CN113913410B - 一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因工程菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶及其基因工程菌的构建。本发明提供了一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶，并提供了高效表达牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的基因工程菌P.p(xyn‑N.f)，所述基因工程菌培养所产木聚糖酶的酶活性高达500.70IU/mL。与目前已经报道的厌氧真菌或其它木聚糖酶基因工程菌相比，本发明所述的基因工程菌P.p(xyn‑N.f)不仅实现了厌氧真菌木聚糖酶在好氧条件下的表达，而且提高了木聚糖酶的酶活；获得的木聚糖酶具有较宽的pH适用范围，在浆漂白、皮革制造、清洁剂、纺织品防褪色剂、染料、洗涤剂、饲料、生物燃料、脱墨剂等工业中具有重要的研究和应用价值。

Description

一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶及其基因工程菌的 构建。

背景技术

木质纤维素是指包括三大组分(纤维素、半纤维素和木质素)的生物质。木质纤维素广 泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农作物废弃物中。木聚糖是植物半纤维素的主要组 成部分，是具有高度分枝的杂糖，是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源，木聚糖的基本 结构单元是以β-1，4糖苷键或β-1，3糖苷键的多聚木糖链，植物来源不同，木聚糖支链组 成也不同，在D-木糖的第二位氧上连接D-葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸，或在第三位 连接有L-阿拉伯呋喃糖，有些木糖还在第二位或第三位氧上发生乙酰化，支链能进一步被酯 化为酚酸，在细胞壁网状结构中与木聚糖和木质素进行交联。

木聚糖酶系是一类能降解木聚糖的酶系，包括β-1，4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L- 呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酯键酚酸酯酶。其中，β-1，4- 内切木聚糖酶是最关键的酶，它通过水解木聚糖分子的β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡 糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端 来催化释放木糖残基。另外，参与彻底降解木聚糖的还有α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄 糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶以及能降解木聚糖中阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香 豆酸)形成的酯键的酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键， 协同主链水解酶的作用，最终将木聚糖转化为它的组成单糖。木聚糖酶目前已经广泛应用在 生物漂白、去污洗涤、动物饲料、造纸、酿造、食品、纺织、环境、植物及中药提取等工业 中。

迄今为止，利用生物工程技术以大量生产木聚糖酶为主要目的的木聚糖酶基因克隆和表 达已经取得了较大进展，得到了更高活性、更大产率、更完整或具有特殊性质的木聚糖酶。 目前木聚糖酶基因已经被克隆并在大肠杆菌、酵母、乳酸菌和霉菌中获得表达。随着生物技 术的发展，有关木聚糖酶基因的克隆和表达的研究越来越深入，但是由于各种条件如耐热性 差，稳定性差等的限制，而且木聚糖酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白水解酶和糖基化 等问题，因此真正转化为生产实践的基因工程菌还比较少。

瘤胃厌氧真菌可分泌高活性的纤维素酶，其活性甚至优于工业用菌株，但其产量有限， 加之瘤胃真菌厌氧发酵技术尚不完备，影响了瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的大规模工业化应用。 大肠杆菌、酵母和家蚕生物反应器等各种表达系统都能用于木聚糖酶基因的表达，尤其是酵 母表达系能够加工修饰表达产物，背景蛋白少，且能将外源蛋白分泌至胞外，表达量高等优 点使其在生产上具有良好的实际应用价值。通过构建基因工程菌实现瘤胃厌氧真菌木聚糖酶 的大量表达、降低生产成本、提高木聚糖酶耐高温、高湿、高压、极端pH的稳定性是瘤胃 厌氧真菌木聚糖酶得以开发利用的重要途径，也是木聚糖酶工业化生产所急需解决的问题， 值得深入研究。

本发明研究前期，从来自天祝放牧牦牛瘤胃液的1个厌氧真菌和甲烷菌共培养物-(Piro mycesYak TZ+M.ruminantium)里的厌氧真菌PiromycesYak TZ中获得了一种木聚糖酶。所述 牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物(PiromycesYak TZ+M.ruminantium)在厌氧发酵瓶中7 d培养期降解玉米秸秆所产木聚糖酶活性在pH 6.8，39℃达到6905mU/mL，即6.91IU/mL， 而牦牛瘤胃厌氧真菌PiromycesYakTZ在厌氧发酵瓶中7d培养期降解玉米秸秆所产木聚糖酶 活性在pH 6.8，39℃达到6250mU/mL，即6.25IU/mL，进一步通过酶学性质测定，可知厌 氧真菌PiromycesYak TZ在厌氧发酵瓶中7d培养期降解玉米秸秆所产木聚糖酶活性在pH 6.8，55℃达到最高值14.31IU/mL。

本发明首先对厌氧真菌PiromycesYak TZ编码木聚糖酶基因的密码子进行优化后获得了 一种新的木聚糖酶基因，将密码子优化后的新的木聚糖酶基因导入毕赤酵母，构建获得了一 种高效表达木聚糖酶的工程菌P.p(xyn-N.f)，所述工程菌P.p(xyn-N.f)在发酵瓶中培养经甲 醇诱导表达获得了一种新的木聚糖酶；且诱导表达144h获得的木聚糖酶活性在pH 7.0，60℃ 达到酶活稳定性较好的最高值55.95IU/mL；将所述工程菌P.p(xyn-N.f)进一步通过发酵罐 扩大培养经甲醇诱导表达144h获得的木聚糖酶的活性在pH 7.0，60℃达到酶活稳定性较好 的最高值500.70IU/mL。和厌氧真菌PiromycesYak TZ在厌氧发酵瓶7d培养期降解玉米秸 秆所产最高木聚糖酶活性14.31IU/mL相比，不但实现了厌氧真菌PiromycesYak TZ的木聚 糖酶在好氧条件下的表达，而且提高了木聚糖酶的活性500.70IU/mL：14.31IU/mL＝35倍。 工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶不但活性较高，在40-60℃之间能够保持热稳定性，而且 具有比较宽泛的pH适用范围，具备中性和弱碱性木聚糖酶性质，在pH 5.0-9.0之间酶活显 著，在pH值为6.0-8.5之间仍具有80％的酶活力，适合用在纸浆漂白、去污洗涤、动物饲料、 食品、纺织、清洁剂等领域，具有广泛的工业应用价值。

