CN111321127A - 一种裂解多糖单加氧酶及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种裂解多糖单加氧酶与制备方法。所述裂解多糖单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述裂解多糖单加氧酶制备方法，包括如下步骤：目的基因的克隆、重组表达载体pPICZαA‑PdLPMO9A的构建、转基因菌株的获得、裂解多糖单加氧酶的获得。本发明在甲醇诱导6d后，裂解多糖单加氧酶粗酶液蛋白含量达到最高，为0.53mg/mL；其降解CMC的酶活力也达到最高，为2046u.L^‑1；LPMO活力为13u.L^‑1。

Description

一种裂解多糖单加氧酶及制备方法

技术领域

本发明属于酶基因工程技术领域，尤其涉及一种裂解多糖单加氧酶及制备方法。

背景技术

我国秸秆产量居世界首位，但与发达国家相比，利用率依然不高。众所周知，秸秆含有极其丰富的生物质，这对于解决能源危机和可持续发展具有极其重要的意义。但是，其转化为高附加值生物燃料或绿色化工产品的前提是将秸秆中难降解的纤维素转化为可利用的葡萄糖单体。目前，研究最多的纤维素降解酶包括外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，它们都属于糖苷水解酶。尽管纤维素酶的研究已经取得较好进展，但依然存在着成本高，水解效率低等瓶颈问题。

近年来，裂解多糖单加氧酶(LPMO)的发现革新了人们对纤维素降解的认知。LPMO是一种含铜的氧化酶，最初因其含有弱的纤维素酶活性，被碳水化合物活性酶(CAZy)数据库(http://www.cazy.org/)划分至糖苷水解酶GH61家族。后来发现其主要通过氧化裂解作用而非水解作用降解纤维素，从而将其归为辅助活性酶AA家族。

自然界中存在多种可降解木质纤维素的微生物，其中，担子菌降解能力最佳。它们分泌的木质纤维素酶可以使木质纤维素聚合物完全解聚。因此，发掘有潜力的降解木质纤维素的担子菌对于生物质开发利用势在必行。红侧耳(Pleurotus djamor)是一种可食用担子菌，研究发现它可在多种农林废弃物中生长，具有广泛的底物适应性。

目前NCBI核苷酸数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore#)有关真菌的LPMO序列可检索到599条，其绝大多数来源于子囊菌，担子菌研究的很少。而在常见的食用担子菌中，仅能检索到Armillaria属、Hypsizygus marmoreus和Volvariella volvacea的少部分序列。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种高活性的裂解多糖单加氧酶。

本发明的第二个目的在于提供一种裂解多糖单加氧酶的制备方法。

本发明目的按如下技术方案实现：

一种裂解多糖单加氧酶，其特征在于，所述裂解多糖单加氧酶的氨基酸序列具有如下特征：序列表中SEQ ID NO:2从氨基酸开始的第1-321或第19-321位氨基酸残基序列。

本发明还提供了裂解多糖单加氧酶的编码基因(命名为PdLPMO9A)，所述裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A的编码序列如SEQ ID NO:1所示。

所述裂解多糖单加氧酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)目的基因的克隆

通过PCR技术扩增获得裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A的编码序列，如SEQID NO:1所示；

(2)重组表达载体pPICZα A-PdLPMO9A的构建

首先预测裂解多糖单加氧酶信号肽，然后采用PCR扩增引物，去除裂解多糖单加氧酶信号肽，并扩增得到裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列，通过同源重组的方法，将裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列正确插入到pPICZα A载体XhoI位点，获得重组表达载体pPICZαA-PdLPMO9A，其中裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列终止密码子之前不加His标签；

其中所述扩增引物如下：

上游引物：5’GAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACACCATTTTCCAGGA3’

下游引物：5’AGATGAGTTTTTGTTCTAGATTATTGGCATTGATGGTAGTAGGGGT3’

