CN104130951A

CN104130951A - 一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备

Info

Publication number: CN104130951A
Application number: CN201410383350.0A
Authority: CN
Inventors: 陈勇; 张慧玲; 李晓
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备，通过人工合成编码的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列Xyn11Bm，构建重组酵母表达载体pPIC9K-Xyn11Bm，转化宿主细胞毕赤酵母GS115获得重组基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm CGMCC No.9398，并在酵母细胞中表达重组Xyn11Bm基因，进而经过纯化代谢高酶活表达的重组木聚糖酶，对于用于非治疗目的降解木聚糖的应用，具有广泛的应用价值。

Description

一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备

技术领域

本发明涉及生物基因工程及酶工程的技术领域。具体的说，本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备技术领域。

背景技术

木聚糖是由多个吡喃木糖基通过β-1,3或β-1,4木糖苷键连接而成的多聚分子，其支链由乙酰基、L-阿拉伯糖残基、4-甲基-D-葡糖醛酸等取代基构成，是植物半纤维素的主要成分之一（周晨妍, 邬敏辰. 木聚糖酶的酶学特性与分子生物学. 生物技术, 2005, 15(3): 89-92；Biely P. Microbial xylanolytic systems. Trends in Biotechnology, 1985, 3(11): 286-290）。木聚糖的降解需要木聚糖酶的作用，木聚糖水解酶系主要包括主链上的水解酶β-D-1,4内切木聚糖酶（EC 3.2.1.8，简称木聚糖酶）、β-D-1,4外切木糖苷酶和侧链上的水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等，这些酶中，木聚糖酶对木聚糖降解起主要作用（范志恒, 李鹂. 体外模拟消化研究不同来源木聚糖酶对麸皮降解的影响. 饲料广角, 2011, (2): 33-34）。

由于木聚糖酶降解木聚糖纤维的作用，使得木聚糖酶在许多行业领域都有了很重要的应用：在造纸工业上，可以用于漂白纸浆、减少环境污染；在食品行业中，可以用来生产功能性低聚木糖、烘烤食品的发酵处理、酿酒澄清等；在饲料领域上：可以作为饲料添加剂加入饲料，消除饲料里木聚糖的抗营养作用，提高饲料的利用率及营养价值；在能源方面，可以降解木聚糖得到木单糖，进一步用木糖发酵生产燃料乙醇；在医药行业中，木聚糖经木聚糖酶降解的木单糖或二糖可以和其它物质共同使用延缓药物成分的释放。

目前，市售木聚糖酶主要来源于可培养的环境微生物，如白腐真菌、里氏木霉、黑曲霉、类芽孢杆菌等（李天歌, 岳晓禹, 李自刚, 等. 白腐真菌产木聚糖酶降解半纤维素及改善肠道微生态平衡作用. 食品科学, 2013, (17): 313-316；郑丽丽, 盛占武, 韩冰莹, 等. 不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的影响. 生物技术通报, 2013, (12): 146-150；蔡少丽, 杨章萍, 黄建忠. 里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及酶学性质. 食品与发酵工业, 2013, 39(8): 113-118；包怡红, 李雪龙. 木聚糖酶产生菌—类芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究. 中国食品学报, 2008, (2): 36-41）。普遍认为，可培养微生物只占自然界微生物的1％，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的木聚糖酶资源，其中很可能存在高活力的木聚糖酶。反刍动物瘤胃是一个降解植物纤维的高效厌氧发酵罐，存在大量不可培养的微生物，包括细菌、真菌和原虫等。瘤胃微生物通过产生纤维素酶和半纤维素酶来降解植物纤维，并未宿主提供能源。到目前为止，人们对来源于反刍动物瘤胃微生物木聚糖酶基因资源的研究寥寥无几。

Xue（1993）在专利WO93/25671中描述了从瘤胃厌氧真菌Neocallimastix patriciarum中分离木聚糖酶基因以及基因表达的方法，该木聚糖基因在大肠杆菌中表达的水平最高为672U/mg；经截短表达后，其中的一个克隆表达的木聚糖酶活力达到1 229U/mg。Geoffrey et al（1993）则在WO93/25693中记载了从瘤胃厌氧真菌N. patriciarum中分离木聚糖酶基因xynA的过程，在大肠杆菌中表达后，纯化的木聚糖酶比活力达到5 980U/mg。虽然重组木聚糖酶的活力较原始出发菌有较大提高，但要用于工业化生产仍然还有一定距离。

提高外源基因在宿主中的表达的途径之一是对外源基因的密码子进行优化。当外源基因中含有稀有密码子时将严重制约其在宿主中的表达（Sharp P M, Tuohy T M F, Mosurski K R. Codon usage in yeast: Cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expressed genes. Nucleic Acids Research, 1986, 14(13):5125–5143；黄光瑞, 田丽春, 黄生平, 等. 密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达. 湖北大学学报:自然科学版, 2007, 29(3):290–293）。通过对外源基因密码子优化后，大量外源基因在毕赤酵母中得到了高水平表达。如纤维素酶基因优化后酶活性提高1.24倍（Akcapinar G B, Gul O, Sezerman U. Effect of codon optimization on the expression of Trichoderma reesei endoglucanase 1 in Pichia pastoris. Biotechnology Progress, 2011, 27(5):1257-1263）。外切葡聚糖酶基因优化后表达水平提高了17%（李国庆, 范松, 裴建军, 等. 黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达. 南京林业大学学报:自然科学版, 2012, 36(4):84–88）。

