CN112358537A - 一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：步骤S1：重组质粒构建；步骤S2：感受态细胞制备；步骤S3：质粒的线性化；步骤S4：电转化；步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；步骤S7：放大纯化；在基因合成的过程中对hEGF的基因进行了密码子的优化，且后期的表达小试进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，因此极大地提高了该蛋白的表达量，缩短了蛋白质纯化时间至2h，极大地保障了蛋白活性；通过将重组hEGF质粒转化至毕赤酵母GS115宿主细胞中，利用甲醇诱导，最终通过离子交化层析得到高纯度的目的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法。
背景技术
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质。是由53个氨基酸组成的小分子多肤，分子量约为6KDa，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗，EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用，现有的重组hEGF在制备过程中蛋白表达量低，且纯化时间较长，纯化效果一般。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法。
本发明要解决的技术问题：
现有的重组hEGF在制备过程中蛋白表达量低，且纯化时间较长，纯化效果一般。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：
步骤S1：重组质粒构建；
步骤S2：感受态细胞制备；
步骤S3：质粒的线性化；
步骤S4：电转化；
步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；
步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；
步骤S7：放大纯化。
进一步，步骤S1的具体步骤如下：
步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；
重组hEGF质粒的基因序列为:
MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*。
进一步，步骤S2的具体步骤如下：
步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；
步骤S22：将挑选步骤S21得到的克隆菌体中长势最好的菌体至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL已灭菌的体积浓度为50％的甘油，混合均匀后，在温度为-20℃的条件下，进行保温备用，制得第一克隆菌液；
步骤S23：将步骤S22制得的第一克隆菌液50μL接种至含有50μg/mLchloramphenicol的YPD液态培养基中，在温度为30℃的条件下，过夜培养至OD600为1.3-1.5，制得第二克隆菌液；
步骤S24：将离心机预冷至4℃，将步骤S23制得的第二克隆菌液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水50mL重悬沉淀，得到第一悬浮液；
步骤S25：将离心机预冷至4℃，将步骤S24制得的第一悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水25mL重悬沉淀，得到第二悬浮液；
步骤S26：将离心机预冷至4℃，将步骤S25制得的第二悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇25mL重悬沉淀，得到第三悬浮液；
步骤S27：将离心机预冷至4℃，将步骤S26制得的第三悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇500μL重悬沉淀，得到第四悬浮液，将第四悬浮液分装至预冷至4℃的已灭菌的1.5mL离心管中，每管100μL，在-80℃的条件下，进行冻存，制得感受态细胞。
进一步，步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将步骤S11制得的重组hEGF质粒用限制性内切酶SacⅠ，在1.5mL离心管中，温度为37℃的条件下，温浴1-2h，制得初酶切液；
步骤S32：将步骤S31制得的初酶切液进行琼脂糖凝胶电泳检测，对未完全酶切的初酶切液用限制性内切酶SacⅠ，继续温育至完全酶切，制得酶切完全液；
步骤S33：向步骤S32制得的酶切完全液中加入500μL的IPA混合均匀后，加入100μLpH值为5.2含3M NaAc-HAc的乙酸钠溶液混合均匀后，用以预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清液，得到第一沉淀物；
步骤S34：将步骤S33得到沉淀物用体积分数75％的乙醇，进行重悬后，用预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min，用移液器去除上清，并烘干乙醇，第二沉淀物；
步骤S35：用10μL ddH2O重悬并溶解沉淀步骤S34制得的第二沉淀物，制得线性化质粒溶液，至于冰上备用。
进一步，步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S27制得感受态细胞至于冰上，进行融化2min；
步骤S42：将5μL步骤S35制得的线性化质粒溶液加入已融化的感受态细胞中混合均匀后，加入预冷至4℃的电转杯中，将电转杯至于冰上5min；