所述扩增引物是经过特别设计的独特引物，该引物能够使外源蛋白在毕赤酵母GS115中成功表达，且效果最佳；

(3)转基因菌株的获得

采用电转化法将重组表达载体pPICZα A-PdLPMO9A导入宿主细胞毕赤酵母Pichiapastoris GS115菌株中；

(4)裂解多糖单加氧酶的获得

采用甲醇诱导裂解多糖单加氧酶表达。

本发明方法制得的裂解多糖单加氧酶为粗酶液，还未经过提纯。经过甲醇诱导表达6d后，收集粗酶液。采用BCA法检测粗酶液的蛋白含量为0.53mg/mL。采用SDS-PAGE对粗酶液进行鉴定检测，表明裂解多糖单加氧酶在甲醇诱导下有明显的表达。以羧甲基纤维素钠(CMC)为底物，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测粗酶液降解CMC的酶活力为2046u.L^-1；采用2,6-二甲氧基苯酚(DMP)法检测粗酶液的LPMO酶活力为13u.L^-1。

本发明获得的有益效果：

1、本发明方法制得的裂解多糖单加氧酶，在没有提纯的情况下，裂解多糖单加氧酶粗酶液的LPMO酶活力高达13u.L^-1，表明裂解多糖单加氧酶具有显著的氧化裂解作用。同时，裂解多糖单加氧酶粗酶液降解CMC的酶活力高达2046u.L^-1，表明裂解多糖单加氧酶具有很强的纤维素降解酶的活力。另外，裂解多糖单加氧酶可以产生协同增效的作用，在反应过程中通过释放糖链末端，增加了纤维素酶等糖苷水解酶与底物的作用机会，从而加速纤维素的降解。因此，裂解多糖单加氧酶还可用作农作物秸秆饲料的制备、利用秸秆生产如乙醇等化工产品的制备。

2、现有的获得酶的方法主要是采用原始红侧耳菌株(购自福建三明真菌研究所)发酵法，具有周期长，产量低的弊端。本发明采用基因工程技术手段有效获得裂解多糖单加氧酶，使发酵周期由原始菌株发酵法的12d缩短至6d，降解CMC的酶活力由原始菌株发酵法的220u.L^-1提高到2046u.L^-1，提升了9.3倍。因此，本发明制备方法缩短了生产周期，提高了产量，具有较好的经济效益。

3、常见的构建表达载体的方法有如下几种：

(1)将基因完整编码序列构建到载体中

其弊端为酵母细胞不能较好识别外源信号肽，所以无法将外源蛋白很好地分泌至胞外，或者利用酵母信号系统将外源蛋白分泌到胞外后，也无法切割外源蛋白信号肽，导致外源蛋白活性较低。

(2)将成熟肽构建到载体中，但是在终止密码前插入His标签

其弊端为成熟肽非原始蛋白，额外增加了His标签，虽然His标签给纯化带来便利，但其导致外源蛋白的结构被增加了不属于原有蛋白的His标签结构，人为改造的蛋白可能会带来活性的下降。

(3)将外源蛋白序列构建到pPICZα A载体的酶切位点非XhoI处

其弊端为使外源蛋白N端序列多了几个氨基酸残基，相当于人为改造了蛋白序列，会带来活性的下降。

而本发明重组表达载体pPICZα A-PdLPMO9A构建的方法克服了上述方法的缺点，首先预测信号肽，然后将其去除变为成熟肽。成熟肽序列终止密码子之前不加His标签，将其正确插入到载体XhoI位点，借助载体α-factor信号肽，引导裂解多糖单加氧酶成熟肽分泌到胞外。