目前对密码子的优化主要限于根据毕赤酵母对密码子的偏爱性对密码子进行替换，大部分的密码子优化工具和软件也是基于上述原理而设计的。通过上述方法，一些基因的表达水平得到提高。然而，要使外源基因得到高水平的表达，仅仅依靠上述优化是不够的，更多地考虑了基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点等。而这些在目前的基因优化中并没有得到充分考虑。

发明内容

针对国内外现有已有木聚糖酶及其基因被提纯或克隆技术水平普遍存在木聚糖酶酶活不高的现状，能够提供满足工业生产用基因工程菌木聚糖酶的研究较少，至今还未有稳定的木聚糖酶的基因实现高水平的超量表达。本发明旨在于提供一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备的技术方案，根据酵母对密码子的偏爱性、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点等对来源于反刍动物瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B进行密码子的不断调整和优化，并通过人工合成优化后的核苷酸序列，构建重组酵母表达载体，转化宿主细胞毕赤酵母获得重组菌株，进而经过纯化代谢高酶活表达的重组木聚糖酶，对于用于非治疗目的降解木聚糖的应用，具有广泛的应用价值。

本发明的技术方案：

通过人工合成编码的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列Xyn11Bm，构建重组酵母表达载体pPIC9K-Xyn11Bm，转化宿主细胞毕赤酵母GS115获得重组基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，并在酵母细胞中表达重组Xyn11Bm基因，进而经过纯化代谢高酶活表达的重组木聚糖酶，对于用于非治疗目的降解木聚糖的应用，具有广泛的应用价值。

本发明提供了产木聚糖酶的一种高比活性木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm及其获得该基因工程菌代谢表达产物木聚糖酶的生产方法：

本发明具体提供的能稳定高表达木聚糖酶的基因工程菌编号为GS115/pPIC9K-Xyn11Bm。本发明根据酵母对密码子的偏爱性、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点等，采用人工合成源于瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列Xyn11Bm，通过构建重组酵母表达载体pPIC9K-Xyn11Bm，转化毕赤酵母GS115获得基因工程菌株GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，并进行发酵生产，这是一条提高木聚糖酶的高酶活表达的有效途径。

本发明具体提供了一种产木聚糖酶高比活性木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）CGMCC No. 9398。

本发明还提供了获得这种高比活性木聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）CGMCC No. 9398的生产方法，该方法已具备规模工业化生产能力。

同时，本发明提供了高比活性木聚糖酶的基因工程菌基因序列是一种源于人工合成编码的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列，命名为Xyn11Bm，长度为1014bp，序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供一种能在毕赤酵母中高效表达的产木聚糖酶基因序列SEQ ID NO：1，此序列是在SEQ ID NO：2序列基础上优化而成，所编码的氨基酸密码子可以在巴斯德毕赤酵母中有效表达，该人工合成的DNA共编码337个氨基酸残基，氨基酸残基排列顺序如SEQ ID No.3 所示。

具体地，本发明提供了一种高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株，编号为GS115/pPIC9K-Xyn11Bm。根据酵母对密码子的偏爱性、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点等对来源于反刍动物瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B进行密码子调整和优化，通过人工合成方法获得木聚糖酶基因Xyn11Bm，并将其克隆到表达载体pPIC9K-Xyn11Bm上，获得基因工程菌株GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，经微生物学鉴定，属于高比活性木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm。

本发明提供菌株GS115/pPIC9K-Xyn11Bm已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2014年6月30 日，保藏号是CGMCC No.9398。经微生物学鉴定为巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)。该菌株能在YPD培养基表面生长，菌落呈白色，突起于培养基表面，菌落表面湿润，有油脂光泽。该菌种可在28-32℃及pH 4.5-8.5范围内均可生长。该菌种能表达高比活性木聚糖酶，获得重组木聚糖酶Xyn11Bm的最适反应温度为50℃，最适反应pH 为5.0，比活力为7 780.8U/mg。该酶在pH4.0～10.6之间具有较好的稳定性，耐酸碱性较强。Xyn11Bm可以水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。

同时，本发明提供了一种获得高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株的技术方案。具体的获得高表达木聚糖酶的基因工程菌菌株工艺步骤如下：

（1）根据酵母密码子偏爱性对Xyn11B的密码子进行初步替换。

（2）采用Oligo 6.0分析替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、EcoR I和Not I的切割位点。

（3）采用BioEdit 7.0分析调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA。并计算GC百分比，再根据GC百分比对密码子最进一步调整，使其处于40-50%之间。

（4）采用RNA Structure 3.2对mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列SEQ ID No. 1，并命名为Xyn11Bm。

（5）采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。

（6）构建含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-Xyn11Bm。

（7）将重组载体pPIC9K-Xyn11Bm转化宿主细胞毕赤酵母GS115，获得重组菌株GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，并在酵母细胞中表达重组Xyn11Bm基因。

以及，本发明根据上述提供的获得高比活性木聚糖酶的基因工程菌菌株纯化所表达的木聚糖酶Xyn11Bm。该酶蛋白分子的理论等电点PI 为6.82，分子量为36.7KD。经检测，表达的重组木聚糖酶Xyn11Bm在摇瓶中表达84h时，酶活性达到4874.8 U/mL。经10L发酵罐高密度发酵，超滤浓缩后发酵液酶活性最高可达30838 U/mL，与现有技术记载的水平相比有明显提高。

