CN106701813A - 表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达载体，以pPICZαA载体为骨架携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。本发明还提供了表达载体的构建方法，包括将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA‑YPSΔ；将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA‑PDI；以重组载体pPICZαA‑PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA‑YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA‑PDI‑YPSΔ。本发明还提供了表达载体在表达外源蛋白中的用途，以及外源蛋白的表达方法。

Description

表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种表达载体及其构建方法与应用，更具体地，本发明涉及一种共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

随着生物技术的发展，利用基因工程技术来开发重组蛋白已颇受人们青睐。毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一，具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，有可诱导的强启动子，外源基因能整合于染色体上，具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、操作简便及易于工业化生产等特点，已成功地表达了许多极具价值的蛋白。

但是不同的蛋白在毕赤酵母表达过程中表现出不同的表达量，有的蛋白难于在毕赤酵母中表达，而有的蛋白表达量可达10g/L以上，因此，分泌表达量成为制约毕赤酵母表达的瓶颈，如何提高产量，降低生产成本，是目前的研究热点。有研究发现，外源蛋白的分泌表达量低往往是其在内质网中的聚集造成的。通过采用不同启动子或增加基因拷贝数的策略来增强毕赤酵母表达外源蛋白，相当含量的外源蛋白因未进行正确的折叠加工，仍然滞留在胞内而未被分泌表达，因此外源蛋白在内质网中的有效折叠和整合一定程度上影响了外源蛋白的总产率。利用共表达分子伴侣如蛋白二硫键异构酶(Protein disulfideisomerase,PDI)能够有效改善这一状况，使外源蛋白的分泌效率有效提高。另外，外源蛋白在表达过程中的降解也是影响分泌表达量的一个重要因素，YPS1蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的天冬氨酸蛋白酶，能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点，起着加工前肽的作用，但YPS1也在外源蛋白的表达过程中起到降解外源蛋白的作用，如人血清白蛋白(HSA)在毕赤酵母表达过程中产生的45KD降解片段，有报道称降解是由YPS1蛋白酶引起。

在同一毕赤酵母菌株中共表达外源目的蛋白和分子伴侣二硫键异构酶(PDI)，同时失活YPS1基因，目前常用的方法为分别构建不同的载体，包括外源蛋白表达载体、过表达二硫键异构酶载体和YPS1失活载体，并需分别进行转化筛选，过程繁琐复杂，还需考虑采用不同的筛选标记，筛选周期长，所以亟需设计构建一种在同一载体实现外源蛋白和二硫键异构酶共表达，同时失活YPS1基因的方法。

发明内容

本发明针对现有技术中的如下缺陷提出的解决技术方案：现有技术中为了实现多基因共表达，目前常用的方法为分别构建不同的载体，并需分别进行转化，选择不同的筛选标记进行筛选，过程较繁琐复杂，筛选周期长。

具体地，针对上述缺陷，本发明提供了一种共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的表达载体，该载体的构建方法，该载体在表达外源蛋白中的用途，以及外源蛋白的表达方法。

一方面，本发明提供了一种表达载体，以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。

前述的表达载体，所述PDI表达盒是序列表中SEQ ID No:3的核苷酸序列。

前述的表达载体，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQ ID No:1的核苷酸序列。

前述的表达载体，所述PDI表达盒连接在所述pPICZαA载体的BglII位点。

前述的表达载体，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列连接在所述pPICZαA载体的BamHI位点。

前述的表达载体，所述表达载体在毕赤酵母中进行表达。

另一方面，本发明提供了前述的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA-YPSΔ；

(2)将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI；

(3)以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；

(4)将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。

前述的构建方法，在步骤(1)之前，以毕赤酵母基因组DNA为模板，以C端非功能区序列引物YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端非功能区序列，以N端非功能区序列引物YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端非功能区序列；其中：

YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’

YPS-c-R：5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’

YPS-N-F：5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’

YPS-N-R：5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’。

前述的构建方法，在步骤(1)中，YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体的BamHI位点。

前述的构建方法，在步骤(2)中，以PDI基因序列为模板，设计引物，在上游引物添加Bsp119I限制性内切酶位点，下游引物添加Xba I限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119I和Xba I双酶切，连接至pPICZαA表达载体中，获得pPICZαA-PDI载体，其中：

上游引物PDI-bspU：5'-GCGTTCGAAATGCAATTCAACTGGAATAT-3'