附图说明

图1裂解多糖单加氧酶信号肽预测；

图2裂解多糖单加氧酶三维结构预测；

图3PdLPMO9A基因PCR扩增电泳检测；1为Marker；2为PdLPMO9A基因PCR产物；

图4PdLPMO9A基因菌液PCR扩增电泳检测；

图5PdLPMO9A基因序列比对结果；

图6pPICZαaA-PdLPMO9A表达载体构建示意图；

图7PdLPMO9A基因成熟肽编码序列PCR扩增电泳检测；

图8PdLPMO9A基因的菌液PCR扩增电泳检测；

图9pPICZαA-PdLPMO9A酶切线性化结果；M为DNA DL5000marker；1为重组质粒pPICZαA-PdLPMO9A；2为线性化重组质粒；

图10重组pPICZαA-PdLPMO9A酵母的PCR鉴定；M为DNA DL5000marker；1-4为pPICZαA转化的酵母；5-6为pPICZαA-PdLPMO9A转化的酵母；

图11裂解多糖单加氧酶粗酶液的蛋白含量；

图12裂解多糖单加氧酶粗酶液的SDS-PAGE检测；M:标准蛋白marker；1-3分别为pPICZαA转化的酵母96h、120h、144h甲醇诱导；4-6分别为pPICZαA-PdLPMO9A转化的酵母96h、120h、144h甲醇诱导；

图13裂解多糖单加氧酶粗酶液降解CMC的酶活力测定。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1裂解多糖单加氧酶基因序列的生物信息学分析

1、基因的CDS及编码氨基酸预测

利用ExPASy在线软件预测了裂解多糖单加氧酶的氨基酸序列，为321个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据其编码氨基酸序列，预测了其编码的裂解多糖单加氧酶基因(命名为PdLPMO9A)的CDS序列：长度为966bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、基因编码蛋白的信号肽预测

利用SignalP 4.1在线软件预测基因编码蛋白的信号肽，结果如图1：裂解多糖单加氧酶N端有信号肽序列，长度18个氨基酸(1-18)，19-321为成熟肽氨基酸序列，符合酶为分泌型蛋白的特点。

3、基因编码蛋白分子量与等电点预测

采用ExPASy在线软件预测了裂解多糖单加氧酶成熟肽蛋白分子量为31.50kDa，pI为4.93。

4、基因编码蛋白保守结构域预测

利用Pfam在线软件预测基因编码蛋白的保守结构域，结果表明：裂解多糖单加氧酶含有糖苷水解酶GH61结构域和CBM纤维素结合结构域，符合LPMO酶的特点。

5、基因编码蛋白三维结构建模

利用Swiss-model在线软件预测基因编码蛋白的三维结构，结果如图2所示：裂解多糖单加氧酶含Cu²⁺，符合LPMO酶的特点。

实施例2目的基因的克隆

1、PCR扩增目的基因

提取红侧耳(Pleurotus djamor)菌株(购自福建三明真菌研究所)RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用特异CDS引物(CDSF 5’ATGAAGTCTCTTTCAATCGCTTCC3’，CDSR 5’TTATTGGCATTGATGGTAGTAGGG3’)，进行PCR扩增。PCR体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

成分	样品加样量
		Premix Ex Taq	10μl
引物CDSF	1μl
		引物CDSR	1μl
模板cDNA	2μl
		双蒸水	6μl
总体积	20μl

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃补齐5min。

反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在966bp处有一条特异性条带，与预期片段大小相符，产物如图3所示。

对PCR扩增后大小正确的目的条带使用生工试剂盒(SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒)进行切胶回收，按说明书中进行，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2、回收产物与pMD-18T载体的连接

将胶回收产物与pMD-18T载体进行连接。连接体系如表2所示：

表2 连接体系成分

成分	加入量μL	终浓度pmol
			T载体	1	0.03
目的片段	-	0.1-0.3
			solution I	5	-
ddH2O	补足至10μL	-

将上述样品混匀，置于16℃恒温箱中，连接1h。

3、转化感受态细胞

(1)将连接反应体系10μL全部转入100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，轻轻吹打，混合后冰浴放置30分钟。

