CN110423704A

CN110423704A - 一种高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母菌株

Info

Publication number: CN110423704A
Application number: CN201910512908.3A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 程娇梅; 葛菁华
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明提供了一株阿魏酸酯酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株毕赤酵母9944B，保藏编号为CCTCC NO:M2019434。该突变菌株能大幅度提高阿魏酸酯酶的产量，20L罐160h后，其发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活高达352U/ml，比出发菌提高了94.5%，取得了意料不到的技术效果。

Description

一种高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母菌株及其应用。

背景技术

阿魏酸（ferulic acid）的化学名称为4-羟基-3-甲基-2-苯丙烯酸，是植物界普遍存在的一种酚酸，其在植物细胞壁结构中起着重要的作用，可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。

阿魏酸酯酶（Feruloyl esterase，EC 3.1.1.73）又称为肉桂酸酯酶，属于羧酸酯水解酶亚类，该酶可以水解植物细胞壁中由阿魏酸、p-香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸与半纤维素和木质素形成的酯键，打破它们形成的网状结构，将半纤维素和木质素分开，使纤维素酶可以与纤维素充分接触，大大提高纤维素的降解率。阿魏酸酯酶在加速木质纤维素降解的同时还释放出阿魏酸、p-香豆酸等抗氧化物质，在食品、造纸、医药、化妆品、生产生物乙醇等行业具有很高的应用价值和广阔的市场前景。

1987年Mackenzie C R等培养橄榄色链霉菌（Streptomyces olivochromogenes）时，发现阿魏酸酯酶可以从麦麸中释放出阿魏酸，此后阿魏酸酯酶被认为是半纤维素水解酶。研究表明真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前发现的产酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillus niger）、链霉菌（如Streptomyces avermitilis）、梭菌（如Clostridium thermocellum）、杆菌（如Bacillus sp.）、乳酸杆菌（Lactobacilli）、假单胞菌（如Pseudomonas fluorescens）等。但绝大多数阿魏酸酯酶从真菌中分离得到，尤其曲霉菌属（Aspergillus sp.），如黄柄曲霉（Aspergillus flavipes）和黑曲霉（Aspergillus niger）特别受到研究者的普遍关注，这2种菌种能以去淀粉麦麸或玉米糠为碳源，通过深层培养产生阿魏酸酯酶。

目前，已经有近20种不同来源的阿魏酸酯酶基因被克隆和测序，其中多个已经在原核和真核表达系统实现了异源或同源表达。研究发现，真菌阿魏酸酯酶在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达时不能形成正确空间折叠的蛋白，导致其在大肠杆菌中不表达或表达量很低，如黑曲霉的阿魏酸酯酶FAEA在大肠杆菌中的表达量仅为在黑曲霉中表达量的1/10。相比而言，毕赤酵母（Pichia pastoris）是较理想的真菌阿魏酸酯酶的表达体系，以芽殖酵母的α因子为分泌信号，并利用乙醇氧化酶（AOXl）的启动子在毕赤酵母中已经实现了多个真菌阿魏酸酯酶基因的异源表达。

目前已有的生产菌种中阿魏酸酯酶的产量普遍偏低，从而导致该酶的生产成本居高不下，限制了其应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株及其应用。所述毕赤酵母突变菌株是经紫外诱变筛选获得的，其能大幅度提高阿魏酸酯酶的表达量，且不影响阿魏酸酯酶的酶学性质和应用效果，应用前景广阔。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有阿魏酸酯酶基因。

所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株毕赤酵母9944B（Pichia pastoris 9944B），是以上述的毕赤酵母工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

所述突变菌株已于2019年6月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019434。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变菌株在生产阿魏酸酯酶中的应用。

本发明将来源于棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母宿主中过表达，构建得到重组表达阿魏酸酯酶的工程菌株毕赤酵母9944A。该菌株摇瓶发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活达到10U/ml。

为了提高阿魏酸酯酶的产量，申请人以毕赤酵母9944A为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株毕赤酵母9944B。该突变菌株能大幅度提高阿魏酸酯酶的产量，20L罐160h后，其发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活高达352U/ml，比出发菌提高了94.5%，取得了意料不到的技术效果。而且该突变菌株产阿魏酸酯酶的酶学性质并未因突变发生明显变化，最适作用pH均为4.5-5.5，最适作用温度均为55℃，与出发菌一致。所述突变菌株可广泛应用于阿魏酸酯酶的生产，从而有利于降低阿魏酸酯酶的生产成本，促进其在饲料等工业领域中的推广与应用。

