CN105838693B - 一种耐高温酸性果胶酶pagl8及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性果胶酶PAGL8及其基因和应用。本发明提供了一种来源于黑曲霉Aspergillus niger L75的果胶酶PAGL8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示，且本发明提供了编码上述果胶酶的编码基因pagL8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或6所示。本发明的果胶酶具有以下性质：最适pH 5.0，最适温度50℃，具有较好的热稳定性，75℃处理10min剩余70％的酶活力。作为一种新型的酶制剂，可应用于饲料、食品等行业。

Description

一种耐高温酸性果胶酶PAGL8及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性果胶酶PAGL8及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

果胶质广泛存在于高等植物中，是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分，在植物细胞组织中起着“黏合”作用。果胶质主要是由D-半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷键连接形成的直链状的聚合物。果胶酶(pectinase)是指能够催化果胶质分解的多种酶的总称。果胶酶通常可以分为3种类型：第一类为原果胶酶，降解不溶性原果胶为高度聚合的可溶性果胶；第二类为酯酶，通过切除甲基促进果胶酯的水解；第三类为解聚酶，断开果胶物质中部分D-半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，分为果胶水解酶和果胶裂解酶。果胶水解酶的作用是水解果胶糖苷键；果胶裂解酶的作用是通过β消除反应使糖苷键断裂，该酶攻击底物的糖苷键在邻近羧基或酯化的羧基一边发生β消除。果胶解聚酶又有内切酶和外切酶之分，内切解聚酶是指该酶随机地切断长链分子内的糖苷键，而外切解聚酶是指从链的一端逐个切断糖苷键。

果胶酶作为工业生产领域中的一种重要的新兴酶类，在全世界食品酶的销售额中约占到了四分之一，它在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等方面应用广泛。果胶酶是降解饲料抗营养因子--果胶的有效酶，添加饲用果胶酶制剂能补充动物体内酶源的不足，增加动物自身不能合成的酶，从而促进畜禽对养分的消化、吸收，提高饲料的利用率，促进生长。它作为一种绿色饲料添加剂在畜牧业生产中的应用越来越广泛。目前已经利用微生物发酵进行饲用果胶酶的产业化生产，然而目前国内果胶酶主要是从原始菌株中分离得到，具有产量较低，成本较高，耐热性及抗酸性酶难以获得等问题，从而限制了果胶酶的实际应用。所以亟待运用基因工程和蛋白质工程手段来生产适于商业化应用的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够应用的耐高温酸性果胶酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐高温酸性果胶酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温酸性果胶酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐高温酸性果胶酶的应用。

本发明提供了一种耐高温酸性果胶酶PAGL8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，该酶基因编码365个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列MPSAKPLFCL ATLAGAALA(SEQ ID NO.2)。因此，成熟的耐高温酸性果胶酶PAGL8的理论分子量为69.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的耐高温酸性果胶酶PAGL8具有较好的热稳定性，在偏酸性和中性的范围内均具有较高活性，最适反应pH 5.0，最适反应温度50℃。

本发明提供了编码上述耐高温酸性果胶酶的基因pagL8。具体地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了耐高温酸性果胶酶基因PAGL8，cDNA全序列分析结果表明，果胶酶PAGL8结构基因pagL8全长1098bp。其中，信号肽的碱基序列：atgccatctgcaaaaccatt attttgttta gcaacattag caggagcagc attagca(SEQ ID NO.5)。

成熟的耐高温酸性果胶酶PAGL8的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

将耐高温酸性果胶酶基因pagL8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Aspergillus niger的果胶酶氨基酸序列一致性为74％。说明本发明的耐高温酸性果胶酶PAGL8是一种新的果胶酶。

本发明还提供了包含上述耐高温酸性果胶酶基因pagL8的重组载体，优选为pPIC-pagL8。将本发明的果胶酶基因去掉信号肽后插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的果胶酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC-pagL8。

本发明还提供了包含上述耐高温酸性果胶酶基因pagL8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步优选为重组毕赤酵母菌株GS115/pagL8。

本发明还提供了一种制备耐高温酸性果胶酶PAGL8的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组果胶酶表达；

3)回收并纯化所表达的果胶酶PAGL8。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115(Pichia pastoris)，得到重组菌株GS115/pagL8。

本发明还提供了上述耐高温酸性果胶酶PAGL8的应用，例如，其在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等方面降解果胶的应用。

本研究获得一种优质果胶酶及其编码基因，其活性较高，综合性质优良。利用重组细菌进行高细胞密度发酵进行高效表达生产，可以大幅度降低产品的成本，有助于实现该产品的产业化，从而助于缓解饲料资源短缺、降低饲养环境的污染，具有较大的经济和社会意义。