发明内容

本发明公开了一种高效表达厌氧真菌的木聚糖酶的基因工程菌构建方法，属于生物工程 技术领域。本发明通过合成生物学，以木聚糖酶基因序列为基础，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，连入载体pPIC9K；获得的重组质粒pPIC9K -Beta-xylanase转入TOP10克隆菌株，并电转化毕赤酵母表达木聚糖酶基因，以甲醇高效诱 导表达。所重组杂合木聚糖酶基因，有望为木聚糖酶分子改造提高酶转化率投入生产提供新 的思路。针对上述问题，本发明的目的在于提供一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶及其基因工 程菌的构建，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶，所述一种牦牛瘤胃厌氧真菌 木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的基 因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优化密码子后的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖 酶的基因的核苷酸序列如图SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述基因的重组质粒。

第四方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述基因的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述基因的基因工程菌。

优选地，所述基因工程菌为毕赤酵母。

第六方面，本发明提供了一种基因工程菌P.p(xyn-N.f)，所述基因工程菌P.p(xyn-N.f) 于2021年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CG MCC No.22119。

第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的基因工程菌P.p(xyn-N.f)在生产木聚 糖酶中的应用。

第八方面，本发明提供了一种利用上述第六方面所述的基因工程菌P.p(xyn-N.f)生产 获得的木聚糖酶。

第九方面，本发明提供了一种上述第八方面所述的木聚糖酶在降解木质纤维素中的应用。

第十方面，本发明提供了一种上述第一和第八方面所述的木聚糖酶在适合用在纸浆漂白、 去污洗涤、动物饲料、食品、纺织、清洁剂等领域中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明前期研究中获得了放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物(PiromycesYa k TZ+M.ruminantium)，在厌氧发酵瓶中7d培养期内降解玉米秸秆所产木聚糖酶活性在Ph 6.8，39℃达到6905mU/mL，即6.91IU/mL。牦牛瘤胃厌氧真菌PiromycesYakTZ在厌氧 发酵瓶中7d培养期内降解玉米秸秆所产木聚糖酶活性在pH 6.8，39℃达到6250mU/mL， 即6.25IU/mL，通过酶学性质测定可知厌氧真菌PiromycesYak TZ在厌氧发酵瓶中7d培养 期内降解玉米秸秆所产木聚糖酶活性在pH 6.8，55℃达到最高值14.31IU/mL。本发明首次 对来自于天祝放牧牦牛瘤胃液的厌氧真菌PiromycesYak TZ中获得的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚 糖酶进行优化，获得了一种新的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶。

(2)本发明首次对编码牦牛瘤胃厌氧真菌PiromycesYak TZ的木聚糖酶基因的密码子优 化后导入毕赤酵母，获得了一种高效表达木聚糖酶的基因工程菌P.p(xyn-N.f)，工程菌P. p(xyn-N.f)在好氧发酵瓶中培养经甲醇诱导表达144h获得的木聚糖酶活性在pH7.0，60℃ 达到酶活稳定性较好的最高值55.95IU/mL。和厌氧真菌PiromycesYak TZ在厌氧发酵瓶中7 d培养期内降解玉米秸秆所产最高木聚糖酶活性14.31IU/mL相比，不但实现了厌氧真菌Pir omycesYak TZ的木聚糖酶在好氧条件下的表达，而且提高了木聚糖酶的活性55.95：14.31＝3. 91倍。

(3)进一步将工程菌P.p(xyn-N.f)通过在15L好氧发酵罐扩大培养经甲醇诱导表达14 4h获得的木聚糖酶在pH 7.0，60℃达到酶活稳定性较好的最高值500.70IU/mL。和厌氧真 菌PiromycesYak TZ在厌氧发酵瓶中在7d培养期内降解玉米秸秆所产最高木聚糖酶活性14. 31IU/mL相比，不但实现了厌氧真菌PiromycesYak TZ的木聚糖酶在好氧条件下的表达，而 且提高了木聚糖酶的活性500.7：14.31＝35倍。

(4)本发明所述的基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产的木聚糖酶具备中性和弱碱性木聚糖 酶的性质，具有较宽泛的pH适用范围，其在pH 5.0-9.0之间酶活性显著，在pH值为6.0-8. 5之间时仍具有80％的酶活力，适合于在纸浆漂白、去污洗涤、动物饲料、食品、纺织、制 浆造纸、清洁剂等领域中的应用，具有广泛的工业应用价值。

(5)本发明以毕赤酵母为宿主的表达系统的研究技术成熟稳定，毕赤酵母表达系统可对 蛋白质进行翻译后加工，表达效率高，产物可分泌至细胞外的培养基，且适于高密度发酵， 在实际生产中有利于实现木聚糖酶规模化生产。本发明通过分子技术获得产木聚糖酶的重组 毕赤酵母菌株，该菌株可以用甲醇替代葡萄糖作为碳源，构建技术操作简单，生产成本低， 构建的基因工程菌表达分泌木聚糖酶高效稳定，而且菌体和发酵液容易分离，能够为工农畜 牧业生产木聚糖酶提供新的有力的技术支持。

