株的种子液以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，培养12-24h后，补料体积百分比为30％-50％的甘油，至菌体湿重达到200-250g/L，停止补料，使菌体饥饿1～3h，流加诱导剂诱导产酶。
进一步地，所述诱导剂为山梨醇与甲醇按照质量体积比为1:15～20配制得到。
进一步地，所述发酵培养基中含有60％-85％ H3PO4 26.7mL/L、CaSO4·2H2O 0.5-1.0g/L、K2SO4 15-20g/L、MgSO4·2H2O 10-20g/L、KOH 1-10g/L、甘油20-100g/L和PTM1 1-10mL/L。
进一步地，所述种子液是将毕赤酵母重组菌株接种至种子培养基中，于25～30℃、200～220rpm下培养至对数生长期，作为种子液。
进一步地，所述种子培养基含有：酵母粉10-20g/L、蛋白胨20-40g/L和葡萄糖10-30g/L。
本发明的有益效果是：
本发明通过系统改造启动子、信号肽及共表达分子伴侣，成功实现了高水平胞外表达右旋糖酐酶，胞外酶活达到159.68U/mL，相较于未改造的出发菌株，酶活提高了2.1倍。进一步通过5L罐上放大发酵，酶活力达到了3257.23U/mL。
附图说明：
图1是pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX质粒图谱；
图2是pGAPZA-Ssa4质粒图谱；
图3是右旋糖酐酶在表达元件及分子伴侣共表达下的酶活测试结果；其中，1：GS115-pPIC9K-DEX、2：GS115-pPIC9K-DAS2-DEX、3：GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX、4：GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX-pGAPZA-Ssa4；
图4是右旋糖酐酶在表达元件改造下的SDS-PAGE图谱；其中，M：蛋白标准marker、1：GS115、2：GS115-pPIC9K、3：GS115-GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX-pG APZA-Ssa4；
图5是发酵罐酶活力-时间曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
右旋糖酐酶活性的测定方法
2％右旋糖苷T2000底物的配制：将2g右旋糖苷T2000溶于100ml磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)中配制成2％的右旋糖苷T2000底物溶液。
测定方法：根据3,5-二硝基水酸(DNS)比色法测定右旋糖酐酶分解右旋糖苷T2000产生的还原糖含量。分别以发酵液和右旋糖苷T2000溶液为实验组，发酵液和水作为对照组，50℃反应10min，加入DNS试剂，沸水浴终止反应，冷却后使用酶标仪在540nm处测量吸光值。制备不同浓度的葡萄糖溶液，建立葡萄糖标准曲线。
酶活计算方法：酶活(1U)定义为上述实验条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，测定均重复3次。以此作为右旋糖苷酶酶活标准测定方法。
实施例1：
本发明提供了一种右旋糖酐酶，包括574个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了一种表达右旋糖酐酶的重组质粒，包括右旋糖酐酶序列、使右旋糖酐酶胞外表达的信号肽α(Δ57-70)-HL28和用于表达右旋糖酐酶的启动子DAS2，其中，信号肽α(Δ57-70)-HL28的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长309个核苷酸，编码103个氨基酸；启动子DAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，全长1099个核苷酸。
本发明还提供了一种重组质粒，用来表达分子伴侣。其中本实施例分子伴侣为Ssa4，包含Ssa4的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全长4714个核苷酸。
实施例2：
本实施例提供了重组质粒pPIC9K-DEX的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)右旋糖酐酶编码序列的扩增
以含有右旋糖酐酶编码基因的重组质粒pET-28a(+)-DEX为模板，设计引物(P1、P2)扩增右旋糖酐酶编码序列：
引物P1：5’-ACGACGACGACAAGGAATTCATGGGTACGACTAATAACACACATTGT-3’
引物P2：5’-GCGAATTAATTCGCGGCCGCTCAGGAGATTTGCCACTCTCCC-3’
PCR扩增反应在40μL体系中进行，反应体系中加入20μL
Figure BDA0004126411450000041
Max，15μL ddH2O，1μL模板DNA，上下游引物各2μL。反应条件为在95℃预变性3min后开始循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸5min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)重组质粒pPIC9K-DEX的构建
将pPIC9K质粒EcoR I和Not I进行双酶切，37℃酶切1h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用同源重组酶在37℃连接30min，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上，过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。
(3)重组质粒pPIC9K-DEX转化至P.pastoris GS115
将步骤(2)中的重组质粒送至测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pPIC9K-DEX，Sal I线性化后后回收纯化，转化到P.pastoris GS115中。重组菌株在培养基中培养144h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10分钟，收集上清液进行活性测定，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DEX的酶活为51.48U/mL。
实施例3：
本实施例提供了启动子改造重组质粒pPIC9K-DAS2-DEX的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以P.pastoris GS115基因组为模板，设计引物(P3、P4)扩增DAS2启动子序列：
引物P3：5’-ATTGGGCTTGATTGGAGCTCAATGATATTTGAGGGTGTTAGTTACT-3’
引物P4：5’-AAATCTCATCGTTTGGATCCttttgatgtttgATAGTTTGATAAGAGTGAAC-3’
PCR扩增反应在40μL体系中进行，反应体系中加入20μL
Figure BDA0004126411450000051
Max，15μL ddH2O，1μL模板DNA，上下游引物各2μL。反应条件为在95℃预变性3min后开始循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃终延伸5min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)将实施例2所构质粒pPIC9K-DEX用Sac I和BamH I进行双酶切，37℃酶切1h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物。
(3)重组质粒pPIC9K-DAS2-DEX的构建
在PCR管中加入步骤(1)(2)回收产物各0.2pmol和0.06pmol，加入等体同源重组酶。混匀后37℃连接30min，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。
(4)重组质粒pPIC9K-DAS2-DEX转化P.pastoris GS115
将步骤(3)中的重组质粒送至测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pPIC9K-DAS2-DEX，将重组质粒使用Sal I线性化后回收纯化，转化到P.pastorisGS115中。重组菌株在培养基中培养144h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min收集上清液进行活性测定，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DAS2-DEX的酶活为94.42U/mL，相较于菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DEX，酶活提高了83.41％。