附图说明

图1为pH-相对酶活曲线；

图2为温度-相对酶活曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

培养基配方：

大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，pH7.0)；

酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物、2%蛋白胨2%葡萄糖；

酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨、2%琼脂糖；

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5 生物素，1%甘油；

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5 生物素，0.5%甲醇；

LB-AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；

LB-AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；

上层培养基：0.1%MgSO4，1%KH2PO4，0.6%(NH4)2SO4，1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖；

下层培养基平板：2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4，1.5%KH2PO4，0.06%MgSO4，0.06%CaCl2，1.5%琼脂。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 基因克隆与重组质粒的构建

以棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出阿魏酸酯酶基因片段，其核苷酸序列（去除内含子）为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1（F）：GCGAATTCGCCTCTACGCAGGGCATCTCC；

引物2（R）：TAGCGGCCGCTCACCATGTACAGGCTCCGCT。

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的阿魏酸酯酶基因大小为783bp。

用限制性内切酶EcoR I和Not I(Fermentas)对阿魏酸酯酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。

使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的蛋白序列为SEQID NO:1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pPIC9K-9944。

实施例2 毕赤酵母工程菌株的构建

将重组质粒pPIC9K-9944用Sal I进行线性化，质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-9944，再在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

分别挑取单个转化子转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中30℃、250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到发酵上清液。将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测和阿魏酸酯酶酶活力检测。结果显示，所述发酵上清液在30 kDa处有一明显的蛋白条带，与阿魏酸酯酶理论分子量一致。而且酶活测定结果显示，所述发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活达到10 U/ml。从而说明，本发明构建得到的毕赤酵母工程菌株能成功表达阿魏酸酯酶，申请人将其命名为毕赤酵母9944A（Pichia pastoris 9944A）。

阿魏酸酯酶酶活测定方法

1、酶活单位的定义

在37℃、pH值为6.0的条件下，每分钟从浓度为2 mmol/L的阿魏酸甲酯溶液中释放1 μmol阿魏酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

2、测定方法

取1ml稀释好的酶液于试管中放置于37℃水浴锅中，预热5min，加入1ml底物（2 mmol/L阿魏酸甲酯溶液，pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制），反应15min，加入2ml终止液（20%冰乙酸），过0.22um水系滤器，通过液相色谱进行测定阿魏酸浓度C，控制生成阿魏酸的浓度在0.015g/L-0.025g/L之间。

酶活计算公式：

酶活力U=C×0.04×1000000×n/194.19/15/m

式中：C-----液相测定出来的浓度，单位为g/L；

0.04-----反应总体积，单位为L；

1000000------g与ug的转换系数；

n------稀释倍数；

194.19-----阿魏酸的摩尔质量；

15------反应时间，单位为min；

m-----样品的量。

实施例4 诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母9944A为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其阿魏酸酯酶的产量。

1、第一轮诱变筛选：

将毕赤酵母9944A接种于YPD平板，30℃培养2-3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁷个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到95%以上，涂布YPD平板，30℃培养48h。

第一轮筛选共获得了422个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种至装有200ulBMGY液体培养基的96孔板，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃ 250rpm振荡培养2 d，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2 d后，离心去除菌体，得到发酵上清液，测定上清液中阿魏酸酯酶的酶活，以出发菌作为对照，筛选出发酵酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的422株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活高于出发菌。其中，389株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余突变菌的酶活甚至比出发菌降低了4-8%。

申请人按照上述方法继续进行了15轮诱变筛选，最终获得一株阿魏酸酯酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为毕赤酵母9944B（Pichia pastoris 9944B）。该突变菌株摇瓶发酵上清液中阿魏酸酯酶酶活力达到22 U/ml，比出发菌提高了120%，取得了意料不到的技术效果。