附图说明

图1重组质粒双酶切鉴定结果图；

图2毕赤酵母转化子PCR检测电泳图谱；

图3富集纯化蛋白SDS-PAGE电泳检测图；

图4毕赤酵母菌株诱导后蛋白表达Western Blotting鉴定分析；

图5厌氧真菌PiromycesYak TZ和工程菌P.p(xyn-N.f)酶活对照；

图6基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的最适温度(60℃)；

图7基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的热稳定性(40-60℃)；

图8基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的最适pH(7.0)；

图9基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的pH稳定性(5.0-9.0)；

图10金属离子对基因工程菌P.p(xyn-N.f)产木聚糖酶活性影响结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的 实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明 保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本实验所 用大肠杆菌TOP10由南京集思慧远生物科技有限公司提供，毕赤酵母GS115菌株购自Life 公司。LB、YPD、BMGY、BMMY等培养基均使用商品化产品，购自南京集思慧远生物科 技有限公司。限制性内切酶购自NEB公司。

下述实施例中所使用的培养基如下：

LB培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％(固体用)、NaOH调pH至7.0；

YPD培养基(工程菌最基本的培养用)：胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2％(过 滤除菌)、琼脂粉1.5％(固体用)；

BMGY培养基(工程菌诱导表达前培养用)：取10g酵母抽提物，20g蛋白胨，溶于700mL去离子水中高压灭菌20min，冷却至室温，加入100mL 10×YNB，2mL 500×B，10 0mL 10×GY，100mL 1mol磷酸钾(pH6.0)，4℃保存备用；

BMMY培养基(工程菌诱导表达用)：取10g酵母抽提物，20g蛋白胨，溶于700mL 去离子水中高压灭菌20min，冷却至室温，加入100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×M，100mL1mol磷酸钾(pH6.0)，4℃保存备用。

10×YNB(13.4％酵母基本氮源，无氨基酸含硫酸铵)：将13.4g YNB溶于100mL去离子水中，过滤除菌，4℃保存备用。500×B(0.02％Biotin，生物素)：将200mg生物素溶于100mL去离子水中，过滤除菌，4℃保存备用。10×M(5％Methanol，甲醇)：将5mL甲醇 与95mL去离子水中，过滤除菌，4℃保存备用。10×GY(10％Glycerol，甘油)：将100mL 甘油于900mL去离子水中，过滤除菌或高压灭菌15min，4℃保存备用。

实施例1厌氧真菌总RNA的提取和目的基因克隆

本实验样本采集自甘肃省天祝县放牧牦牛瘤胃液中分离出的厌氧真菌PiromycesYak TZ， 39℃培养4d的菌液离心后，菌体沉淀经液氮研磨后，使用总RNA提取试剂盒(天根，DP4 19)提取PiromycesYak TZ的总RNA，质检合格后使用逆转录试剂盒

III 1st Stran d cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(诺唯赞，R312-01)逆转录合成cDNA，作为模板。 进一步设计引物进行扩增木聚糖酶基因。实验操作均严格按照上述试剂盒产品说明书进行。

为了获得木聚糖酶的全长CDS序列，根据厌氧真菌PiromycesYak TZ序列，设计引物： F:ATGACTGTTGCTAAGGCCCAAT；R：TTATTTACCCCACTTACCGTCGT，由安徽通用 生物合成。使用LA Taq酶进行PCR扩增。扩增体系：cDNA 1μL，10×LA PCR Buffer(含 Mg²⁺)5μL，dNTP 4μL，LA Taq 0.3μL，引物F和R各2μL，加ddH₂O补足至50μL。 反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min 30s，共 30个循环；72℃延伸10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，有条带的样品使用爱思 进生物技术(杭州)有限公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行产物纯化回收。纯化后 的DNA产物被连接到

克隆载体上，并转化进入大肠杆菌Trans1-T1感受态中， 进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆扩摇，PCR扩增验证后，送南京集思慧远生物科技有限公 司测序验证。由PCR扩增产物的测序结果可知，获得的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶xyn基因 序列共计972bp，其中前17个氨基酸为信号肽，去除信号肽后，共计918bp，基因序列(划 线部分为信号肽序列)：ATGTTGTACACAACACTCCTT TCCGTGGTCTTGACGCTCAGTGGCGCTGTTGCCTCTCCTATCGAGGAGAGACAGTCCTCATCCCTGAACACCAAGCTCAA GGCTCATGGTAAGAAGTACTGGGGTACTGCTACTGATCAGGGTACTCTGTCCAAATCC GGCATGTCATCATTCCTGCCAACACAGTTCGGCCAAGTCACTCCTGAAAACTCCATGAA ATGGGATGCCACTGAGCCTTCACGCGGCCAGTTCAACTTTGCAGGCGCAGACTACCTG GTCAACTACGCCCAGCAGCACGGCCTGTTGATTCGCGGCCACAACCTCCTCTGGCACTC ACAGCTGCCATCTTGGGTGTCGTCCATCACCGATAAGAATACCTTGACGTCGGTCTTGC AGAACCACATTGCCAACGTTGCGGGCCGTTATAAGGGAAAGCTTTACGCCTGGGATGT TGTCAATGAGATTTTCAATGAAGATGGAACTCTCCGTCAGTCAGTCTTCTACAACGTTC TCGGCGAGGACTTTGTTCGCATCGCTTTCCAGGCCGCAAAGTCTGCCGACCCTACCGCG AAGCTGTACATCAATGACTACAACCTTGACGACCCGAACTATGCCAAGACCAAGGGCA TGATCTCTTATGTCCAGAAGTGGCGCTCTCAAGGCATCCCTATTGACGGAATCGGCTCC CAGGGCCATCTTTCTGCTGGTGGAGGATCCAAGAACGCCGCTGCTCTCAAGGCGCTGT CCGCTGCTGCTCCAGAGGTCGCCCTTACTGAACTCGATATTGCCTCCGCTCCCTCCGCA GACTACGTCGCGGTCGTTCAGGGATGCCTTGCAGTGTCGAACTGTGTGGGTATTACAAC CTGGGGTGTTCGCGATGTCGATTCTTGGAGAGCTTCTTCGAACCCGCTCCTCTTTGACG CCAACTACCAGCCAAAGGCTGCATACAACGCTGTTATCTCCGCATTGTAG(去除信号肽 后的基因序列如SEQ ID NO.2所示)。与NCBI数据库中的MTYH01000140.1相似度最为 接近，为97.55％。