实施例4：
本实施例提供了表达元件改造重组质粒pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以pUC18-signal为模板，设计引物(P5、P6)扩增α(Δ57-70)-HL28信号肽序列：
引物P5：5’-acatcaaaaGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3’
引物P6：5’-TTAGTCGTACCCATGAATTCCTTGTCGTCGTCGTCaccGT-3’
PCR扩增反应在40μL体系中进行，反应体系中加入20μL
Figure BDA0004126411450000061
Max，15μL ddH2O，1μL模板DNA，上下游引物各2μL。反应条件为在95℃预变性3min后开始循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃终延伸5min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)将实施例3所构质粒pPIC9K-DAS2-DEX用Sac I和BamH I进行双酶切，37℃酶切1h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物
(3)重组质粒pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX的构建
在PCR管中加入步骤(1)(2)回收产物各0.2pmol和0.06pmol，加入等体积同源重组酶。混匀后37℃连接30min，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。
(4)重组质粒pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX转化P.pastoris GS115
将步骤(4)中的重组质粒送至测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX，重组质粒使用Sal I线性化后回收纯化，转化到P.pastoris GS115中。重组菌株在培养基中培养144h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min，收集上清液进行活性测定，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX的酶活为118.08U/mL，相较于菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DAS2-DEX，酶活提高了25.06％。
实施例5：
本实施例提供了分子伴侣共表达重组质粒pGAPZA-Ssa4的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以P.pastoris GS115基因组为模板，设计引物(P7、P8)扩增Ssa4基因：
引物P7：5’-ctaattattcgaaacggaattcATGGGTAAATCAATTGGAATTGATT-3’
引物P8：5’-tcaatgatgatgatgatgatgatcgacttcttccacggttggt-3’
PCR扩增反应在40μL体系中进行，反应体系中加入20μL
Figure BDA0004126411450000071
Max，15μL ddH2O，1μL模板DNA，上下游引物各2μL。反应条件为在95℃预变性3min后开始循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃终延伸5min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)将质粒pGAPZA用EcoR I和Sal I进行双酶切，37℃酶切1h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒。
(3)重组质粒pGAPZA-Ssa4的构建
在PCR管中加入步骤(1)(2)回收产物各0.2pmol和0.06pmol，加入等体积同源重组酶。混匀后37℃连接30min，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。
(4)重组质粒pGAPZA-Ssa4转化P.pastoris GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX
将步骤(4)中的重组质粒送至测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pGAPZA-Ssa4，重组质粒使用Bln I线性化后回收纯化，转化到P.pastoris GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX中。重组菌株在培养基中培养144h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min收集上清液进行活性测定，重组菌株P.pastoris GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX-pGAPZA-Ssa4的酶活为159.68U/mL，相较于菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX，酶活提高了35.23％。
实施例6：
本实施例提供了重组菌株P.pastoris GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX-pGAPZA-Ssa4的5L罐上高密度发酵，具体步骤如下：
将实施例5中重组菌株P.pastoris GS115-pPIC9K-DAS2-α(Δ57-70)-HL28-DEX-pGAPZA-Ssa4接种于种子培养基中，于25～30℃、200～220rpm下培养至对数生长期，作为种子液，再将种子液以5-10％的接种量转入发酵培养基BSM中，待菌体生长12-24h后，补料30％-50％(v/v)甘油，直至菌体湿重达到200-250g/L，停止补料，使菌体饥饿2h，流加诱导剂，诱导产酶。138h酶活力达到最大，为3257.23U/mL，是摇瓶水平的20.4倍。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌株是以毕赤酵母为宿主，以α(Δ57-70)-HL28为信号肽，采用启动子DAS2异源表达了右旋糖酐酶。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述启动子DAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌还共表达了分子伴侣。
6.根据权利要求5所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述分子伴侣为Kar2、Hac1、Ero1、Cne1、Ubc1、Hrd1、Sec1、Bmh2、Sly1、Vps33、Vps45、Sbh1、Sso2、Sec53或Ssa4。
7.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS115。
8.一种采用权利要求1～7任一项所述毕赤酵母重组菌株在发酵生产右旋糖酐酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将毕赤酵母重组菌株的种子液以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，培养12-24h后，补料体积百分比为30％-50％的甘油，至菌体湿重达到200-250g/L，停止补料，使菌体饥饿1～3h，流加诱导剂诱导产酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导剂为山梨醇与甲醇按照质量体积比为1:15～20配制得到。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有60％-85％H3PO426.7mL/L、CaSO4·2H2O 0.5-1.0g/L、K2SO4 15-20g/L、MgSO4·2H2O 10-20g/L、KOH 1-10g/L、甘油20-100g/L和PTM1 1-10mL/L。
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