下游引物PDI-xbaL：5'-CCGTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCT-3'。

前述的构建方法，在步骤(3)中，PCR采用的引物是：

PDI-EG-F:5'-ttggtcatgagatcagatctAACATCCAAAGACGAAAGGTTG-3'

PDI-EG-R:5'-cgtctttggatgttagatctGCACAAACGAAGGTCTCACTTA-3'。

前述的构建方法，在步骤(4)中，PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ的BglII位点。

另一方面，本发明提供了前述的表达载体在表达外源蛋白中的用途。

前述的用途，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。

另一方面，本发明提供了一种外源蛋白的表达方法，包括：将外源蛋白基因连接至前述的表达载体，筛选获得重组表达载体，并在毕赤酵母中表达所述重组表达载体。

前述的表达方法，包括如下步骤：

(1)将外源蛋白基因标记为insert，以外源蛋白基因序列为模板，设计引物，在上游引物中添加Xho I酶切位点CTCGAG，同时在Xho I酶切位点后添加AAAAGA，在下游引物中添加Not I限制性酶切位点GCGGCCGC，经PCR获得目的基因；

(2)将步骤(1)获得的目的基因与前述的表达载体进行Xho I和Not I双酶切，并连接，转化大肠杆菌，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert；

(3)对步骤(2)获得的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert在YPS1的C端和N端非功能区序列之间进行EcoR I线性化，YPS1的C端和N端序列作为同源重组交换同源臂，经电转化插入毕赤酵母基因组；

(4)Zeocin筛选与外源蛋白表达。

前述的表达方法，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。

本发明的有益技术效果：利用pPICZαA-PDI-YPSΔ载体表达外源蛋白，节约了载体构建和转化筛选时间，有效提高转化及筛选效率。利用pPICZαA-PDI-YPSΔ载体表达外源蛋白，可有效提高外源蛋白的表达量。

附图说明

图1是pPICZαA-PDI-YPSΔ表达载体构建流程图。

图2是GS115/pPICZαA-HSA和GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达情况比较，其中，对照：GS115/pPICZαA-HSA表达结果，A7、A13、A5：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达结果。

图3是GS115/pPICZαA-hGH和GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达情况比较，其中，对照：GS115/pPICZαA-hGH表达结果，A7、A13、A5：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达结果。

具体实施方式

为了充分说明本发明解决技术问题所实施使用的技术方案。下面结合实施例和附图对发明做详细说明，但本发明的技术方案、技术方案的实施方式以及保护范围并不仅仅限于此。除非另有说明，否则下文中出现的科技和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种表达载体，具体是一种改造的毕赤酵母表达载体，该载体能够实现在同一载体中共表达外源蛋白和分子伴侣二硫键异构酶(PDI)，同时失活YPS1基因的表达体系，从而提高转化和筛选的效率，通过对毕赤酵母表达载体的优化改造，最终实现外源蛋白表达量的提高。

具体地，本发明的表达载体以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。在pPICZαA载体上连接PDI表达盒，利用共表达诸如二硫键异构酶(PDI)的分子伴侣，能够有效改善外源蛋白因未进行正确折叠加工而滞留在胞内未被分泌表达的问题，能够使外源蛋白的分泌效率有效提高。同时，在pPICZαA载体上连接YPS1基因C端非功能区序列和N端非功能区序列，当插入毕赤酵母基因组时能够破坏毕赤酵母原始YPS1基因，达到YPS1蛋白酶失活的作用，能够有效避免外源蛋白在分泌表达过程中被YPS1蛋白酶降解。

其中，所述PDI表达盒是序列表中SEQ ID No:3的核苷酸序列。

其中，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQ ID No:1的核苷酸序列。

其中，所述PDI表达盒连接在所述pPICZαA载体的BglII位点。

其中，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列连接在所述pPICZαA载体的BamHI位点。

在一种特别优选的具体实施方式中，本发明提供了一种改造的毕赤酵母表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ，其以pPICZαA载体为骨架，在pPICZαA载体的BglII位点插入PDI表达盒，并且在pPICZαA载体的BamHI位点插入YPS1基因C端和N端非功能区序列，其中，PDI表达盒是序列表中SEQ ID No:3的核苷酸序列，YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQID No:1的核苷酸序列。