对上述基因序列通过生信分析，去掉信号肽，并对剩余目标序列进行密码子优化后，合 成目标基因。优化后的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶xyn基因序列与原始序列相似性为78.43％， 共对156个氨基酸进行密码子优化，共计有175个碱基被替换，优化后的牦牛瘤胃厌氧真菌 木聚糖酶xyn基因序列(密码子优化的碱基加下划线注释)：TCCCCAATCGAAGAAAGACA GTCCTCCTCATTGAACACCAAGTTGAAGGCTCACGGTAAGAAGTACTGGGGTACTGCTA CTGACCAAGGTACTTTGTCTAAGTCCGGTATGTCCTCCTTCCTGCCAACTCAATTCGGTC AAGTTACTCCAGAGAACTCCATGAAGTGGGACGCTACTGAACCATCCAGAGGTCAATT CAACTTCGCTGGTGCTGACTACTTGGTTAACTACGCTCAACAGCACGGTCTGTTGATCA GAGGTCATAACTTGTTGTGGCACTCCCAATTGCCATCCTGGGTTTCTTCCATCACCGACA AGAACACTTTGACCTCCGTCCTGCAAAACCACATTGCTAACGTTGCCGGTAGATACAAGGGTAAGCTGTACGCTTGGGACGTTGTCAACGAGATTTTCAACGAGGACGGTACTTTGAG ACAGTCCGTGTTCTACAACGTCCTTGGTGAGGACTTCGTTAGAATCGCTTTCCAAGCTG CTAAGTCTGCTGACCCTACTGCCAAGTTGTACATCAACGATTACAACCTGGACGACCCA AACTACGCTAAGACCAAGGGTATGATCTCCTACGTTCAAAAGTGGCGTTCCCAGGGTAT TCCAATTGACGGTATTGGTTCCCAAGGTCACTTGTCTGCTGGTGGTGGTTCTAAGAATG CTGCTGCTTTGAAGGCTTTGTCCGCTGCTGCTCCAGAAGTTGCTTTGACTGAATTGGAC ATTGCTTCCGCTCCATCCGCTGATTACGTTGCTGTTGTTCAAGGTTGTCTGGCCGTTTCC AACTGTGTTGGTATTACTACCTGGGGTGTCCGTGATGTTGATTCTTGGAGAGCTTCTTCT AACCCATTGCTGTTCGACGCTAACTACCAACCTAAGGCTGCTTACAACGCTGTTATCTCC GCTTTG(基因序列如SEQ ID NO.3所示)。

优化后的序列在NCBI数据库中无相似序列；上述牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因表达 的木聚糖酶蛋白序列(划线部分为信号肽序列)：MLYTTLLSVVLTLSGAVASPIEERQSSSLNTKLKAHGKKYWGTATDQGTLSKSGMSSFLPTQFGQVTPENSMKWDATEPSRGQFNFAG ADYLVNYAQQHGLLIRGHNLLWHSQLPSWVSSITDKNTLTSVLQNHIANVAGRYKGKLY AWDVNEIFNEDGTLRQSVFYNVLGEDFVRIAFQAAKSADPTAKLYINDYNLDDPNYAKTK GMISYVQKWRSQGIPIDGIGSQGHLSAGGGSKNAAALKALSAAAPEVALTELDIASAPSAD YVAVVQGCLAVSNCVGITTWGVRDVDSWRASSNPLLFDANYQPKAAYNAVISAL(去信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

实施例2重组质粒pPIC9K-xyn的构建

上步合成的目标基因通过限制性内切酶酶切后连接到表达载体pPIC9K上，用以获得重 组质粒pPIC9K-Beta-xylanase，步骤如下：

1.提取质粒pPIC9K

取pPIC9K的E.coli Top10单菌落，在3mL终浓度为50mg/L(卡那霉素)的LB液体 培养基中培养过夜。12000r/min离心1min，收集菌体质粒提取试剂盒提取。具体步骤：

(1)向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，弃掉收集管废液，将CP3放回收集管；(2)菌液12000r/min离心1min，去上清；(3)向菌体沉淀加250μL溶液P1，使用移液 器悬浮菌体；(4)向离心管中加入250μL溶液P2，轻轻翻转8次使菌体充分裂解；(5)向 离心管中加入350μL溶液P3，轻轻翻转8次混匀，将出现白色絮状沉淀，12000r/min离 心10min；(6)收上清液移到CP3中，12000r/min离心30s，倒掉管中废液，将CP3放入 收集管中；(7)向CP3中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉管中废液， 将CP3放入收集管中；(8)重复操作步骤(7)；(9)将CP3放入收集管，12000r/min离心2 min去除吸附柱中残余漂洗液；(10)将CP3置于干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中 央滴加50μL洗脱缓冲液EB，放置2min，12000r/min离心2min将质粒收集到离心管中。