进一步，本发明还提供能将高效表达的产木聚糖酶基因分泌表达到酵母细胞外的重组表达载体pPIC9K-Xyn11Bm。

本发明所述的获得高比活性木聚糖酶的基因分泌表达到酵母细胞外的重组载体pPIC9K-Xyn11Bm，本发明将合成的Xyn11Bm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K用EcoR I和Not I双酶切，回收纯化酶切产物。纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和限制性内切酶鉴定获得重组表达载体pPIC9K-Xyn11Bm。

本发明还提供高比活性木聚糖酶的基因工程菌的筛选方法。

（1）用无菌牙签挑取单菌落有25ml BMGY培养基的三角瓶中，250rpm，30℃，培养24h，使OD₆₀₀介于3-5。

（2）取上述菌液接种于50ml BMGY培养基的三角瓶中，250rpm，30℃，培养24h，使OD600介于3-5。

（3）将（2）中菌液用20ml离心管中，3000rpm离心10min，离心收集菌体。

（4）弃上清，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为1左右，250rpm，30℃，培养至96h。

（5）每24h添加甲醇，维持终浓度0.5%，并且每12h取5ml样品，于12000rpm离心5min，收集上清和沉淀，并且记录其OD值。

（6）在最佳试验条件下，参照GB/T 23874-2009测定上清液中木聚糖酶的活性。

本发明还提供了一种纯化所表达的葡聚糖酶Xyn11Bm 的方法。

（1）发酵产物经离心后，取6ml上清加入超滤离心管Vivaspin 6中，放入低温高速离心机4℃、12000rpm离心，直到上清超滤浓缩至1ml为止。

（2）浓缩上清经G-75葡聚糖凝胶进行层析纯化，采用部分收集器对洗脱组分进行收集，采用pH5.0的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液作为洗脱液。调节适合的流速，每个收集管处停留1 min，每管取2μl样品采用Infinite M2000于280 nm处测定吸光度，直至OD280回至基线后停止收集。根据OD280值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活力。

纯化后重组木聚糖酶Xyn11Bm的最适反应温度为50℃，最适反应pH 为5.0，比活力为7 780.8U/mg。该酶在pH4.0～10.6之间具有较好的稳定性，耐酸碱性较强。Xyn11Bm可以水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖，具有广泛的应用价值。

本发明具体提供上述优化的厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶用于非治疗目的降解木聚糖的应用。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

（1）本发明提供了一种高比活性木聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm CGMCC No. 9398。

（2）本发明提供了获得基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm CGMCC No. 9398高表达木聚糖酶的生产方法：本发明提供的反刍动物瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化核苷酸序列，长度为1014bp，序列如SEQ ID No.1 所示，命名为Xyn11Bm。该人工合成的DNA共编码337个氨基酸残基，氨基酸残基排列顺序如SEQ ID No.3 所示。该酶蛋白分子的理论等电点PI 为6.82，分子量为36.7KD。经检测，表达的重组木聚糖酶Xyn11Bm在试摇瓶中表达84h时，酶活性达到4 874.8 U/mL。经10L发酵罐高密度发酵，超滤浓缩后发酵液酶活性最高可达30 838 U/mL，与现有技术记载的水平相比有明显提高。

（3）本发明还提供了一种纯化所表达的葡聚糖酶Xyn11Bm 的方法。纯化后重组木聚糖酶Xyn11Bm的最适反应温度为50℃，最适反应pH 为5.0，比活力为7 780.8U/mg。该酶在pH4.0～10.6之间具有较好的稳定性，耐酸碱性较强。Xyn11Bm可以水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。

附图说明

图1显示为瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因的优化前和优化后序列的比较图。

图2显示为不同重组酵母菌株酶活性对比图。

图3显示为重组毕赤酵母PCR鉴定电泳图谱。

图4显示为平板刚果红法鉴定Xyn11Bm-12木聚糖酶活力图。

图5显示为Xyn11Bm-12在摇瓶水平酶活力变化曲线图。

图6显示为 Xyn11Bm-12在10L发酵罐中菌体湿重、干重的变化图。

图7显示为 Xyn11Bm-12培养上清的SDS-PAGE电泳图谱。

图8显示为Xyn11Bm-12在发酵罐水平酶活力和比活力变化曲线图。

图9显示为Xyn11Bm的凝胶过滤层析过程中A₂₈₀的吸光值。

图10显示为Xyn11Bm的最适pH值和pH稳定性。

图11显示为 Xyn11Bm的最适反应温度和温度稳定性。

图12显示为 Xyn11Bm的底物特异性。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

主要试验材料与试剂：分泌型表达载体pPIC9k及其宿主菌毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，大肠杆菌DH5α为本实验室保存；限制性内切酶购自大连TaKaRa公司；培养基购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；木聚糖酶底物均购自Sigma公司；Sephadex G-75购自美国Bio-Rad公司；超滤离心管Vivaspin 6购自Millipore公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

培养基：

（1）YPD液体培养基：50g，加水定容到1000 mL，高压120℃灭菌20 min待用。

（2）YPD固体培养基：65g，加水定容到1000 mL，高压120℃灭菌20 min 待用。

（3）10×YNB：称取13.4g YNB溶于1000mL水中，过滤除菌。

（4）诱导表达培养基BMGY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K₂HPO₄，11.8g/L KH₂PO₄，加水至890mL，高压120℃灭菌20min，然后待温度降至手可握温度以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10^-4g/L)，甘油10mL。