步骤S43：将电转杯，在电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω的条件下，进行电击10msec，得到电转液；
步骤S44：将步骤S43得到电转液与500μL预冷的至4℃的1M山梨醇混合均匀后，加入灭菌的1.5mL离心管中，静置20min后，加入500μL的YPD液态培养基，在温度为30℃的条件下，进行培养2h，制得培养菌液；
步骤S45：将步骤S44制得的培养菌液取100μL涂布在YPD固态培养平板中，在温度为30℃的条件下，进行导致培养2-3天，制得菌落。
进一步，步骤S5的具体步骤如下：
步骤S51：取灭菌的24孔摇菌板，向其中20孔中加入含50μg/mLchloramphenicol的无菌BMGY培养基；
步骤S52：取22个PCR反应管，在每个管中均配制PCR反应体系；
步骤S53：用灭菌牙签从步骤S45制得的菌落中挑选20个单克隆菌落，将沾有菌落的一头放入PCR反应管涮一次后，再将其放入已准备好的摇菌板中涮一次，向剩余的两个PCR反应管中分别加入1μL双蒸水和1μL阳性菌液；
步骤S54：PCR反应管盖好管盖，放入PCR仪中，进行PCR反应；
步骤S55：将摇菌板，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行培养至OD600为2-6。
进一步，步骤S6所述的无菌BMGY培养基的成分为1％Yeast Extract，2％Peptone，1.34％YNB，100mM Phosphate Buffer，1％Glycerol，4×10-5％Biotin，pH6.0。
进一步，步骤S6的具体步骤如下：
步骤S61：将步骤S55完成培养的摇菌板中的培养孔中取500μL培养物加入已灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL体积分数为50％的甘油，在温度为-20℃的条件下，进行保存；
步骤S62：将步骤S61中的摇菌板置于预冷至4℃的离心机中，在转速为1500r/min的条件下，进行离心10min后，将每孔中的上清液去除，向每孔中加入4mL含50μg/mLchloramphenicol的BMMY液体培氧基，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行诱导72h，诱导期间每隔24h向每孔中加入20-40μL的甲醇，诱导完成后，在转速为1500r/min的条件下，进行离心5min，去除上清；
步骤S63：用Lysis Buffer1mL对步骤S62得到的沉淀进行重悬后，在Φ3，25％，2son/8s off，10min的条件下，超声波破碎后，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min后，取离心至新的1.5mL离心管中，加入10μL Ni-NTA，在温度为4℃的条件下，进行孵育1h后，在转速为3000r/min的条件下，离心5min，去除上清980μL后，加入20μL 5×LoadingBuffer混合均匀后，沸水浴10min，制得缓冲液破碎上清；
步骤S64：用SDS-PAGE电泳与Western Blot对步骤S63制得的缓冲液破碎上清进行检测。
进一步，步骤S7的具体步骤如下：
步骤S71：挑选表达最优的单克隆菌落进行体积放大培养，用Q Sepharose FastFlow凝胶进行离子交换层析，制得最终蛋白。
本发明的有益效果：本发明在基因合成的过程中对hEGF的基因进行了密码子的优化，且后期的表达小试进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，因此极大地提高了该蛋白的表达量；在载体构建中使用了无缝克隆的技术，将目的基因设计成hEGF-hEGF串联形式，再亚克隆至pPIC9K中，目的基因无标签、无信号肽，通过离子交换层析(Q SepharoseFast Flow)得到最终蛋白，缩短整个纯化时间至2h，低温操作，极大地保障了蛋白活性；通过将重组hEGF质粒转化至毕赤酵母GS115宿主细胞中，利用甲醇诱导，最终通过离子交化层析得到高纯度的目的蛋白，最终蛋白通过HPLC检测，纯度100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HPLC技术检测最终蛋白纯度结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：
步骤S1：重组质粒构建；
步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；
重组hEGF质粒的基因序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*；
步骤S2：感受态细胞制备；
步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；
步骤S22：将挑选步骤S21得到的克隆菌体中长势最好的菌体至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL已灭菌的体积浓度为50％的甘油，混合均匀后，在温度为-20℃的条件下，进行保温备用，制得第一克隆菌液；
步骤S23：将步骤S22制得的第一克隆菌液50μL接种至含有50μg/mLchloramphenicol的YPD液态培养基中，在温度为30℃的条件下，过夜培养至OD600为1.3，制得第二克隆菌液；
步骤S24：将离心机预冷至4℃，将步骤S23制得的第二克隆菌液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水50mL重悬沉淀，得到第一悬浮液；
步骤S25：将离心机预冷至4℃，将步骤S24制得的第一悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水25mL重悬沉淀，得到第二悬浮液；
步骤S26：将离心机预冷至4℃，将步骤S25制得的第二悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇25mL重悬沉淀，得到第三悬浮液；