取提取的质粒3μL，通过1％的琼脂糖凝胶进行检测，切胶回收含有卡那霉素筛选标记 的目的质粒pPIC9K。

2.xyn基因与质粒同时双酶切并回收纯化

纯化回收上述实施例一中经密码子优化的牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶xyn基因与质粒pP IC9K同时经EcoR I(GAATTC)和Not I(GCGGCCGC)进行双酶切，37℃酶切30min， 双酶切体系(xyn/pPIC9K，3μL；EcoR I，0.25μL；Not I，0.25μL；10×Buffer，1μL；d dH₂O，5.5μL；总量10μL)，将酶切的片段分别胶回收，目的片段胶回收步骤：

(1)切取琼脂糖凝胶中双酶切后的片段xyn、质粒pPIC9K放入1.5mL离心管中；(2)加入500μL溶液GSB，于55℃水浴溶胶10min，间断2-3min混合，当胶完全融化后，观 察溶液的颜色，如为紫色，加入适量的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，调整颜色和GSB颜色相同 (黄色)；(3)待凝胶溶液降至室温，加入离心柱中静置1min，10000r/min离心1min， 弃流出液；(4)加入650μL溶液WB，10000r/min离心1min，弃流出液；(5)10000r/m in离心2min，去除残留的WB；(6)将离心柱置于干净的离心管中，开盖静置1min，使乙 醇挥发干净，在柱中央加入30μL EB或去离子水(pH＞7.0)，室温静置1min；(7)10000 r/min离心1min，洗脱DNA，将洗脱出的DNA置于-20℃保存。

取酶切前和胶回收的目的片段各3μL，通过1％的琼脂糖凝胶进行检测(酶切前的一起 检测进行对比)。

3.xyn基因与pPIC9K的连接

将酶切后xyn基因与pPIC9K，经T4连接酶22℃连接10h，连接反应体系(pPIC9K，1 μL；xyn，7μL；T₄ DNA Ligase，1μL；10×Ligase buffer，1μL；总量10μL)。

将xyn基因连入载体pPIC9K的EcoRI(GAATTC)-NotI(GCGGCCGC)位点之间，获 得的重组质粒转入TOP10克隆菌株；挑取阳性克隆子测序。

4.将连接产物转化E.coli DH5α

(1)将100μL大肠杆菌TOP10加入连接产物中，轻轻混匀后冰浴30min；(2)42℃热激90s，冰浴3min；(3)在1.5mL离心管中加入890μL的无抗生素LB液体培养基，37℃ 振荡培养1h，5000r/min，离心2min；(4)弃上清，混匀后加入用无菌L棒涂布于含卡那 霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。37℃培养12-16h。

5.挑取阳性转化子鉴定

取1.5mL离心管，都加入卡那霉素(50mg/L)的LB溶液3mL，然后用镊子夹取最 小的枪头在过夜的培养皿上挑取单个菌落，将挑菌的枪头直接丢入离心管中，将10个离心管 放入37℃，220r/min培养箱过夜培养。将菌液进行PCR鉴定，提取测序正确的菌株中的重 组载体质粒，进行双酶切鉴定。

6.菌液PCR及双酶切验证

设置实验组和对照组，实验组模板为上述培养好的菌液，对照组模板为ddH₂O，PCR扩 增条件(菌液，2μL；xyn-F，1μL；xyn-R，1μL；Taq酶，12.5μL；ddH₂O，8.5μL；总 量，25μL)，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。实验组以xyn-F/R为引物，重组质粒菌液 为模板，进行菌液PCR鉴定。取扩增产物3μL，通过1％琼脂糖凝胶进行检测。实验组可以 扩出目的条带。

分别用NotⅠ和EcoRⅠ内切酶同时酶切重组质粒pPIC9K::xyn和pPIC9K空质粒，如图1 所示，其中，M为DL12000分子质量标准；1为pPIC9K::xyn质粒；2为重组载体双酶切。 结果表明，重组载体pPIC9K-Beta-xylanase大小为10212bp，pPIC9K::xyn质粒经EcoRI-Not I双酶切后产生9268bp和944bp大小的两个片段。将该质粒送至金唯智公司测序后，结果 表明该pPIC9K::xyn重组质粒构建成功，目标基因已经成功构建到载体pPIC9K上。

实施例3重组质粒电转化毕赤酵母GS115

1.毕赤酵母感受态细胞的制备

-80℃取毕赤酵母GS115板子划线30℃培养2d。

(1)挑取单菌落于在5mLYPD养基(无抗)中，30℃，220r/min培养2d；(2)将菌 液加入按1：100加入YPD培养基中，30℃，220r/min培养；(3)检测菌液OD_600nm为1.3 时，将锥形瓶在冰上放置30min；(4)冰浴后轻摇锥形瓶，将菌体倒入50mL灭菌的离心 管中，4℃，5000r/min离心10min；(5)去除上清，将50mL离心管置于冰上，取10m L预冷的无菌水悬浮菌体，加无菌水至50mL；(6)去除上清，预冷的无菌水洗涤菌体2遍； (7)收集沉淀，用25mL预冷的山梨醇溶液重悬，于4℃进行5000r/min离心10min，收 集菌体；(8)向离心管中加入4mL冰上预冷山梨醇溶液，用灭菌的1.5mL离心管分装， 每管100μL，-70℃保存。

2.重组质粒电转毕赤酵母

(1)线性化体系：10×Buffer O，40μL；SacI 20μL；质粒20μg；加ddH₂O补足至320 μL。37℃消化3h；(2)冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL酵母感受态 细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。 电击条件为：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间为4-10msec；(3)电击完 成后，将650μL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹 打溶液均匀；(4)把电转杯中的全部液体转移到新的2mL EP管中，30℃静置培养2h；(5) 低速离心收集菌体，涂布于MD平板上，30℃恒温培养3-4d。