（5）诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K₂HPO₄，11.8g/L KH₂PO₄，加水至890mL，高压120℃灭菌20min，然后待温度降至手可握温度以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素 1mL(4×10^-4g/L)，甲醇5mL。

（6）FM22培养基（g/L）：42.9g KH₂PO4，5.0g (NH₄)₂SO₄，1.0g CaSO₄·2H₂O，14.3g K₂SO₄，11.7g MgSO₄·7H₂O，40.0g甘油。

（7）微量元素溶液PMT4（g/L）：2.0g CuSO₄·5H₂O，0.08g NaI，3.0g MnSO₄·H₂O，0.2g Na₂ MoO₄·2H₂O，0.02g H₃BO₃，0.5g CaSO₄·2H₂O，0.5g CoCl₂，7.0g ZnCl₂，22.0g FeSO₄·7H₂O，0.2g biotin，1mL 浓硫酸，1mL FM22。

所用主要设备：

ECM399型电转化仪（BTX公司）；高速冷冻离心机（Sorvall 公司）；移液器（Eppendorf 公司）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司）；pH仪和PL2002型电子天平（为梅特勒－托利多仪器有限公司）；GeneQuant型核酸蛋白检测仪（Anersham Biosciences公司）；GUJS-10L型全自动发酵罐（镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：高表达木聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm CGMCC No. 9398的优化木聚糖酶基因Xyn11Bm的获得

在GenBank中检索出Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因序列（登录号：AY131336.1），根据下述方法进行密码子的调整和优化：

（1）根据酵母密码子偏爱性对Xyn11B的密码子进行初步替换。

经Jcat软件计算，优化后的核苷酸序列相对优化度（CAI）由0.31提高到0.90，GC含量由44.1%下降到42.2%。优化后的序列进行合成，DNA测序确认合成的序列为1014 bp，优化前后序列比对参见附图1所示。优化后序列与优化前序列的相似性为85.07％。与优化前序列相比，优化后序列中共对121个氨基酸残基的密码子进行了优化，有151个核苷酸被替换。

实施例二：高表达木聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-Xyn11Bm CGMCC No. 9398的构建

将合成的Xyn11Bm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K用EcoR I和Not I双酶切，回收纯化酶切产物。纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和限制性内切酶鉴定获得重组表达载体pPIC9K-Xyn11Bm。采用Sal I对pPIC9K-Xyn11Bm线性化，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化后的菌液涂布在MD平板上，于28～30℃培养48 h。挑选生长正常的菌落进行甲醇利用表型鉴定。对甲醇利用表型正确的克隆通过遗传霉素G418硫酸盐筛选获得含高拷贝目的基因的重组酵母工程菌。通过G418硫酸的筛选，共获得抗4 mg/mL的菌株共有7个。

实施例三：重组Xyn11Bm毕赤酵母木聚糖酶活性初筛

将抗4 mg/mL遗传霉素G418的7个菌株分别接种于含有5 mL BMGY培养基的50 mL试管中，29℃振荡培养24 h后离心用BMMY培养基重悬，每24h加入甲醇使终点浓度保持在0.5％，诱导培养48 h。培养结束后离心收集上清以燕麦木聚糖为底物测定酶活力。

7个菌株的酶活力参见附图2所示。7个抗4 mg/mL遗传霉素G418的菌株都具有木聚糖酶活力，其中最高的是12号（命名为Xyn11Bm-12），为2541U/mL。

实施例四：重组Xyn11Bm毕赤酵母木聚糖酶的验证和分子生物学功能验证

取1 mL菌液4000 rpm离心5 min；弃上清，加入500 μLPBS 悬浮细胞，4000 rpm离心4 min；弃上清，加100 μL TE缓冲液悬浮；将上述悬浊液在沸水中煮10 min，然后-70℃冷冻30 min，最后再沸水煮10 min；3000 rpm离心5 min，上清为酵母染色体DNA溶液。

将获得的上清作为PCR的模板，按毕赤酵母表达载体pPIC9K的序列设计引物5'AOX1(5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')与3'-AOX1 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3') 进行PCR验证。PCR体系为dNTP 2μL、 10×PCR Buffer 2.5μL、5’AOX1 2μL、3’AOX1 2μL、Taq酶 1μL、DNA 2μL、ddH₂O 13.5 μL，总体积 20μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5 min；然后94℃，60 s、65℃，60 s、72℃，60 s运行30 cycle；最后72℃延伸5 min。5 μL样品点于1%琼脂糖胶检测。

由附图3显示，来源于Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因被整合到毕赤酵母GS115的染色体DNA中。

实施例五：重组Xyn11Bm木聚糖酶活性的测定

采用DNS法测定木聚糖酶活力。取适当稀释的酶液200 μL，1.0%的桦木木聚糖400 μL，于50℃反应5~10 min，立即加入1 mL DNS，振荡混匀后于95℃水浴5min显色。冷却后加入3.4 mL去离子水，振荡混匀后于540 nm处测定吸光度。