实施例5 阿魏酸酯酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液，将上述出发菌毕赤酵母9944A和突变菌毕赤酵母9944B发酵上清液进行稀释测定，阿魏酸甲酯底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃条件下进行阿魏酸酯酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，本发明提供的突变菌毕赤酵母9944B发酵上清液中阿魏酸酯酶相对酶活-pH变化曲线与出发菌基本相同，最适作用pH均为4.5-5.5。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH6.0条件下，测定出发菌毕赤酵母9944A和突变菌毕赤酵母9944B发酵上清液的阿魏酸酯酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明提供的突变菌毕赤酵母9944B发酵上清液中阿魏酸酯酶相对酶活-温度变化曲线与出发菌基本相同，最适作用温度均为55℃。

综上所述，与出发菌重组表达的阿魏酸酯酶相比，本发明提供的突变菌毕赤酵母9944B重组表达的阿魏酸酯酶的酶学性质未发生明显的变化。

实施例6 发酵放大

将出发菌和突变菌毕赤酵母9944B分别在20L发酵罐上进行发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1 g/L、磷酸二氢钾5.5 g/L、磷酸二氢铵55 g/L、硫酸钾20.3 g/L、硫酸镁16.4 g/L、氢氧化钾1.65 g/L、消泡剂0.05%。

发酵生产工艺：pH值5.0、温度25℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26 h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60 min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在160 h左右。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

通过测定不同时间发酵液中阿魏酸酯酶活力，可得发酵进程曲线。

结果显示，发酵160 h后，出发菌毕赤酵母9944A最终的发酵酶活为181 U/ml，而突变菌毕赤酵母9944B最终的发酵酶活高达352U/ml，比出发菌提高了94.5%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年6月5日将上述突变菌毕赤酵母9944B（Pichia pastoris9944B）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019434。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母菌株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 260

<212> PRT

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 1

Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp Leu Tyr Thr Arg Leu Val Glu

1 5 10 15

Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro

20 25 30

Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile

35 40 45

Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val

50 55 60

Phe Arg Gly Thr Gly Ser Ala Thr Asn Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val

85 90 95

His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val Ser Val Gln Asp Gln Val Glu

100 105 110

Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr

115 120 125

Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala

130 135 140

Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu

145 150 155 160

Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe

165 170 175

Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr Phe Arg Val Thr His Ala

180 185 190

Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Val Glu Gln Gly Tyr Ala His

195 200 205

Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr

210 215 220

Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly

225 230 235 240

Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly

245 250 255

Ala Cys Thr Trp

260

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 2

gcctctacgc agggcatctc cgaagacctc tacacccgtt tagtcgaaat ggccactatc 60

tcccaagctg cctacgccga cctgtgcaac attccgtcga ctattatcaa gggagagaag 120

atttacaact ctcaaactga catcaacgga tggattctcc gcgacgacag cagtaaagaa 180

atcatcaccg tcttccgtgg cactggcagt gctacgaatc tacaactcga tactaactac 240

accctcaccc ctttcgacac cctaccccag tgcaacggtt gtgaagtaca cggtggatat 300

tatattggat gggtgtccgt ccaggaccaa gtcgagtcgc ttgtcaaaca gcaggttagc 360

cagtatccgg actatgcgct gactgtgacg ggccacagtc tcggagcgtc cctggcagca 420

ctcactgccg cccagctgtc tgcgacatac gacaacatcc gcctgtacac cttcggcgaa 480

ccgcgcagcg gcaatcaggc cttcgcgtcg tacatgaacg atgccttcca agcctcgagc 540

ccagatacga cgcagtattt ccgggtcact catgcgaacg acggcatccc aaacttgccc 600

ccggtggagc aggggtacgc ccatggcggt gtagagtact ggagcgttga tccttacagc 660

gcccagaaca catttgtctg cactggggat gaagtgcagt gctgtgaggc ccagggcgga 720

cagggtgtga ataatgcgca cacgacttat tttgggatga cgagcggagc ctgtacatgg 780

tga 783

Claims

1.一种毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌株携带有用于重组表达阿魏酸酯酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的阿魏酸酯酶，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株是对权利要求3所述的毕赤酵母工程菌株进行紫外诱变后筛选获得的。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2019434。

6.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株在生产阿魏酸酯酶中的应用。

7.权利要求4或5所述的毕赤酵母突变菌株在生产阿魏酸酯酶中的应用。