3.PCR鉴定阳性克隆菌株。

用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃， 180r/min过夜培养。挑选10株克隆，使用载体上引物PCR鉴定，提全基因组后采用PCR扩增方法筛选阳性克隆子。PCR反应及温度参照重组pPIC9K::xyn菌液PCR体系及温度体系。

4.测序结果

结果如图2所示，其中，M：DNA标准品从下到上100、250、500、750、1000、2000 bp；1-10：阳性菌株；PC：阳性对照(质粒)；NC：阴性对照；通过PCR和测序验证，目的 质粒已经成功转化到酵母GS115中，琼脂糖凝胶电泳结果表明10株克隆菌株全部阳性。最 终选择3株阳性菌株-3#、6#、8#进行蛋白表达验证，序列一致。

实施例4目的蛋白的诱导表达及鉴定

1.木聚糖酶蛋白的诱导表达与纯化

取鉴定的阳性菌株3#、6#、8#，50μL接入装有10mL BMGY的锥形瓶中，30℃，22 0r/min过夜培养，摇至OD_600nm＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心 5min，收集细胞，去除上清，用10mL BMMY重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养 基中取样1mL，并加甲醇至终浓度0.5％(v/v)继续诱导；以下各时间点0、24、48、72、9 6、120、144h样品10000r/min离心2min收集培养基上清。培养基上清加入上样缓冲液混 合重悬后置于-20℃待测。

通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白。首先，利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min 流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。然后用N i-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线。再用Ni-IDA W ashing-Buffer(20mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗， 至流出液OD_280nm值到达基线。最后用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪 唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。收集的蛋白溶液使用PBS进行透析过夜后，进行SDS-PAGE分析。

2.SDS-PAGE电泳

(1)按表1所示配方制胶：迅速吹打混匀后，将8mL分离胶加入到两玻璃板中间的缝隙中，再轻轻加入蒸馏水压线，并排出两玻璃板之间的气泡，静置30min后，倾斜观察分离胶是否凝固，待分离胶凝固后，将上层的蒸馏水倒掉，在小烧杯中配制5％浓缩胶，用枪迅速吹打混匀后，将浓缩胶加满两玻璃板之间的缝隙，并排尽玻璃板之间的气泡，插入1.0mm 的梳子，静置30min后，观察浓缩胶是否凝固；(2)处理样品：分别取空质粒的上清，菌 液，重组质粒的上清和菌液分别各1mL与2×SDS Loading Buffer与样品混匀，在沸水中煮 沸10min，冷却后12000r/min离心5min，取上清跑胶；(3)SDS-PAGE电泳：首先将配 制好的胶在80V电压下进行预电泳30min，电泳后将处理好的诱导前、诱导后及纯化后上 清液样品各取30μL加入孔中，先用100V电压电泳，使样品条带跑至分离胶与浓缩胶交界 处时，将电压调节为120V，待条带跑至最边沿时停止电泳；(4)染色及脱色：将跑好的胶 慢慢从玻璃板上取下，放入考马斯亮蓝染色液中染色5h，将染色好的胶取出，用水冲洗后 放入脱色液中进行脱色，直至胶上呈现清晰条带。

表1制胶配方

3.Western Blotting鉴定分析

(1)取上述样品上清上样20μL；(2)上样完毕后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；(3)电泳结束后，取下凝胶进行转 膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA；(4)电转结束后，取下膜后先用PBST溶 液洗涤4次，每次5min；(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；(6)用封闭 液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜；(7)次日将膜取出后用PBST溶液洗膜4次，每次 5min；(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h；(9)反应完毕后， 把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；(10)增强化学发光法(ECL)显影， 曝光。

表2一抗以及二抗稀释比例

编号	抗体名称	稀释比例	二抗名称	稀释比例
					1	His	1:2000	羊抗鼠	1:10000

经SDS-PAGE和Western Blotting分析，3#、6#、8#阳性菌株的分泌上清液中均检测到 目的蛋白，结果如图3；其中，M：Marker；1：未诱导菌株分泌上清纯化蛋白；2：3#阳性菌株培养72h分泌上清纯化蛋白；3：6#阳性菌株培养72h分泌上清纯化蛋白；4：8#阳性菌株 培养72h分泌上清纯化蛋白；以上检测到阳性菌株均分泌有蛋白分子量约29.7KDa。毕赤 酵母菌株诱导后蛋白表达Western Blotting鉴定分析结果如图4所示；其中，M：Marker；1：GS115菌株培养72h分泌上清；2：3#阳性菌株培养72h分泌上清；3：3#阳性菌株培养9 6h分泌上清；4：6#阳性菌株培养72h分泌上清；5：6#阳性菌株培养96h分泌上清；6： 8#阳性菌株培养72h分泌上清；7：8#阳性菌株培养96h分泌上清；8：His蛋白；以上检测 到2-8泳道均有大小约为29.7KDa的蛋白；其中3#阳性菌株表达量最高，3#阳性克隆菌株 即为基因工程菌GS115/pPIC9K::xyn，命名为P.p(xyn-N.f)，属于一种厌氧真菌的木聚糖酶 基因在毕赤酵母中高效表达的基因工程菌，于2021年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22119；保藏地址为：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号；联系电话：010-64807355。

实施例5工程菌P.p(xyn-N.f)在15L发酵罐中的高效表达

随着诱导时间的延长，发酵物湿重和干重含量逐渐增加，在诱导144h时菌体湿重和干重 达到最大值，分别为230.7g/L和129.5g/L，之后逐渐下降。到发酵结束时，菌体湿重和干 重为180.0g/L和87.1g/L。随着诱导时间的延长，木聚糖酶活性不断增加，在诱导第144 h时发酵液的酶活性最高为500.70IU/mL，之后逐渐下降。持续诱导144h，根据培养基溶氧量调整甲醇的流加速度。在发酵过程中每12h取10mL样品用于测定酶活性、菌体湿重 和干重。