根据本发明的第二方面，本发明提供了本发明第一方面的表达载体的构建方法，如图1所示，本发明表达载体的构建方法包括：

第一步，将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA-YPSΔ。

在连接之前，首先以毕赤酵母YPS1基因序列为模板，设计失活YPS1蛋白酶的C端和N端非功能区序列引物，缺失YPS1基因的功能区，在C端序列和N端序列之间添加EcoR I酶切位点GAATTC作为载体同源重组线性化位点，插入序列如下，见序列表SEQ ID No:1。

设计引物如下：

C端非功能区序列引物(小写字母为5’端添加的重组序列)：

YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’

YPS-c-R:5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’

N端非功能区序列引物(小写字母为5’端添加的重组序列)：：

YPS-N-F:5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’

YPS-N-R:5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’

以毕赤酵母基因组DNA为模板，以YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端基因序列；以YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端基因序列。

之后，对pPICZαA载体进行BamH I内切酶线性化，利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的C端序列和N端序列同时克隆连接至pPICZαA载体的BamH I位点处，转化大肠杆菌，筛选获得pPICZαA-YPSΔ载体。

第二步，将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI。

以毕赤酵母二硫键异构酶基因序列为模板，设计二硫键异构酶(PDI)序列引物，在上游引物添加Bsp119I限制性内切酶位点，下游引物添加Xba I限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119I和Xba I双酶切，连接至pPICZαA表达载体中，获得pPICZαA-PDI载体，插入的PDI序列如下，见序列表SEQ ID No:2。

设计引物如下：

PDI-bspU：5'-GCGTTCGAAATGCAATTCAACTGGAATAT-3'

PDI-xbaL：5'-CCGTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCT-3'

第三步，以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒。

以pPICZαA-PDI载体为模板，以插入pPICZαA-YPSΔ载体的BglII位点区为目的，设计EasyGeno无缝克隆引物PDI-EG-F、PDI-EG-R，以高保真酶进行PCR，PCR产物为PDI表达盒，包括AOX启动子、PDI序列和AOX1转录终止区，序列如下，见序列表SEQ ID No:3。

设计引物如下：

PDI-EG-F:5'-ttggtcatgagatcagatctAACATCCAAAGACGAAAGGTTG-3'

PDI-EG-R:5'-cgtctttggatgttagatctGCACAAACGAAGGTCTCACTTA-3'

第四步，将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。

对pPICZαA-YPSΔ进行Bgl II线性化，利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的PDI表达盒连接至pPICZαA-YPSΔ载体的Bgl II位点处，转化大肠杆菌，筛选获得共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。

根据本发明的第三方面，本发明提供了本发明第一方面的表达载体在表达外源蛋白中的用途。其中，外源蛋白是适合在毕赤酵母表达的外源蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、人生长激素(hGH)、人表皮生长因子(hEGF)等。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种外源蛋白的表达方法，该表达方法采用了本发明第一方面的表达载体，将外源蛋白基因连接至本发明第一方面的表达载体，筛选获得重组表达载体，并在毕赤酵母中表达所述重组表达载体。

具体地，外源蛋白的表达方法包括如下步骤：

(1)将插入的外源蛋白基因标记为insert，以外源蛋白基因序列为模板，设计引物，在上游引物中添加Xho I酶切位点CTCGAG，同时在Xho I酶切位点后添加AAAAGA，可在表达过程中经KEX2酶切割，获得所需的N端；在下游引物中添加Not I限制性酶切位点GCGGCCGC，经PCR获得目的基因。

(2)经PCR获得目的基因后，同时与构建的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ进行Xho I和Not I双酶切，并连接，转化大肠杆菌，筛选获得pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert表达载体。

(3)对获得的pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert表达载体经EcoR I线性化，线性化位置为YPS1的C端和N端非功能区域序列之间，YPS1的C端和N端序列作为同源重组交换同源臂，经电转化插入毕赤酵母基因组，同时能破坏了毕赤酵母菌中原始的YPS1基因，达到YPS1蛋白酶失活的作用。

(4)经过Zeocin筛选，摇瓶表达鉴定外源蛋白表达情况。

实施例

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下列实施例中采用的制剂均可常规市购获得。

实施例1：共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因毕赤酵母表达载体的构建

1、将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA-YPSΔ。

1.1以毕赤酵母YPS1基因序列为模板，设计失活YPS1蛋白酶的C端和N端非功能区序列引物，缺失YPS1基因的功能区，在C端序列和N端序列之间添加EcoR I酶切位点GAATTC，插入序列见序列表SEQ ID No:1：