同时，设置对照样品，即取适当稀释的酶液200 μL，DNS 1 mL，1.0%的桦木木聚糖400 μL，于50℃反应5~10 min后于95℃水浴5min显色。冷却后加入3.4 mL去离子水，振荡混匀后于540 nm处测定吸光度。参照GB/T 23874-2009测定木聚糖酶的活性。

实施例六：Xyn11Bm-12在摇甁水平条件下的表达

将Xyn11Bm-12重组酵母菌种划线接种于YPD固体培养基，29℃培养两天至菌落出现。用无菌牙签挑取单菌落有25mL BMGY培养基的三角瓶中，250rpm，30℃，培养24h。取上述菌液接种于50mL BMGY培养基的三角瓶中，250rpm，30℃，在培养24h；菌液3000rpm离心10min，离心收集菌体。弃上清，用BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀为1左右，250rpm，30℃，培养至96h；每24h添加甲醇，维持终浓度0.5%，并且每12h取5mL样品，于12000rpm离心5min，分别收集上清液。

取20ul上清液加入到含有0.5%桦木木聚糖的琼脂平板的孔学中，37℃过夜培养，然后用0.1%刚果红染色30min，再用1mol/L NaCl脱色30min以定性判断酶活性。取各时间点收集的上清液，按照实施例4的方法测定各时间点样品的酶活性。

平板刚果红法定性判断木聚糖酶活力的结果参见附图4所示。宿主菌毕赤酵母GS115和转化空载体pPIC9K的重组酵母培养上清液均未产生透明圈，而Xyn11Bm-12的培养上清液产生明显的透明圈，表明在摇甁水平添加下，Xyn11Bm-12可表达重组木聚糖酶。

随诱导时间，酶活性的变化曲线参见附图5所示。各时间点样品的酶活性逐渐增加，到诱导后84h时，酶活性达到最大值，为4874.8U/mL。

实施例七：Xyn11Bm-12在10L发酵罐中的高效表达

（1）种子液的准备:从-80℃冰箱中取菌种划线方式接种于YPD固体培养板上，在培养箱中28℃培养2天直到菌落出现；挑取单菌落接种于5mL YPD培养基中30℃震荡培养24h，然后接种于600mL YPD液体培养基中继续培养24h。

（2）发酵罐培养基的准备和酵罐灭菌: 6L FM22培养基高压灭菌后备用。按照自动机械搅拌不锈钢发酵罐（GUJS-10C型）说明书上操作步骤来进行严格的发酵罐罐体及管道的灭菌。

（3）发酵罐扩大培养:菌体生长阶段：在发酵罐中加入6L FM22培养基，用1mol/L的KOH调至pH5.0；加入培养好的种子液。设置发酵罐参数：DO 35%，，通气量1.25vvm，培养温度28℃，罐压0.05MPa，500rpm搅拌培养20h。

添加甘油生长阶段：流加甘油（50%，w/v）的速度15mL/L·h，持续4h，手动控制DO在30-35%之间。培养温度28℃，罐压0.05MPa，pH5.0，有泡沫时，可滴加1-2 滴消泡剂。

诱导阶段：发酵参数设置为800rpm，30℃， pH5.0，60%>OD>35%，通气量为>9 L/min。甲醇流加的初始速度为3.5mL/L·h（含4ml PMT4/L），持续2-5h，使酵母菌适应甲醇碳源。在适应过程中，DO由100%稳定下降至40%（约需1-3h），当DO稳定一定时间后又出现增长时，表明出现甲醇饥饿。当DO达到60%时，可增加甲醇流速。

（4）样品采集与分析:发酵罐试验一共持续6天，每12h取样1次，取样时用酒精灯烧取样口灭菌，而后用10mL离心管接取发酵液，立即放倒-80℃冰箱保存备用。

发酵物湿重、干重和上清蛋白含量的测定：用移液器准确吸取发酵液1mL 20000×g 离心10min，移去上清后称量菌体沉淀质量，即为湿重。将上述盛有菌体沉淀的离心管放入烘箱中，于80℃烘干至恒重即为干重。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定发酵上清液中的蛋白质含量。

SDS-PAGE分析：分别为诱导前、诱导后12、24、36、48、60、72、84和96h的浓缩培养上清进行SDS-PAGE电泳。

酶活性测定：取6mL上清液加入超滤离心管Vivaspin 6中于4℃、12000rpm离心，超滤浓缩至1mL。按照实施例4的方法测定各时间点样品的酶活性。

Xyn11Bm-12工程菌在10L发酵罐中菌体湿重和干重的变化趋势参见附图6所示。随着诱导时间的增加，发酵液的菌体湿重和干重含量都在逐渐增加，并且在诱导96h时发酵液的菌体湿重和干重达到最大值216.70g/L和117.30g/L。

不同时间点样品的SDS-PAGE结果参见附图7所示，随着诱导时间的延长培养上清中分子量介于44.30～29.00 KD有一条蛋白质条带，接近Xyn11Bm酶蛋白的理论分子量。

Xyn11Bm-12工程菌在10L发酵罐中木聚糖酶的活性和比活性参见附图8所示，在诱导96h之前，木聚糖酶活力和比活力都随着随着诱导时间的延长而不断增加，诱导到第96h时浓缩发酵液中重组木聚糖酶的酶活力达到最高为30 838U/mL，比活力达到7780.8U/mg。