(2)将1.5mL EP管放入42℃水浴，90秒。迅速冰浴，冷却2分钟。

(3)向1.5mL EP管中加入890μL LB液体培养基，在37℃摇床上，110rpm震荡培养培养1-1.5h，进行菌体复苏。用空白LB液体培养基做对照。

(4)取出100μL，涂布于LB-氨苄抗性含有X-gal和IPTG的平板上。37℃倒置培养12-16h。

同时用感受态做空白对照。

4、菌液PCR鉴定

无菌牙签挑取白色菌落，加入LB氨苄抗性的液体培养基中。37℃，200rpm，培养4h，取1μL菌液，采用通用引物M13F/M13R(M13F 5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’，M13R 5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’)进行菌液PCR。菌液PCR结果如图4所示：初步确定为阳性克隆。

5、质粒DNA的提取及测序

取菌液PCR条带正确的菌液，用生工SanPrep试剂盒提取质粒，按说明书中方法进行。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用试剂盒进行重组质粒提取，送往吉林省库美生物技术有限公司进行序列测定。使用BLAST比对基因序列，结果如图5所示：与原始的序列进行比较，发现两者的相似性是100％。由此说明了测序结果与目标序列的一致性。获得了基因的阳性克隆。

实施例3 PdLPMO9A基因在毕赤酵母GS115中的重组表达

1、表达载体构建

根据红侧耳PdLPMO9A基因序列的特点，成功预测裂解多糖单加氧酶信号肽，然后采用PCR扩增引物，去除信号肽，并扩增得到裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列，通过同源重组的方法而非传统的T4连接酶方法，将裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列插入到pPICZαA载体XhoI位点，其中裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列终止密码子之前不加His标签。借助载体α-factor因子分泌的信号肽，引导裂解多糖单加氧酶成熟肽分泌到胞外。表达载体构建图谱如图6所示。

(1)目的基因的获取

以重组质粒为模板，采用WSF/WSR为引物(WSF

5’GAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACACCATTTTCCAGGA3’，WSR

5’AGATGAGTTTTTGTTCTAGATTATTGGCATTGATGGTAGTAGGGGT3’)，对PdLPMO9A基因成熟肽编码序列进行PCR扩增。条件见表3：

表3 高保真酶PCR反应体系

成分	样品加样量
		2×Super Pfx Master mix	10μL
引物WSF	1μL
		引物WSR	1μL
重组pMD-18T质粒	1μL
		双蒸水至20μL	7μL

反应程序为：98℃预变性1min，98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

结果如图7所示：在912bp对应位置处扩增得到目的条带。

(2)pPICZαA质粒的提取及双酶切

采用试剂盒进行质粒提取，采用限制性内切酶进行酶切(表4)。反应条件为37℃，反应3h。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

表4 pPICZαA的双酶切

试剂	体积
		10×quick buffer	4uL
pPICZαA质粒	≤2ug
		限制酶XhoI	2uL
限制酶XbaI	2uL
		总体系	40uL
H<sub>2</sub>O	补足至40uL

(3)目的基因与载体的连接

采用同源重组即无缝克隆方法进行目的基因的克隆。10uL反应体系如表5所示：将反应体系置于50℃，反应30min。之后迅速置于冰水浴中2-5min。

表5 无缝克隆的条件

2、重组质粒的转化、阳性克隆的筛选

将上述连接体系进行感受态DH5α的转化。条件如下：

(1)将连接反应体系10uL全部转入100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，轻轻吹打，混合后冰浴放置30分钟。

(2)将1.5mL EP管放入42℃水浴中，热激45-60s。迅速冰浴，冷却5分钟。

(3)向1.5mL EP管中加入500uL低盐LB液体培养基，在37℃摇床上，110rpm震荡培养培养1-2小时，进行菌体复苏。

(4)取出100uL，涂布于低盐LB-Zeocin固体筛选平板上。

3、重组质粒的菌液PCR鉴定

取适量菌液，采用通用引物5’AOX1/3’AOX1(5’AOX1 5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’，3’AOX1 5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’)对PdLPMO9A基因进行菌液PCR扩增。体系如表6：