设计引物如下：

C端非功能区序列引物(小写字母为5’端添加的重组序列)：

YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’

YPS-c-R:5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’

N端非功能区序列引物(小写字母为5’端添加的重组序列)：：

YPS-N-F:5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’

YPS-N-R:5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’

以毕赤酵母基因组DNA为模板，以YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端基因序列；以YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端基因序列，对PCR产物利用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量百分浓度为1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带，分别命名为YPS-C和YPS-N。

1.2对pPICZαA载体进行BamH I内切酶线性化，BamH I内切酶购自Thermo Fisher公司，反应体系如下：

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化30分钟，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，回收纯化线性化产物。

对上述线性产物进行碱性磷酸酶去磷酸化，碱性磷酸酶(CIP)购自NEB公司，反应体系如下：

上述试剂加好后，混匀，37℃温育60分钟，然后用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，回收纯化去磷酸化产物。

对于上述线性去磷酸化的pPICZαA载体，利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的C端序列和N端序列同时克隆连接至pPICZαA载体的BamH I位点处，EsayGeno快速重组克隆试剂盒购自天根生化科技有限公司，反应体系如下：

将混合反应液置于50℃反应60min，反应结束后瞬时离心，将离心管置于冰上冷却5min，进行后续的转化反应。

取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟，42℃水浴热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100-200μL菌液，涂于含有zeocin(25μg/mL)的固体LB平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18小时，挑选单菌落接种于含有氨苄青霉素zeocin(25μg/mL)的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，菌液PCR鉴定，并送测序，构建的载体命名为pPICZαA-YPSΔ。

2、将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI。

以毕赤酵母二硫键异构酶序列为模板，设计二硫键异构酶(PDI)序列引物PDI-bspU/PDI-xbaL，在上游引物添加Bsp119I限制性内切酶位点，下游引物添加Xba I限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119 I和Xba I双酶切，连接至pPICZαA表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，获得pPICZαA-PDI载体，插入的PDI序列如下，见序列表SEQ IDNo:2。

PDI-bspU：5'-GCGTTCGAAATGCAATTCAACTGGAATAT-3'

PDI-xbaL：5'-CCGTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCT-3'

3、以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒。

再以pPICZαA-PDI载体为模板，以插入pPICZαA-YPSΔ载体的BglII位点区为目的，设计EasyGeno无缝克隆引物PDI-EG-F/PDI-EG-R，以高保真酶进行PCR，PCR产物为PDI表达盒，包括AOX启动子、PDI序列和AOX1转录终止区，回收纯化PCR产物。

PDI-EG-F:5'-ttggtcatgagatcagatctAGATCTAACATCCAAAGACGAA-3'

PDI-EG-R:5'-cgtctttggatgttagatctGCACAAACGAAGGTCTCACTTA-3'

4、对pPICZαA-YPSΔ进行Bgl II线性化，利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的PDI表达盒连接至pPICZαA-YPSΔ载体的Bgl II位点处，转化大肠杆菌DH5α，筛选获得pPICZαA-PDI-YPSΔ载体，操作方法同步骤1。

实施例2：构建含有外源基因-人血清白蛋白的共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的毕赤酵母表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA

根据人血清白蛋白(HSA)的基因序列设计引物，在上游引物中添加Xho I酶切位点CTCGAG，同时在Xho I酶切位点后添加AAAAGA，可在表达过程中经KEX2酶切割，获得天然N端目的蛋白；在下游引物中添加Not I限制性酶切位点GCGGCCGC，引物序列如下：

HSA-XU:5'-GCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGT-3'

HSA-NL:5'-ATAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3'

以人皮肤组织cDNA为模板，以HSA-XU/HSA-NL为引物进行PCR，连接T载体并经测序获得正确的HSA基因，命名为T-HSA，然后利用限制性内切酶对T-HSA和实施例1的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ同时进行Xho I和Not I双酶切，回收纯化酶切产物，T4连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5α，获得pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达载体。然后将获得的pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达载体电转化毕赤酵母，zeocin筛选高拷贝菌株，经摇瓶鉴定表达结果，同时与单独表达HSA的毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-HSA(申请人采用常规方法构建并保存)摇瓶结果作比较，利用本发明的表达载体表达HSA，表达量明显提高，结果见图2，并经发酵罐发酵检测表达量可达到10g/L。

