CN108795937A

CN108795937A - 高效异源表达碱性蛋白酶的启动子组合及其基因工程菌

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Publication number: CN108795937A
Application number: CN201810612749.XA
Authority: CN
Inventors: 路福平; 李玉; 史超硕; 刘逸寒; 张会图; 刘夫锋
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108795937B

Abstract

本发明提供了一种高效异源表达碱性蛋白酶的启动子组合，以及利用该启动子构建的基因工程菌。本发明将分别来源于芽孢杆菌属的两种不同α‑淀粉酶基因的启动子进行组合，获得核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的启动子组合，利用该启动子组合实现了嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)来源的碱性蛋白酶在枯草芽抱杆菌宿主中的高效异源表达，重组碱性蛋白酶的表达活性分别达到4525.23U/mL和6124.91U/mL，是单个启动子表达活性的137％和150％。为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。

Description

高效异源表达碱性蛋白酶的启动子组合及其基因工程菌

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及能够高水平异源表达碱性蛋白酶的启动子组合以及利用该启动子构建的基因工程菌。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中，酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。

且芽孢杆菌具有以下优点：(1)在工业生产中，一般要求菌株对健康或环境无毒无害，芽孢杆菌中除了炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌的少数菌株外，几乎都没有致病性；(2)芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。启动子(promoter)是一段RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA Pol)识别、结合和起始转录的特定DNA序列。细菌启动子是与RNA聚合酶结合的靶序列，是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。因此，筛选获取强启动子，是介导蛋白酶基因的表达并提高碱性蛋白酶产量非常有效的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种高效表达碱性蛋白酶的启动子组合，以及利用该启动子构建的基因工程菌。本发明将分别来源于芽孢杆菌属的两种不同α-淀粉酶基因的启动子pLY-1、pLY-2进行组合，获得两种启动子组合pLY-1-2和pLY-2-1，利用该启动子组合实现了嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)来源的碱性蛋白酶在枯草芽抱杆菌宿主中的高效异源表达。本发明可以有效地提高异源碱性蛋白酶的表达量，且方法简单、操作易行、表达稳定，适用于枯草芽孢杆菌的表达系统。

本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：

一种启动子组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

上述启动子组合的用途是在枯草芽孢杆菌宿主中表达调控嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶。

一种高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌，是利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的启动子组合与嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE构建重组表达载体，并转入枯草芽孢杆菌宿主WB600中，获得重组基因工程菌。

所述嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE的核苷酸序列如GenBank:FJ940727.1所示。

所述表达载体为pWB980。

所述基因工程菌的构建步骤概述如下：

1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的启动子组合；

2)以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到核苷酸序列如GenBank:FJ940727.1所示的碱性蛋白酶基因aprE；

3)启动子组合片段与碱性蛋白酶基因片段经相同酶切后连接，连接产物纯化后克隆到pWB980表达载体上，转入枯草芽孢杆菌WB600细胞中构建重组菌；

4)重组菌发酵表达重组碱性蛋白酶。

所述基因工程菌应用于发酵生产碱性蛋白酶，发酵培养培养48h后发酵液中重组碱性蛋白酶的活性分别为4525.23U/mL、6124.91U/mL，分别是单个启动子表达活性的137％和150％。

本发明的有益效果：

本发明通过筛选两种芽孢杆菌属来源的启动子高效异源表达嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶，并通过启动子组合后进一步提高蛋白酶表达量，方法简单易行，适用于枯草芽孢杆菌系统，启动子组合后的重组碱性蛋白酶表达活性分别提高了137％和150％。为介导枯草芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。本发明的启动子组合用于提高其它外源蛋白基因在枯草芽抱杆菌中的表达也具有较好的效果。

附图说明

图1：重组载体各片段回收验证；其中，M：核酸分子量标准；1：启动子pLY-1；2：启动子pLY-2；3：启动子pLY-1-2；4：启动子pLY-2-1；5：aprE；6：pWB980酶切；7：pWB980质粒。

图2：两种启动子及两种启动子组合对aprE基因的表达活性水解圈。

图3：两种启动子及两种启动子组合对aprE基因的表达活性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用培养基及酶活测定方法：

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。用于蛋白酶发酵。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

SP-A Salts Solution：(NH₄)₂SO₄ 4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，Trisodium Citrate Dihydrate 2g/L；

SP-B Salts Solution：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

100×CAYE Solution：Casamino acid 20g/L，Yeast Extract 100g/L；

SPI培养基(200mL)：SP-A Salts Solution 98mL，SP-B Salts Solution 98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

SPII培养基(600mL)：SPI培养基588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂6mL；

100×EGTA Solution：10mmol/L EGTA溶液。

本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

实施例1：

启动子的筛选、组合，及碱性蛋白酶基因的克隆。

利用NCBI数据库并通过在线分析软件Promoter 2.0Prediction Server预测获得两种芽孢杆菌属α-淀粉酶基因启动子，设计PCR引物，以两种α-淀粉酶基因作为模板PCR扩增启动子pLY-1和pLY-2(核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，并进一步获得核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的两种启动子组合片pLY-1-2和pLY-2-1。以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板PCR扩增碱性蛋白酶基因aprE(GenBank:FJ940727.1)。