实施例6木聚糖酶酶学特性检测

1.木糖标准曲线制作

采用DNS定糖法测定木聚糖酶(Xylanase)的活力。制作木糖标准曲线，配置木糖标准 溶液。

具体操作：称取100mg木糖，加蒸馏水定容至100mL，得到1mg/mL木糖标准溶液， 取6只带刻度试管分别按如下表3进行操作，依次混匀后沸水浴10min，立即用流水冷却加 蒸馏水定容至25mL，用空白管调零后，在吸光值540nm处测OD值。1min底物被酶解 产生1μmol木糖所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。以吸光度为纵坐标，木糖浓度为横 坐标，绘制标准曲线。

表3试剂加入顺序

木糖标准曲线的用Excel软件根据所测得的数据，其拟合议程为y＝0.9520x-0.0110，标 准曲线的线性相关系数R²＝0.9996，符合良好的标准曲线线性关系，可用于后续酶活力的计算。

2.DNS法测定重组木聚糖酶活力

试验组取上述实施例5中分别经1％(v/v)甲醇诱导12、24、48、72、96、120、144h后的诱导液的上清液0.5mL、0.5mL 1％木聚糖底物和醋酸-醋酸钠缓冲液1.0mL(pH7.0)于 带刻度的试管中，分别在不同温度下水浴1h，取出迅速加入3mL DNS，煮沸10min，冷 却后加蒸馏水定容至25mL，OD_540nm测定重组酶的吸光度。同时取煮沸灭活的诱导液的上清 测OD_540nm作为对照组并扣除本底。

厌氧真菌PiromycesYakTZ在厌氧条件下分别降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆，其中 在7d培养期内降解玉米秸秆所产木聚糖酶在pH6.8，55℃达到最高活性14.31IU/mL。本发 明所述的基因工程菌3#、6#和8#阳性菌株在好氧发酵瓶中经1％(v/v)甲醇在12、24、48、7 2、96、120、144h诱导表达可知：3#阳性菌株—即命名为P.p(xyn-N.f)的基因工程菌在好 氧发酵瓶中经1.0％(v/v)甲醇诱导发酵144h时所产木聚糖酶活性在pH7.0，60℃达到酶活稳 定性较好的最高值55.95IU/mL。基因工程菌P.p(xyn-N.f)进一步在15L发酵罐中经甲醇诱 导144h表达后获得的木聚糖酶活性在pH7.0，60℃达到酶活稳定性较好的最高值500.70IU /mL。相比之下，本发明专利构建的基因工程菌P.p(xyn-N.f)不但实现了厌氧真菌的木聚糖 酶在好氧条件下的表达，而且将所分泌表达的木聚糖酶活性提高了500.7：14.31＝35倍，实 现了厌氧真菌的木聚糖酶基因在好氧条件下的高效表达，结果如图5所示。

3.测定不同温度的重组木聚糖酶活力和稳定性

测定在pH7.0，0-100℃，基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶活性。结果如图6和图 7所示，该基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的最适反应温度为40-60℃，此温度范围能 够保持80％以上的酶活力。最适反应温度为60℃，且60℃的热稳定性最佳。

4.测定不同pH的重组木聚糖酶活力和稳定性

测定在60℃，pH2.0-10.0条件下基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶活性。结果如图 8和图9所示，该基因工程菌P.p(xyn-N.f)所产木聚糖酶的最适反应pH值为5.0-9.0，此pH 范围内酶活力显著。pH值为6.0-8.5之间能够保持80％以上的酶活力。最适反应pH值为7.0， 具备中性和弱碱性木聚糖酶的性质。

5.测定不同金属离子对木聚糖酶活力影响

将KCl、BaCl₂、ZnSO₄、FeSO₄、CuSO₄、MnSO₄、COCl₂、HgCl₂、MgCl₂溶液与适当稀 释后酶液混合，使金属离子的终浓度为5mmol/L。pH7.0，60℃下水浴4h，以未加金属离 子的不灭活酶液测定的值设定为100％。结果如图9所示，Mn²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、K⁺、Zn²⁺使基 因工程菌P.p(eg-N.f)所产内切葡聚糖酶的活性降低29％以上，而Ba²⁺、Co²⁺对基因工程菌P. p(xyn-N.f)所产内切葡聚糖酶的活性无明显影响，Mg²⁺、Cu²⁺对基因工程菌P.p(xyn-N.f) 所产木聚糖酶的活性有提高作用。

通过以上实施例和结果可以看到，以来自天祝放牧牦牛瘤胃液的厌氧真菌PiromycesYak TZ的总DNA为模板，构建出重组质粒pPIC9K::xyn在毕赤酵母中分泌表达中性和弱碱性高 活性木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K::xyn，即P.p(xyn-N.f)，在好氧条件下具有良好 的应用价值。本发明提供的基因工程菌具有培养条件方便，提取工艺简单，构建方法效果明 显，分泌表达蛋白含量高，所产木聚糖酶具备中性和弱碱性木聚糖酶的性质，pH的适用范围 较广等优点，将进一步满足木聚糖酶在工农业生产中的实际广泛应用。

序列表

<110> 甘肃省科学院生物研究所

<120> 一种牦牛瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因工程菌的构建及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Pro Ile Glu Glu Arg Gln Ser Ser Ser Leu Asn Thr Lys Leu Lys