实施例3：构建含有外源基因-人生长激素的共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的毕赤酵母表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH

根据人生长激素(hGH)的基因序列设计引物，在上游引物中添加Xho I酶切位点CTCGAG，同时在Xho I酶切位点后添加AAAAGA，可在表达过程中经KEX2酶切割，获得天然N端目的蛋白；在下游引物中添加Not I限制性酶切位点GCGGCCGC，引物序列如下：

hGH-XU:5'-TAGCTCGAGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGG-3'

hGH-NL:5'-TATTGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGCCCTCC-3'

以人皮肤组织cDNA为模板，以hGH-XU/hGH-NL为引物进行PCR，连接T载体并经测序获得正确的hGH基因，命名为T-hGH，然后利用限制性内切酶对T-hGH和实施例1的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ同时进行Xho I和Not I双酶切，回收纯化酶切产物，T4连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5α，获得pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达载体。然后将获得的pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达载体电转化毕赤酵母，zeocin筛选高拷贝菌株，经摇瓶鉴定表达结果，同时与单独表达hGH的毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-hGH(申请人采用常规方法构建并保存)摇瓶结果作比较，利用本发明的表达载体表达hGH，表达量明显提高，结果见图3。

序列表

<110> 陕西慧康生物科技有限责任公司

<120> 表达载体及其构建方法与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTCCTATGAT TCGTCAAGAC AAGCTTATAC CATTCGTTGT GTTTCTGCAT CAGATACCAC 60

TTCTCTGGTA TTCAATTTTG GGGGTGCTAC AGTGGAAGTT TCCCTGTACG ATCTACAGAT 120

TGCAACATAT TACACCGGGG GAAGTGCCAC GCAATGTCTT ATTGGAATAT TCAGCTCTGG 180

AAGTGATGAG TTTGTGCTCG GTGATACCTT CTTGAGGTCA GCCTACGTGG TTTACGATCT 240

TGATGGGCTT GAAGTGTCGC TTGCCCAAGC CAACTTCAAC GAAACCGATT CTGATGTTGA 300

GGCTATTACC TCCAGTGTAC CTTCCGCTAC TCGTGCATCC GGATACAGTT CTACATGGTC 360

TGGTTCTGCC AGCGGTACAG TTTACACTTC GGTTCAGATG GAATCCGGTG CTGCTTCCAG 420

CTCCAACTCT TCTGGATCGA ATATGGGTTC CTCTTCCTCA TCGTCCTCTT CATCGTCCTC 480

GACTTCCAGT GGAGACGAAG AAGGAGGGAG CTCCGCCAAC AGGGTCCCCT TCAGCTACCT 540

TTCTCTCTGT TTGGTAGTTA TTCTCGGCGT GTGTATAGTG AATTCTTTCC GCTCAGCCAG 600

ATTTTATTCG TAAAGAACGC ATCATTGGCT CTATGTTGAA GGATCAGTTC TTGTTATGGG 660

TTGCTTTGAT AGCGAGCGTA CCGGTTTCCG GCGTGATGGC AGCTCCTAGC GAGTCCGGGC 720

ATAACACGGT TGAAAAACGA GATGCCAAAA ACGTTGTTGG CGTTCGACAG TTGGACTTCA 780

GCGTTCTGAG GGGTGATTCC TTCGAAAGTG CCTCTTCAGA GAACGTGCCT CGGCTTGTGA 840

GGAGAGATGA CACGCTAGAA GCTGAGCTAA TCAACCAGCA ATCATTCTAC TTGTCACGAC 900

TGAAAGTTGG ATCACATCAA GCGGATATTG GAATCCTAGT GGACACAGGA TCCTCTGATT 960

TATGGGTAAT GGACTCGGTA AACCCATACT GCAGTAGCCG TTCCCGCGTG AAGAGAGATA 1020

TACATGATGA GAAGATCGCC GAATGGGATC CCATCAATCT CAAGAAAAAT GAAACTTCTC 1080

AGAATAAAAA TTTTTGGGAT TGGCTCGTTG GAACTAGCAC TAGTT 1125

<210> 2

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TTCGAAATGC AATTCAACTG GAATATTAAA ACTGTGGCAA GTATTTTGTC CGCTCTCACA 60