实施例八：Xyn11Bm的纯化

取适量充分膨胀的G-75 葡聚糖凝胶装柱，浓缩培养上清液经G-75葡聚糖凝胶进行层析纯化，采用部分收集器对洗脱组分进行收集，采用pH5.0的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液作为洗脱液。调节适合的流速，每个收集管处停留1 min，每管取2μL样品采用Infinite M2000于280 nm处测定吸光度，直至A₂₈₀回至基线后停止收集。根据A₂₈₀值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活力。

参见附图9所示，层析后出现了2个比较大的分离峰。其中木聚糖酶活力均集中在第一个峰中。

实施例九：Xyn11Bm的酶学特性

（1）酶促反应最适pH及酶的pH稳定性

最适pH的测定：取适量纯化后的酶液在50℃下，以桦木木聚糖为底物，分别在pH 2.2、3、4、5、6、7、8、9、10和10.6条件下以桦木木聚糖为底物反应5min，通过测定酶活性判断反应的最适pH。

pH稳定性测定：取适量纯化后的酶液分别在pH值2.2、3、4、5、6、7、8、9、10和10.6的缓冲液中下保持30min后，在最适 pH 和最适温度的条件下以桦木木聚糖为底物测定剩余酶活性。

（2）酶促反应最适温度及酶的热稳定性

最适温度的测定：取适量纯化后的酶液，以pH5.0的缓冲液配制桦木木聚糖，分别于20、30、40、50、60、70、80和90℃反应5min，通过测定酶活性以确定反应的最适温度。

热稳定性测定：取适量纯化后的酶液分别在30、40、50、60、70和80℃下保持30 min后，在最适 pH 和最适温度的条件下以桦木木聚糖为底物测定剩余酶活性。

参见附图10所示，Xyn11Bm的最适反应pH为5.0，并且在pH 6.0~10.6条件下也有比较高的活力，在10.6时相对酶活性为96.95%。Xyn11Bm酶在pH 4.0~8.0的条件下具有较好的稳定性，剩余的活力在80%以上，在更低或更高的pH条件下也有最低40%的剩余酶活，具有较强的耐酸碱性。

参见附图11所示，Xyn11Bm的最适反应温度为50℃。但温度稳定性表明该酶对温度的稳定性较差。

实施例十：Xyn11Bm的底物特异性

取适量纯化后Xyn11Bm酶液，分别以1.0%的大麦β-葡聚糖、地衣多糖、燕麦木聚糖，桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan为底物在最适条件下测定Xyn11Bm的酶活性。

如图12所示，Xyn11Bm可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，不降解地衣多糖和大麦β-葡聚糖却没有任何的降解作用。

SEQ ID NO：1

<110> OrganizationName :新疆农业大学

<120> Title : 一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备

<130> AppFileReference : 高比活性木聚糖酶在毕赤酵母中的整合表达

<213> OrganismName :Pichia pastorisGS115

<400> PreSequenceString :