表6 菌液PCR鉴定

成分	样品加样量
		2×Ex taq Mix	10μL
5’AOX1	1μL
		3’AOX1	1μL
菌液	1μL
		双蒸水	7μL
总体积	20μL

反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃补齐5min，4℃保存。

结果如图8所示：在1433bp处扩增得到目的条带，与预期相符，初步确定为阳性克隆。

4、重组质粒的提取及测序

方法同上。

使用BLAST比对基因序列，结果显示：与原始的序列进行比较，发现两者有一个碱基发生突变，为简并密码子，不影响基因表达。获得了基因的阳性克隆。

5、pPICZαA-PdLPMO9A重组质粒的酶切线性化及回收

使用PmeI限制性内切酶进行pPICZαA-PdLPMO9A重组质粒的酶切线性化。反应体系见表7：置于37℃，酶切3h。

表7 重组质粒的线性化体系

反应成分	添加量uL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至170uL
10×Cutsmart	25uL
		重组质粒	10ug
Pme I	5uL
		Total	250uL

酶切后，进行电泳检测，结果如图9所示表明：酶切完全。

酶切完全后，65℃，10min使酶失活。向溶液中加入1/10V的3M无菌NaAC，混匀后，加入2.5V的无水乙醇，混匀。冰上放置5min。12000g离心5min。弃上清。用80％乙醇清洗沉淀，12000g，离心5min。自然风干，直至无任何残余乙醇。向离心管中加入10ul无菌去离子水裂解沉淀，-20℃保存，备用。

6、重组质粒转化毕赤酵母

(1)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备：

①将毕赤酵母GS115菌株进行划线培养于YPD培养基上，30℃培养2-3d。

②挑单菌落转接到YPD培养基的摇菌管，30℃，200rpm-250rpm培养过夜。

③取上述培养物转接至含200mL YPD液体培养基中。30℃，200-250rpm，振荡培养过夜。直至OD600nm＝1.3-1.5后停止培养。

④收集菌液，4℃，1500×g，离心5min，弃上清。用200mL冰冷的无菌水重悬菌体。4℃，1500×g，离心5min，弃上清。用100mL冰冷的无菌水重悬菌体。4℃，1500×g，离心5min，弃上清。

⑤取8mL冰冷的1M无菌山梨醇重悬菌体。4℃，1500×g，离心5min，弃上清。用1M无菌山梨醇重悬菌体，即为感受态细胞。

(2)线性化质粒电转毕赤酵母GS115

电转仪设置为：c＝25uF，PC＝200Ω/ohm，V＝1500V，Cuvette＝0.2cm，cell vol＝40ul。将7.5uL冰上放置的重组线性化质粒加入到80uL感受态细胞中，轻轻吹打混匀。立即全部转移至0℃的0.2cm电击杯中，立即冰浴5min。按设置的程序电击。同时用线性化的pPICZαA载体做阴性对照。电击之后立即向电击杯中加入1mL冰冷的无菌1M山梨醇溶液，吸出后将它们分别转移至无菌管中，30℃，静置培养1-2h。取一定量涂平板YPDS-Zeocin平板，30℃，静置避光培养2-3d，直至长出菌落。

(3)阳性菌株的鉴定

采用试剂盒法提取酵母基因组，采用通用引物进行PCR鉴定。体系和程序详见：实施例3中3、重组质粒的菌液PCR鉴定。将其中菌液更换为基因组DNA。

重组pPICZαA-PdLPMO9A酵母的PCR鉴定结果如图10所示：1-4为空载体pPICZαA转化的菌，5-6为重组pPICZαA-PdLPMO9A质粒转化的菌。在2200bp处和1500bp处均出现条带，表明已整合到基因组中，转化成功。

7、裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母的诱导表达

采用甲醇诱导重组裂解多糖单加氧酶表达。

实施例4裂解多糖单加氧酶粗酶液的蛋白含量

经过甲醇诱导表达后，收集粗酶液，采用BCA法对重组pPICZαA-PdLPMO9A在毕赤酵母中诱导表达的裂解多糖单加氧酶粗酶液的蛋白含量进行测定，结果如图11所示：随着诱导时间的延长，蛋白含量随之增加，在144h(6d)达到最高，为0.53m g/mL。