CTAGCACAAG CAAGTGATCA GGAGGCTATT GCTCCAGAGG ACTCTCATGT CGTCAAATTG 120

ACTGAAGCCA CTTTTGAGTC TTTCATCACC AGTAATCCTC ACGTTTTGGC AGAGTTTTTT 180

GCCCCTTGGT GTGGTCACTG TAAGAAGTTG GGCCCTGAAC TTGTTTCTGC TGCCGAGATC 240

TTAAAGGACA ATGAGCAGGT TAAGATTGCT CAAATTGATT GTACGGAGGA GAAGGAATTA 300

TGTCAAGGCT ACGAAATTAA AGGGTATCCT ACTTTGAAGG TGTTCCATGG TGAGGTTGAG 360

GTCCCAAGTG ACTATCAAGG TCAAAGACAG AGCCAAAGCA TTGTCAGCTA TATGCTAAAG 420

CAGAGTTTAC CCCCTGTCAG TGAAATCAAT GCAACCAAAG ATTTAGACGA CACAATCGCC 480

GAGGCAAAAG AGCCCGTGAT TGTGCAAGTA CTACCGGAAG ATGCATCCAA CTTGGAATCT 540

AACACCACAT TTTACGGAGT TGCCGGTACT CTCAGAGAGA AATTCACTTT TGTCTCCACT 600

AAGTCTACTG ATTATGCCAA AAAATACACT AGCGACTCGA CTCCTGCCTA TTTGCTTGTC 660

AGACCTGGCG AGGAACCTAG TGTTTACTCT GGTGAGGAGT TAGATGAGAC TCATTTGGTG 720

CACTGGATTG ATATTGAGTC CAAACCTCTA TTTGGAGACA TTGACGGATC CACCTTCAAA 780

TCATATGCTG AAGCTAACAT CCCTTTAGCC TACTATTTCT ATGAGAACGA AGAACAACGT 840

GCTGCTGCTG CCGATATTAT TAAACCTTTT GCTAAAGAGC AACGTGGCAA AATTAACTTT 900

GTTGGCTTAG ATGCCGTTAA ATTCGGTAAG CATGCCAAGA ACTTAAACAT GGATGAAGAG 960

AAACTCCCTC TATTTGTCAT TCATGATTTG GTGAGCAACA AGAAGTTTGG AGTTCCTCAA 1020

GACCAAGAAT TGACGAACAA AGATGTGACC GAGCTGATTG AGAAATTCAT CGCAGGAGAG 1080

GCAGAACCAA TTGTGAAATC AGAGCCAATT CCAGAAATTC AAGAAGAGAA AGTCTTCAAG 1140

CTAGTCGGAA AGGCCCACGA TGAAGTTGTC TTCGATGAAT CTAAAGATGT TCTAGTCAAG 1200

TACTACGCCC CTTGGTGTGG TCACTGTAAG AGAATGGCTC CTGCTTATGA GGAATTGGCT 1260

ACTCTTTACG CCAATGATGA GGATGCCTCT TCAAAGGTTG TGATTGCAAA ACTTGATCAC 1320

ACTTTGAACG ATGTCGACAA CGTTGATATT CAAGGTTATC CTACTTTGAT CCTTTATCCA 1380

GCTGGTGATA AATCCAATCC TCAACTGTAT GATGGATCTC GTGACCTAGA ATCATTGGCT 1440

GAGTTTGTAA AGGAGAGAGG AACCCACAAA GTGGATGCCC TAGCACTCAG ACCAGTCGAG 1500

GAAGAAAAGG AAGCTGAAGA AGAAGCTGAA AGTGAGGCAG ACGCTCACGA CGAGCTTTAA 1560

TCTAGA 1566

<210> 3

<211> 2897

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

AGATCTAACA TCCAAAGACG AAAGGTTGAA TGAAACCTTT TTGCCATCCG ACATCCACAG 60

GTCCATTCTC ACACATAAGT GCCAAACGCA ACAGGAGGGG ATACACTAGC AGCAGACCGT 120

TGCAAACGCA GGACCTCCAC TCCTCTTCTC CTCAACACCC ACTTTTGCCA TCGAAAAACC 180

AGCCCAGTTA TTGGGCTTGA TTGGAGCTCG CTCATTCCAA TTCCTTCTAT TAGGCTACTA 240

ACACCATGAC TTTATTAGCC TGTCTATCCT GGCCCCCCTG GCGAGGTTCA TGTTTGTTTA 300

TTTCCGAATG CAACAAGCTC CGCATTACAC CCGAACATCA CTCCAGATGA GGGCTTTCTG 360

AGTGTGGGGT CAAATAGTTT CATGTTCCCC AAATGGCCCA AAACTGACAG TTTAAACGCT 420

GTCTTGGAAC CTAATATGAC AAAAGCGTGA TCTCATCCAA GATGAACTAA GTTTGGTTCG 480

TTGAAATGCT AACGGCCAGT TGGTCAAAAA GAAACTTCCA AAAGTCGGCA TACCGTTTGT 540

CTTGTTTGGT ATTGATTGAC GAATGCTCAA AAATAATCTC ATTAATGCTT AGCGCAGTCT 600

CTCTATCGCT TCTGAACCCC GGTGCACCTG TGCCGAAACG CAAATGGGGA AACACCCGCT 660

TTTTGGATGA TTATGCATTG TCTCCACATT GTATGCTTCC AAGATTCTGG TGGGAATACT 720

GCTGATAGCC TAACGTTCAT GATCAAAATT TAACTGTTCT AACCCCTACT TGACAGCAAT 780

ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT 840

ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA 900

CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAATG CAATTCAACT GGAATATTAA 960