附图说明

图1为本发明的重组耐高温酸性果胶酶的最适pH。

图2本发明的重组耐高温酸性果胶酶的pH稳定性。

图3本发明的重组耐高温酸性果胶酶的最适温度。

图4本发明的重组耐高温酸性果胶酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

本发明从黑曲霉Aspergillus niger L75中分离得到一种新的耐高温酸性果胶酶PAGL8。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂

限制性内切酶和连接酶均购自Fermentas公司；其它均为国产生化试剂。

3、培养基

(1)大肠杆菌培养基LB：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0；

(2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)；

(3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 黑曲霉Aspergillus niger L75中果胶酶编码基因pagL8的克隆

提取黑曲霉Aspergillus niger L75基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据果胶酶基因序列设计合成引物P1，P2

P1:5'-GCACCAGCACCATCTCGTGTATCTG-3'；

P2:5'-TTATTGATCACAAGATGCTCCAGATGGTA-3'。

以黑曲霉Aspergillus niger L75总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃保温10min。将该片段回收后与pEASY-T3载体连接转化后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

实施例2 重组耐高温酸性果胶酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码果胶酶基因pagL8双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟果胶酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有黑曲霉Aspergillus niger L75果胶酶基因pagL8的重组质粒pPIC-pagL8并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/pagL8。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定果胶酶的活力。重组果胶酶的表达量为2000U/mL。

实施例3 重组耐高温酸性果胶酶的活性分析

果胶酶活性测定方法：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当稀释的酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后，540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmol D-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

实施例4 重组耐高温酸性果胶酶PAGL8的性质测定

1、重组耐高温酸性果胶酶PAGL8的最适pH和pH稳定性的测定

将纯化的重组果胶酶在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行酶活力测定。结果(图1)表明，重组果胶酶PAGL8的最适pH为5.0，在pH 3.0～6.5有60％以上的相对酶活性。果胶酶PAGL8于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH5.0缓冲液体系中37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明果胶酶PAGL8在pH 2.0～8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在85％以上，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、重组耐高温酸性果胶酶PAGL8的最适温度及热稳定性测定

果胶酶PAGL8的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为果胶酶PAGL8在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为50℃，在20～65℃下均保持较高酶活。酶的热稳定性试验表明(图4)，果胶酶PAGL8有良好的热稳定性，在70℃下温育1h，能保持85％以上的酶活。

3、不同金属离子化学试剂对重组耐高温酸性果胶酶PAGL8酶活的影响测定

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在50℃、pH 5.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组果胶酶PAGL8的活力没有明显变化，只有SDS微弱抑制其活力。当Cu²⁺，Ag⁺，和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制果胶酶PAGL8酶活力，5mmol SDS使其活力全部丧失。

4、重组耐高温酸性果胶酶PAGL8抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH 2.0 KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH 7.0 Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH 2.0 KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH 7.0 Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/果胶酶(w/w)≈0.1，37℃保温60和120min取样，在pH5.0及50℃条件下测定酶活性。实验结果表明果胶酶PAGL8用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120min后，胰蛋白酶处理后的果胶酶PAGL8的酶活比处理前提高了20％，胃蛋白酶处理后的果胶酶PAGL8活性比处理前提高了15％。

Claims (9)

1.一种耐高温酸性果胶酶PAGL8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示。

2.一种耐高温酸性果胶酶基因pagL8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温酸性果胶酶PAGL8。

3.如权利要求2所述的耐高温酸性果胶酶基因pagL8，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

4.包含权利要求2或3所述耐高温酸性果胶酶基因pagL8的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC-pagL8，所述重组载体pPIC-pagL8为将所述果胶酶基因pagL8插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该果胶酶基因pagL8的核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC-pagL8。

6.包含权利要求2或3所述耐高温酸性果胶酶基因pagL8的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为GS115/pagL8，所述重组菌株GS115/pagL8为将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115(Pichia pastoris)，得到重组菌株GS115/pagL8，其中，所述重组酵母表达质粒为pPIC-pagL8，重组酵母表达质粒pPIC-pagL8为将所述果胶酶基因pagL8插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该果胶酶基因pagL8的核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC-pagL8。

8.一种制备耐高温酸性果胶酶PAGL8的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4或5的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组耐高温酸性果胶酶表达；

3)回收并纯化所表达的耐高温酸性果胶酶PAGL8。

9.权利要求1所述耐高温酸性果胶酶PAGL8在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术和饲料方面降解果胶的应用。