实施例5裂解多糖单加氧酶的表达情况

采用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测裂解多糖单加氧酶的表达情况，结果如图12所示，在43kDa附近，出现目标条带，而空载体没有发生明显的诱导，表明裂解多糖单加氧酶在甲醇诱导下有明显的表达。经软件预测，裂解多糖单加氧酶蛋白分子量在31.5kDa左右，而诱导表达后的蛋白分子量为43kDa左右，这是因为裂解多糖单加氧酶发生了糖苷化所导致的，因为预测其有1个N糖苷化位点和22个O糖苷化位点。

实施例6裂解多糖单加氧酶降解CMC的酶活力测定

取200μL1％羧甲基纤维素钠(CMC)，加入浓缩20倍的粗酶液200μL。50℃水浴，10min，冷却后加入400μL DNS试剂。沸水浴5min。冷却，测540nm处光吸光值。酶活力单位定义为：每1min产生1μmol葡萄糖所需的酶量。空白用煮沸的酶液替代。实验三次重复，取平均值用于分析。

结果如图13所示：甲醇诱导表达144h(6d)时，裂解多糖单加氧酶粗酶液降解CMC的酶活力达到最高值，为2046u.L^-1。

实施例6裂解多糖单加氧酶的LPMO酶活力的测定

30℃，100mM 2,6-DMP 20μL，100mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液(pH 6.0)136μL，5mMH2O2 4μL。加入浓缩20倍的粗酶液40μL，立即启动反应。300s后测469nm出光吸收值。酶活力单位定义为每分钟形成1μmol coerulignone(摩尔吸光系数ε469＝53,200M-1cm-1)所需要的酶量。空白用煮沸的酶液替代。实验三次重复，取平均值用于分析。

结果表明：在甲醇诱导表达6d时，裂解多糖单加氧酶粗酶液的LPMO酶活力为13u.L^-1。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种裂解多糖单加氧酶及制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 红侧耳菌株(Pleurotus djamor)

<400> 1

atgaagtctc tttcaatcgc ttccttgggc ttccttgtta gtggtgctct cgcccacacc 60

attttccagg aacttcacgt aaatggtgtt tctcaaggcc acaaagttgg aattcgggtt 120

ccttcttacg atggtcccat cgaaaatgtt gcctcaaacg acatcatctg caacggtggc 180

atcaatcctt actaccaacc catgtctcaa gtgatcatcg acgtccccgc tggtggtgat 240

gtcaccgcag agttccatca tacactttca ggcgcgaacc cttccgattc ctctgacccc 300

attgacccca ctcacaaggg tcccatcctc gcatatcttg ccaaagttga ctcagccctt 360

caatctgacg tcacgggtct tgactggttc aaaatctacg aagatgggta cggtcctggc 420

acagagtggg ccgtagaccg cctcatcgcc aacgatgggt tggtcacttt caaaatcccc 480

gattgcattc cttctggcga atatcttctc cgcgttgagt tgattgctct ccacggtgct 540

ggatcttacc ctggtgctca attctacatg tcatgtgctc aaatcagagt cactggtggt 600

ggcagcgccg taccaggacc cattgcccac ttccctggtg cctactctgg aactgaccct 660

ggcatcaaat tgagcatcta ctggccccct gtcaccagct acactattcc aggccctgct 720

gtcttcacgt gcaacggatc acctcccact tcttctgttc gaccatcttc tagctccgtt 780

gctcccactt cttcgagctc tgccgtccct tcgccgcaac ctacctcttc cactcctcca 840

gttaccccaa caggtggcac cgccccccaa tggggtcaat gtggaggtga aggctggacc 900

ggtcccactg tttgcgctgc gggtacctgt gtcgctctca acccctacta ccatcaatgc 960

caataa 966

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

Met Lys Ser Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gly Phe Leu Val Ser Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala His Thr Ile Phe Gln Glu Leu His Val Asn Gly Val Ser Gln