AACTGTGGCA AGTATTTTGT CCGCTCTCAC ACTAGCACAA GCAAGTGATC AGGAGGCTAT 1020

TGCTCCAGAG GACTCTCATG TCGTCAAATT GACTGAAGCC ACTTTTGAGT CTTTCATCAC 1080

CAGTAATCCT CACGTTTTGG CAGAGTTTTT TGCCCCTTGG TGTGGTCACT GTAAGAAGTT 1140

GGGCCCTGAA CTTGTTTCTG CTGCCGAGAT CTTAAAGGAC AATGAGCAGG TTAAGATTGC 1200

TCAAATTGAT TGTACGGAGG AGAAGGAATT ATGTCAAGGC TACGAAATTA AAGGGTATCC 1260

TACTTTGAAG GTGTTCCATG GTGAGGTTGA GGTCCCAAGT GACTATCAAG GTCAAAGACA 1320

GAGCCAAAGC ATTGTCAGCT ATATGCTAAA GCAGAGTTTA CCCCCTGTCA GTGAAATCAA 1380

TGCAACCAAA GATTTAGACG ACACAATCGC CGAGGCAAAA GAGCCCGTGA TTGTGCAAGT 1440

ACTACCGGAA GATGCATCCA ACTTGGAATC TAACACCACA TTTTACGGAG TTGCCGGTAC 1500

TCTCAGAGAG AAATTCACTT TTGTCTCCAC TAAGTCTACT GATTATGCCA AAAAATACAC 1560

TAGCGACTCG ACTCCTGCCT ATTTGCTTGT CAGACCTGGC GAGGAACCTA GTGTTTACTC 1620

TGGTGAGGAG TTAGATGAGA CTCATTTGGT GCACTGGATT GATATTGAGT CCAAACCTCT 1680

ATTTGGAGAC ATTGACGGAT CCACCTTCAA ATCATATGCT GAAGCTAACA TCCCTTTAGC 1740

CTACTATTTC TATGAGAACG AAGAACAACG TGCTGCTGCT GCCGATATTA TTAAACCTTT 1800

TGCTAAAGAG CAACGTGGCA AAATTAACTT TGTTGGCTTA GATGCCGTTA AATTCGGTAA 1860

GCATGCCAAG AACTTAAACA TGGATGAAGA GAAACTCCCT CTATTTGTCA TTCATGATTT 1920

GGTGAGCAAC AAGAAGTTTG GAGTTCCTCA AGACCAAGAA TTGACGAACA AAGATGTGAC 1980

CGAGCTGATT GAGAAATTCA TCGCAGGAGA GGCAGAACCA ATTGTGAAAT CAGAGCCAAT 2040

TCCAGAAATT CAAGAAGAGA AAGTCTTCAA GCTAGTCGGA AAGGCCCACG ATGAAGTTGT 2100

CTTCGATGAA TCTAAAGATG TTCTAGTCAA GTACTACGCC CCTTGGTGTG GTCACTGTAA 2160

GAGAATGGCT CCTGCTTATG AGGAATTGGC TACTCTTTAC GCCAATGATG AGGATGCCTC 2220

TTCAAAGGTT GTGATTGCAA AACTTGATCA CACTTTGAAC GATGTCGACA ACGTTGATAT 2280

TCAAGGTTAT CCTACTTTGA TCCTTTATCC AGCTGGTGAT AAATCCAATC CTCAACTGTA 2340

TGATGGATCT CGTGACCTAG AATCATTGGC TGAGTTTGTA AAGGAGAGAG GAACCCACAA 2400

AGTGGATGCC CTAGCACTCA GACCAGTCGA GGAAGAAAAG GAAGCTGAAG AAGAAGCTGA 2460

AAGTGAGGCA GACGCTCACG ACGAGCTTTA ATCTAGAACA AAAACTCATC TCAGAAGAGG 2520

ATCTGAATAG CGCCGTCGAC CATCATCATC ATCATCATTG AGTTTGTAGC CTTAGACATG 2580

ACTGTTCCTC AGTTCAAGTT GGGCACTTAC GAGAAGACCG GTCTTGCTAG ATTCTAATCA 2640

AGAGGATGTC AGAATGCCAT TTGCCTGAGA GATGCAGGCT TCATTTTTGA TACTTTTTTA 2700

TTTGTAACCT ATATAGTATA GGATTTTTTT TGTCATTTTG TTTCTTCTCG TACGAGCTTG 2760

CTCCTGATCA GCCTATCTCG CAGCTGATGA ATATCTTGTG GTAGGGGTTT GGGAAAATCA 2820

TTCGAGTTTG ATGTTTTTCT TGGTATTTCC CACTCCTCTT CAGAGTACAG AAGATTAAGT 2880

GAGACCTTCG TTTGTGC 2897

Claims (17)