ACTGTTGCTA AGGCTCAATG GGGTGGTGGT GCTTCTGCTG GTCAAAAGTT GTCTGTTGGT 60

GGTGGTCAAA ACCAACACAA GGGTGTTTCT GATGGTTTCT CTTACGAAAT TTGGTTGGAT 120

AACACTGGTG GTTCTGGTTC TATGACTTTG GGTTCTGGTG CTACTTTCAA GGCTGAATGG 180

AACGCTGCTG TTAACAGAGG TAACTTCTTG GCTAGAAGAG GTTTGGATTT CGGTTCTCAA 240

AAGAAGGCTA CTGATTACTC TTACATTGGT TTGGATTACA CTGCTACTTA CAGACAAACT 300

GCTTCTGCTT CTGGTAACTC TAGATTGTGT GTTTACGGTT GGTTCCAAAA CAGAGGTGTT 360

CAAGGTGTTC CATTGGTTGA ATACTACATT ATTGAAGATT GGGTTGATTG GGTTCCAGAT 420

GCTCAAGGTA AGATGGTTAC TATTGATGGT GCTCAATACA AGATTTTCCA AATGGATCAC 480

ACTGGTCCAA CTATTAACGG TGGTTCTGAA ACTTTCAAGC AATACTTCTC TGTTAGACAA 540

CAAAAGAGAA CTTCTGGTCA CATTACTGTT TCTGATCACT TCAAGGAATG GGCTAAGCAA 600

GGTTGGGGTA TTGGTAACTT GTACGAAGTT GCTTTGAACG CTGAAGGTTG GCAATCTTCT 660

GGTGTTGCTG ATGTTACTTT GTTGGATGTT TACACTACTC CAAAGGGTTC TTCTCCAGCT 720

ACTTCTGCTG CTCCAAGAAC TACCACCAGA ACCACTACTA GAACTAAGTC CTTGCCAACT 780

AACTACAACA AGTGTTCTGC TAGAATTACT GCTCAAGGTT ACAAGTGTTG TTCTGACCCA 840

AACTGTGTTG TTTACTACAC TGACGACGAT GGTACTTGGG GTGTTGAAAA CAACGAATGG 900

AGAGGTTGTG GTGTTGAACA ATGTTCTTCT AAGATTACTT CCCAAGGTTA TAAATGTTGT 960

TCCGATCCTA ACTGTGTCGT CTTCTACACC GATGATGACG GTAAGTGGGG TTAA 1014

<212> Type : DNA

<211> Length : 1014

ACTGTTGCTAAGGCTCAATGGGGTGGTGGTGCTTCTGCTGGTCAAAAGTTGTCTGTTGGTGGTGGTCAAAACCAACACAAGGGTGTTTCTGATGGTTTCTCTTACGAAATTTGGTTGGATAACACTGGTGGTTCTGGTTCTATGACTTTGGGTTCTGGTGCTACTTTCAAGGCTGAATGGAACGCTGCTGTTAACAGAGGTAACTTCTTGGCTAGAAGAGGTTTGGATTTCGGTTCTCAAAAGAAGGCTACTGATTACTCTTACATTGGTTTGGATTACACTGCTACTTACAGACAAACTGCTTCTGCTTCTGGTAACTCTAGATTGTGTGTTTACGGTTGGTTCCAAAACAGAGGTGTTCAAGGTGTTCCATTGGTTGAATACTACATTATTGAAGATTGGGTTGATTGGGTTCCAGATGCTCAAGGTAAGATGGTTACTATTGATGGTGCTCAATACAAGATTTTCCAAATGGATCACACTGGTCCAACTATTAACGGTGGTTCTGAAACTTTCAAGCAATACTTCTCTGTTAGACAACAAAAGAGAACTTCTGGTCACATTACTGTTTCTGATCACTTCAAGGAATGGGCTAAGCAAGGTTGGGGTATTGGTAACTTGTACGAAGTTGCTTTGAACGCTGAAGGTTGGCAATCTTCTGGTGTTGCTGATGTTACTTTGTTGGATGTTTACACTACTCCAAAGGGTTCTTCTCCAGCTACTTCTGCTGCTCCAAGAACTACCACCAGAACCACTACTAGAACTAAGTCCTTGCCAACTAACTACAACAAGTGTTCTGCTAGAATTACTGCTCAAGGTTACAAGTGTTGTTCTGACCCAAACTGTGTTGTTTACTACACTGACGACGATGGTACTTGGGGTGTTGAAAACAACGAATGGAGAGGTTGTGGTGTTGAACAATGTTCTTCTAAGATTACTTCCCAAGGTTATAAATGTTGTTCCGATCCTAACTGTGTCGTCTTCTACACCGATGATGACGGTAAGTGGGGTTAA

SequenceDescription :

SEQ ID NO：2

<110> OrganizationName :新疆农业大学

<130> AppFileReference :Neocallimastix frontalisxylanase (xyn11B) gene

<213> OrganismName :Neocallimastix frontalis

<400> PreSequenceString :