所用引物序列及酶切位点如下表：

扩增目的基因时所用的反应体系为50μL，如下所示：

启动子的退火温度是60℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

aprE的退火温度是58℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

实施例2：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的构建。

PCR产物切胶回收后获得的两种启动子片段pLY-1、pLY-2及两种启动子组合片段pLY-1-2、pLY-2-1分别与嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因片段分别使用BamHⅠ酶切后连接，连接产物纯化后使用SphⅠ和XbaⅠ双酶切并切胶回收，通过连接酶克隆到pWB980表达载体上构建重组表达载体。重组表达载体通过如下方法转入枯草芽孢杆菌WB600细胞中，构建四种重组基因工程菌。

酶切体系如下：

pWB980表达载体的酶切及与目的基因的连接：

(1)提取pWB980质粒，然后根据所需要的限制性内切酶(XbaⅠ、SphⅠ)双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；

(2)对酶切目标片段进行胶回收纯化；

(3)将回收好的目的片段和pWB980片段连接，连接条件，16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：

目的片段和启动子片段 4.5μL

线性pWB980片段 0.5μL

Solution I 5.0μL

枯草芽孢杆菌WB600化转方法：

(1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm，过夜培养；

(2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220rpm培养至对数生长末期OD₆₀₀＝1.2(约3–4h)；

(3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100rpm培养1.5h；

(4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/L EGTA，37℃，100rpm培养10min；

(5)加入连接产物，37℃，100rpm培养30min；

(6)调节转速至220rpm，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

实施例3：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的表达及分析。

将新鲜平板上的重组基因工程菌的单菌落分别接入50mL卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，以相同的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵培养。

分别取四株重组菌发酵培养48h时的发酵上清液，经10KD超滤柱浓缩后进行蛋白电泳检测，结果表明在两种启动子及两种启动子组合的调控下，重组碱性蛋白酶均成功表达。

按照国家标准GB/T 23527-2009附录B福林酚法测定重组基因工程菌发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，发酵培养36h后，每隔4h取发酵上清液，经测定48h各重组菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力达到最高。此时，两种启动子pLY-1、pLY-2表达重组碱性蛋白酶的酶活力分别为3291.09U/mL、4041.01U/mL，说明pLY-2的启动强度明显高于pLY-1，即是pLY-1的1.23倍。两种启动子组合pLY-1-2、pLY-2-1所构建的重组菌表达重组碱性蛋白酶的酶活力分别为4525.23U/mL、6124.91U/mL，分别是pLY-1和pLY-2单个启动子所构建的重组菌表达活性的137％和150％。

通过在线分析软件BPROM对启动子进行结构预测和分析。pLY-1、pLY-2两种启动子的保守序列均被σ^A因子识别，pLY-1保守区之间间隔为18bp；pLY-2经分析含有两个保守区，各保守区之间间隔为18bp和15bp，这可能是造成pLY-2的启动活性高于pLY-1启动子的主要原因。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 高效异源表达碱性蛋白酶的启动子组合及其基因工程菌

<141> 2018-06-14

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tcaagcccgc ttttttcatt attgccgcga caaatgaccg aggcgtgaat caggagatag 60

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<210> 2

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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gggggttgtt attattttac tgatatgtaa aatataattt gtataagaaa atgagaggga 1020

gaggaaac 1028

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 3

tcaagcccgc ttttttcatt attgccgcga caaatgaccg aggcgtgaat caggagatag 60

ccgcaaacgc ttctgaaacg cagctggtca actgtgtaag caaggctgaa caaggcagcg 120

tatatatgcc gaagatcatc cgcaaagggc gcattcaagt atcagtatca acaagcgggg 180

caagccccgc acatacgaaa agactggctg aaaacattga gcctttgatg actgatgatt 240

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aaaggggggt tgttattatt ttactgatat gtaaaatata atttgtataa gaaaatgaga 420

gggagaggaa ac 432

<210> 4

<211> 596

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

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ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

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<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

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<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ccaagcttca ttatgtttga atttccgttt aaagaatg 38

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ggcatgccgc ttacatttaa aattatcaca atcactc 37

Claims

1.一种启动子组合，其特征在于，所述启动子组合的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示。

2.权利要求1所述启动子组合的用途，其特征在于，所述用途是在枯草芽孢杆菌宿主中表达调控嗜碱芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶。

3.一种高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的启动子组合与嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE构建重组表达载体，并转入枯草芽孢杆菌宿主WB600中，获得重组基因工程菌。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE的核苷酸序列如GenBank:FJ940727.1所示。

5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pWB980。

6.权利要求3-5任一所述基因工程菌的构建方法，步骤如下：

4)重组菌发酵表达重组碱性蛋白酶。

7.权利要求3-5任一所述基因工程菌应用于发酵生产碱性蛋白酶的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌发酵培养48h后发酵液中重组碱性蛋白酶的酶活力分别达到4525.23U/mL和6124.91U/mL，或分别是核苷酸序列如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示的启动子所构建的重组菌表达活性的137％和150％。