20 25 30

Gly His Lys Val Gly Ile Arg Val Pro Ser Tyr Asp Gly Pro Ile Glu

35 40 45

Asn Val Ala Ser Asn Asp Ile Ile Cys Asn Gly Gly Ile Asn Pro Tyr

50 55 60

Tyr Gln Pro Met Ser Gln Val Ile Ile Asp Val Pro Ala Gly Gly Asp

65 70 75 80

Val Thr Ala Glu Phe His His Thr Leu Ser Gly Ala Asn Pro Ser Asp

85 90 95

Ser Ser Asp Pro Ile Asp Pro Thr His Lys Gly Pro Ile Leu Ala Tyr

100 105 110

Leu Ala Lys Val Asp Ser Ala Leu Gln Ser Asp Val Thr Gly Leu Asp

115 120 125

Trp Phe Lys Ile Tyr Glu Asp Gly Tyr Gly Pro Gly Thr Glu Trp Ala

130 135 140

Val Asp Arg Leu Ile Ala Asn Asp Gly Leu Val Thr Phe Lys Ile Pro

145 150 155 160

Asp Cys Ile Pro Ser Gly Glu Tyr Leu Leu Arg Val Glu Leu Ile Ala

165 170 175

Leu His Gly Ala Gly Ser Tyr Pro Gly Ala Gln Phe Tyr Met Ser Cys

180 185 190

Ala Gln Ile Arg Val Thr Gly Gly Gly Ser Ala Val Pro Gly Pro Ile

195 200 205

Ala His Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Gly Thr Asp Pro Gly Ile Lys Leu

210 215 220

Ser Ile Tyr Trp Pro Pro Val Thr Ser Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Ala

225 230 235 240

Val Phe Thr Cys Asn Gly Ser Pro Pro Thr Ser Ser Val Arg Pro Ser

245 250 255

Ser Ser Ser Val Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ala Val Pro Ser Pro

260 265 270

Gln Pro Thr Ser Ser Thr Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Gly Thr Ala

275 280 285

Pro Gln Trp Gly Gln Cys Gly Gly Glu Gly Trp Thr Gly Pro Thr Val

290 295 300

Cys Ala Ala Gly Thr Cys Val Ala Leu Asn Pro Tyr Tyr His Gln Cys

305 310 315 320

Gln

Claims (3)

1.一种裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A，其特征在于，所述裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A的编码序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A编码的裂解多糖单加氧酶，其特征在于，所述裂解多糖单加氧酶的氨基酸序列具有如下特征：序列表中SEQ ID NO:2从氨基酸开始的第1-321或第19-321位氨基酸残基序列。

3.如权利要求2所述的裂解多糖单加氧酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）目的基因的克隆

通过PCR技术扩增获得裂解多糖单加氧酶编码基因PdLPMO9A的编码序列如SEQ ID NO:1所示；

（2）重组表达载体pPICZαA-PdLPMO9A的构建

首先预测裂解多糖单加氧酶信号肽，然后采用PCR扩增引物，去除裂解多糖单加氧酶信号肽，并扩增得到裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列，通过同源重组的方法，将裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列正确插入到pPICZαA载体XhoI位点，获得重组表达载体pPICZαA-PdLPMO9A，其中裂解多糖单加氧酶成熟肽编码序列终止密码子之前不加His标签；

其中所述扩增引物如下：

上游引物：5’GAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACACCATTTTCCAGGA3’

下游引物：5’AGATGAGTTTTTGTTCTAGATTATTGGCATTGATGGTAGTAGGGGT3’

（3）转基因菌株的获得

采用电转化法将重组表达载体pPICZαA-PdLPMO9A导入宿主细胞毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株中；

裂解多糖单加氧酶的获得

采用甲醇诱导裂解多糖单加氧酶表达。

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