ACTGTTGCTA AGGCCCAATG GGGTGGAGGT GCTTCCGCTG GTCAAAAATT ATCCGTCGGT 60

GGTGGTCAAA ACCAACATAA GGGTGTCTCC GATGGTTTCA GTTATGAAAT CTGGTTAGAT 120

AACACCGGTG GTAGCGGTTC TATGACTCTC GGTAGTGGTG CAACCTTCAA GGCTGAATGG 180

AATGCAGCTG TTAACCGTGG TAACTTCCTT GCCCGTCGTG GTCTTGACTT CGGTTCTCAA 240

AAGAAGGCAA CCGATTACAG CTACATCGGA TTGGATTATA CTGCAACTTA CAGACAAACT 300

GCCAGTGCAA GTGGTAACTC CCGTCTCTGT GTATACGGAT GGTTCCAAAA CCGTGGAGTT 360

CAAGGCGTTC CTTTAGTAGA ATACTACATC ATTGAAGATT GGGTTGACTG GGTTCCAGAT 420

GCACAAGGAA AAATGGTAAC CATCGATGGA GCTCAATATA AGATTTTCCA AATGGATCAC 480

ACTGGTCCAA CTATCAATGG TGGTAGTGAA ACCTTTAAGC AATACTTCAG TGTCCGTCAA 540

CAAAAGAGAA CTTCTGGTCA TATTACTGTC TCAGATCACT TTAAGGAATG GGCTAAGCAA 600

GGTTGGGGTA TTGGTAACCT TTATGAAGTT GCTTTGAACG CCGAAGGTTG GCAAAGTAGT 660

GGTGTTGCTG ATGTCACCTT ATTAGATGTT TACACAACTC CAAAGGGTTC TAGTCCAGCC 720

ACCTCTGCCG CTCCTCGTAC TACTACCCGT ACTACTACTC GTACCAAGTC TCTTCCAACC 780

AATTACAATA AGTGTTCTGC TAGAATTACT GCTCAAGGTT ACAAGTGTTG TAGCGATCCA 840

AATTGTGTTG TTTACTACAC TGATGACGAT GGTACCTGGG GTGTTGAAAA CAATGAATGG 900

CGTGGTTGTG GTGTTGAACA ATGTTCTTCC AAGATCACTT CTCAAGGTTA CAAGTGTTGT 960

AGCGATCCAA ATTGCGTTGT TTTCTACACT GATGACGATG GTAAATGGGG T 1011

<212> Type : DNA

<211> Length : 1011

ACTGTTGCTAAGGCCCAATGGGGTGGAGGTGCTTCCGCTGGTCAAAAATTATCCGTCGGTGGTGGTCAAAACCAACATAAGGGTGTCTCCGATGGTTTCAGTTATGAAATCTGGTTAGATAACACCGGTGGTAGCGGTTCTATGACTCTCGGTAGTGGTGCAACCTTCAAGGCTGAATGGAATGCAGCTGTTAACCGTGGTAACTTCCTTGCCCGTCGTGGTCTTGACTTCGGTTCTCAAAAGAAGGCAACCGATTACAGCTACATCGGATTGGATTATACTGCAACTTACAGACAAACTGCCAGTGCAAGTGGTAACTCCCGTCTCTGTGTATACGGATGGTTCCAAAACCGTGGAGTTCAAGGCGTTCCTTTAGTAGAATACTACATCATTGAAGATTGGGTTGACTGGGTTCCAGATGCACAAGGAAAAATGGTAACCATCGATGGAGCTCAATATAAGATTTTCCAAATGGATCACACTGGTCCAACTATCAATGGTGGTAGTGAAACCTTTAAGCAATACTTCAGTGTCCGTCAACAAAAGAGAACTTCTGGTCATATTACTGTCTCAGATCACTTTAAGGAATGGGCTAAGCAAGGTTGGGGTATTGGTAACCTTTATGAAGTTGCTTTGAACGCCGAAGGTTGGCAAAGTAGTGGTGTTGCTGATGTCACCTTATTAGATGTTTACACAACTCCAAAGGGTTCTAGTCCAGCCACCTCTGCCGCTCCTCGTACTACTACCCGTACTACTACTCGTACCAAGTCTCTTCCAACCAATTACAATAAGTGTTCTGCTAGAATTACTGCTCAAGGTTACAAGTGTTGTAGCGATCCAAATTGTGTTGTTTACTACACTGATGACGATGGTACCTGGGGTGTTGAAAACAATGAATGGCGTGGTTGTGGTGTTGAACAATGTTCTTCCAAGATCACTTCTCAAGGTTACAAGTGTTGTAGCGATCCAAATTGCGTTGTTTTCTACACTGATGACGATGGTAAATGGGGT

SequenceDescription :

SEQ ID NO：3

<110> OrganizationName :新疆农业大学

<211> 337

<212> PRT

<213>Neocallimastix frontalis

<400> PreSequenceString :

Thr Val Ala Lys Ala Gln Trp Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gly Gln

1 5 10 15

Lys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Ser Met Thr Leu Gly Ser Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp

50 55 60

Asn Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu

65 70 75

Asp Phe Gly Ser Gln Lys Lys Ala Thr Asp Tyr Ser Tyr Ile Gly

80 85 90

Leu Asp Tyr Thr Ala Thr Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly

95 100 105

Asn Ser Arg Leu Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val

110 115 120

Gln Gly Val Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val

125 130 135

Asp Trp Val Pro Asp Ala Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly

140 145 150

Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile

155 160 165

Asn Gly Gly Ser Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln

170 175 180

Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr Val Ser Asp His Phe Lys

185 190 195

Glu Trp Ala Lys Gln Gly Trp Gly Ile Gly Asn Leu Tyr Glu Val

200 205 210

Ala Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly Val Ala Asp Val

215 220 225

Thr Leu Leu Asp Val Tyr Thr Thr Pro Lys Gly Ser Ser Pro Ala

230 235 240

Thr Ser Ala Ala Pro Arg Thr Thr Thr Arg Thr Thr Thr Arg Thr

245 250 255

Lys Ser Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Lys Cys Ser Ala Arg Ile Thr

260 265 270

Ala Gln Gly Tyr Lys Cys Cys Ser Asp Pro Asn Cys Val Val Tyr

275 280 285

Tyr Thr Asp Asp Asp Gly Thr Trp Gly Val Glu Asn Asn Glu Trp

290 295 300

Arg Gly Cys Gly Val Glu Gln Cys Ser Ser Lys Ile Thr Ser Gln

305 310 315

Gly Tyr Lys Cys Cys Ser Asp Pro Asn Cys Val Val Phe Tyr Thr

320 325 330

Asp Asp Asp Gly Lys Trp Gly

335

Claims

1.一种高表达木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，该基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm菌种保藏编号为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）CGMCC No. 9398。

2.一种如权利要求1所述高表达木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm的基因序列，其特征在于，所述基因序列是一种源于人工合成编码的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列Xyn11Bm，长度为1014bp，序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种能在毕赤酵母中高效表达的产木聚糖酶基因序列SEQ ID NO：1，此序列是在SEQ ID NO：2序列基础上定点诱变而成，所编码的氨基酸密码子可以在巴斯德毕赤酵母中有效表达，该人工合成的DNA共编码337个氨基酸残基，氨基酸残基排列顺序如SEQ ID No.3 所示。

4.根据权利要求2所述优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11Bm的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9K-Xyn11Bm。

5.一种优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据酵母密码子偏爱性对Xyn11B的密码子进行初步替换；

（2）采用Oligo 6.0分析替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、EcoR I和Not I的切割位点；

（3）采用BioEdit 7.0分析调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA，并计算GC百分比，再根据GC百分比对密码子最进一步调整，使其处于40-50%之间；

（4）采用RNA Structure 3.2对mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列SEQ ID No. 1，并命名为Xyn11Bm；

（5）采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 1所示核苷酸序列；

（6）构建含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-Xyn11Bm；

（7）将重组载体pPIC9K-Xyn11Bm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达；

（8）纯化所表达的木聚糖酶。

6.一种如权利要求5所述获得Neocallimastix frontalis木聚糖酶。

7.权利要求5 所述优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶用于非治疗目的降解木聚糖的应用。