1.一种表达载体，其特征在于，以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI表达盒是序列表中SEQ IDNo:3的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQ ID No:1的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI表达盒连接在所述pPICZαA载体的BglII位点。

5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列连接在所述pPICZαA载体的BamHI位点。

6.根据权利要求1-5任一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在毕赤酵母中进行表达。

7.权利要求1-6任一项所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-YPSΔ；

(2)将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI；

(3)以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；

(4)将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)之前，以毕赤酵母基因组DNA为模板，以C端非功能区序列引物YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端非功能区序列，以N端非功能区序列引物YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端非功能区序列；其中：

YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’

YPS-c-R：5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’

YPS-N-F：5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’

YPS-N-R：5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体的BamHI位点。

10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，以PDI基因序列为模板，设计引物，在上游引物添加Bsp119I限制性内切酶位点，下游引物添加Xba I限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119I和Xba I双酶切，连接至pPICZαA表达载体中，获得pPICZαA-PDI载体，其中：

上游引物PDI-bspU：5'-GCGTTCGAAATGCAATTCAACTGGAATAT-3'

下游引物PDI-xbaL：5'-CCGTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCT-3'。

11.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR采用的引物是：

PDI-EG-F:5'-ttggtcatgagatcagatctAACATCCAAAGACGAAAGGTTG-3'

PDI-EG-R:5'-cgtctttggatgttagatctGCACAAACGAAGGTCTCACTTA-3'。

12.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(4)中，PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ的BglII位点。

13.权利要求1-6任一项所述的表达载体在表达外源蛋白中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。

15.一种外源蛋白的表达方法，其特征在于，包括：将外源蛋白基因连接至权利要求1-6任一项所述的表达载体，获得重组表达载体，并在毕赤酵母中表达所述重组表达载体。

16.根据权利15所述的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将外源蛋白基因标记为insert，以外源蛋白基因序列为模板，设计引物，在上游引物中添加Xho I酶切位点CTCGAG，同时在Xho I酶切位点后添加AAAAGA，在下游引物中添加Not I限制性酶切位点GCGGCCGC，经PCR获得目的基因；

(2)将步骤(1)获得的目的基因与权利要求1-6任一项所述的表达载体进行Xho I和NotI双酶切，并连接，转化大肠杆菌，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert；

(3)对步骤(2)获得的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert在YPS1的C端和N端非功能区序列之间进行EcoR I线性化，YPS1的C端和N端序列作为同源重组交换同源臂，经电转化插入毕赤酵母基因组；

(4)Zeocin筛选与外源蛋白表达。

17.根据权利要求15或16所述的表达方法，其特征在于，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。