1 5 10 15

Ala His Gly Lys Lys Tyr Trp Gly Thr Ala Thr Asp Gln Gly Thr Leu

20 25 30

Ser Lys Ser Gly Met Ser Ser Phe Leu Pro Thr Gln Phe Gly Gln Val

35 40 45

Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Arg Gly

50 55 60

Gln Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu Val Asn Tyr Ala Gln Gln

65 70 75 80

His Gly Leu Leu Ile Arg Gly His Asn Leu Leu Trp His Ser Gln Leu

85 90 95

Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn Thr Leu Thr Ser Val

100 105 110

Leu Gln Asn His Ile Ala Asn Val Ala Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Leu

115 120 125

Tyr Ala Trp Asp Val Asn Glu Ile Phe Asn Glu Asp Gly Thr Leu Arg

130 135 140

Gln Ser Val Phe Tyr Asn Val Leu Gly Glu Asp Phe Val Arg Ile Ala

145 150 155 160

Phe Gln Ala Ala Lys Ser Ala Asp Pro Thr Ala Lys Leu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asp Tyr Asn Leu Asp Asp Pro Asn Tyr Ala Lys Thr Lys Gly Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Val Gln Lys Trp Arg Ser Gln Gly Ile Pro Ile Asp Gly Ile

195 200 205

Gly Ser Gln Gly His Leu Ser Ala Gly Gly Gly Ser Lys Asn Ala Ala

210 215 220

Ala Leu Lys Ala Leu Ser Ala Ala Ala Pro Glu Val Ala Leu Thr Glu

225 230 235 240

Leu Asp Ile Ala Ser Ala Pro Ser Ala Asp Tyr Val Ala Val Val Gln

245 250 255

Gly Cys Leu Ala Val Ser Asn Cys Val Gly Ile Thr Thr Trp Gly Val

260 265 270

Arg Asp Val Asp Ser Trp Arg Ala Ser Ser Asn Pro Leu Leu Phe Asp

275 280 285

Ala Asn Tyr Gln Pro Lys Ala Ala Tyr Asn Ala Val Ile Ser Ala Leu

290 295 300

<210> 2

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcctatcg aggagagaca gtcctcatcc ctgaacacca agctcaaggc tcatggtaag 60

aagtactggg gtactgctac tgatcagggt actctgtcca aatccggcat gtcatcattc 120

ctgccaacac agttcggcca agtcactcct gaaaactcca tgaaatggga tgccactgag 180

ccttcacgcg gccagttcaa ctttgcaggc gcagactacc tggtcaacta cgcccagcag 240

cacggcctgt tgattcgcgg ccacaacctc ctctggcact cacagctgcc atcttgggtg 300

tcgtccatca ccgataagaa taccttgacg tcggtcttgc agaaccacat tgccaacgtt 360

gcgggccgtt ataagggaaa gctttacgcc tgggatgttg tcaatgagat tttcaatgaa 420

gatggaactc tccgtcagtc agtcttctac aacgttctcg gcgaggactt tgttcgcatc 480

gctttccagg ccgcaaagtc tgccgaccct accgcgaagc tgtacatcaa tgactacaac 540

cttgacgacc cgaactatgc caagaccaag ggcatgatct cttatgtcca gaagtggcgc 600

tctcaaggca tccctattga cggaatcggc tcccagggcc atctttctgc tggtggagga 660

tccaagaacg ccgctgctct caaggcgctg tccgctgctg ctccagaggt cgcccttact 720

gaactcgata ttgcctccgc tccctccgca gactacgtcg cggtcgttca gggatgcctt 780

gcagtgtcga actgtgtggg tattacaacc tggggtgttc gcgatgtcga ttcttggaga 840

gcttcttcga acccgctcct ctttgacgcc aactaccagc caaaggctgc atacaacgct 900

gttatctccg cattgtag 918

<210> 3

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccccaatcg aagaaagaca gtcctcctca ttgaacacca agttgaaggc tcacggtaag 60

aagtactggg gtactgctac tgaccaaggt actttgtcta agtccggtat gtcctccttc 120

ctgccaactc aattcggtca agttactcca gagaactcca tgaagtggga cgctactgaa 180

ccatccagag gtcaattcaa cttcgctggt gctgactact tggttaacta cgctcaacag 240

cacggtctgt tgatcagagg tcataacttg ttgtggcact cccaattgcc atcctgggtt 300

tcttccatca ccgacaagaa cactttgacc tccgtcctgc aaaaccacat tgctaacgtt 360

gccggtagat acaagggtaa gctgtacgct tgggacgttg tcaacgagat tttcaacgag 420

gacggtactt tgagacagtc cgtgttctac aacgtccttg gtgaggactt cgttagaatc 480

gctttccaag ctgctaagtc tgctgaccct actgccaagt tgtacatcaa cgattacaac 540

ctggacgacc caaactacgc taagaccaag ggtatgatct cctacgttca aaagtggcgt 600

tcccagggta ttccaattga cggtattggt tcccaaggtc acttgtctgc tggtggtggt 660

tctaagaatg ctgctgcttt gaaggctttg tccgctgctg ctccagaagt tgctttgact 720

gaattggaca ttgcttccgc tccatccgct gattacgttg ctgttgttca aggttgtctg 780

gccgtttcca actgtgttgg tattactacc tggggtgtcc gtgatgttga ttcttggaga 840

gcttcttcta acccattgct gttcgacgct aactaccaac ctaaggctgc ttacaacgct 900

gttatctccg ctttg 915

Claims (2)

1.一种基因工程菌P. p (xyn-N.f)，其特征在于，所述基因工程菌P. p (xyn-N.f)于2021年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22119。

2.如权利要求1所述的基因工程菌P. p (xyn-N.f)在生产木聚糖酶中的应用。

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