步骤S27：将离心机预冷至4℃，将步骤S26制得的第三悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇500μL重悬沉淀，得到第四悬浮液，将第四悬浮液分装至预冷至4℃的已灭菌的1.5mL离心管中，每管100μL，在-80℃的条件下，进行冻存，制得感受态细胞；
步骤S3：质粒的线性化；
步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将步骤S11制得的重组hEGF质粒用限制性内切酶SacⅠ，在1.5mL离心管中，温度为37℃的条件下，温浴1h，制得初酶切液；
步骤S32：将步骤S31制得的初酶切液进行琼脂糖凝胶电泳检测，对未完全酶切的初酶切液用限制性内切酶SacⅠ，继续温育至完全酶切，制得酶切完全液；
步骤S33：向步骤S32制得的酶切完全液中加入500μL的IPA混合均匀后，加入100μLpH值为5.2含3M NaAc-HAc的乙酸钠溶液混合均匀后，用以预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清液，得到第一沉淀物；
步骤S34：将步骤S33得到沉淀物用体积分数75％的乙醇，进行重悬后，用预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min，用移液器去除上清，并烘干乙醇，第二沉淀物；
步骤S35：用10μL ddH2O重悬并溶解沉淀步骤S34制得的第二沉淀物，制得线性化质粒溶液，至于冰上备用；
步骤S4：电转化；
步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S27制得感受态细胞至于冰上，进行融化2min；
步骤S42：将5μL步骤S35制得的线性化质粒溶液加入已融化的感受态细胞中混合均匀后，加入预冷至4℃的电转杯中，将电转杯至于冰上5min；
步骤S43：将电转杯，在电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω的条件下，进行电击10msec，得到电转液；
步骤S44：将步骤S43得到电转液与500μL预冷的至4℃的1M山梨醇混合均匀后，加入灭菌的1.5mL离心管中，静置20min后，加入500μL的YPD液态培养基，在温度为30℃的条件下，进行培养2h，制得培养菌液；
步骤S45：将步骤S44制得的培养菌液取100μL涂布在YPD固态培养平板中，在温度为30℃的条件下，进行导致培养2天，制得菌落；
步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；
步骤S5的具体步骤如下：
步骤S51：取灭菌的24孔摇菌板，向其中20孔中加入含50μg/mL chloramphenicol的无菌BMGY培养基；
步骤S52：取22个PCR反应管，在每个管中均配制PCR反应体系；
步骤S53：用灭菌牙签从步骤S45制得的菌落中挑选20个单克隆菌落，将沾有菌落的一头放入PCR反应管涮一次后，再将其放入已准备好的摇菌板中涮一次，向剩余的两个PCR反应管中分别加入1μL双蒸水和1μL阳性菌液；
步骤S54：PCR反应管盖好管盖，放入PCR仪中，进行PCR反应；
步骤S55：将摇菌板，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行培养至OD600为2；
步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；
步骤S61：将步骤S55完成培养的摇菌板中的培养孔中取500μL培养物加入已灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL体积分数为50％的甘油，在温度为-20℃的条件下，进行保存；
步骤S62：将步骤S61中的摇菌板置于预冷至4℃的离心机中，在转速为1500r/min的条件下，进行离心10min后，将每孔中的上清液去除，向每孔中加入4mL含50μg/mLchloramphenicol的BMMY液体培氧基，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行诱导72h，诱导期间每隔24h向每孔中加入20μL的甲醇，诱导完成后，在转速为1500r/min的条件下，进行离心5min，去除上清；
步骤S63：用Lysis Buffer1mL对步骤S62得到的沉淀进行重悬后，在Φ3，25％，2son/8s off，10min的条件下，超声波破碎后，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min后，取离心至新的1.5mL离心管中，加入10μL Ni-NTA，在温度为4℃的条件下，进行孵育1h后，在转速为3000r/min的条件下，离心5min，去除上清980μL后，加入20μL 5×LoadingBuffer混合均匀后，沸水浴10min，制得缓冲液破碎上清；
步骤S64：用SDS-PAGE电泳与Western Blot对步骤S63制得的缓冲液破碎上清进行检测；
步骤S7：放大纯化；
步骤S71：挑选表达最优的单克隆菌落进行体积放大培养，用Q Sepharose FastFlow凝胶进行离子交换层析，制得最终蛋白。
实施例2
一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：
步骤S1：重组质粒构建；
步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；
重组hEGF质粒的基因序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*；
步骤S2：感受态细胞制备；
步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；
步骤S22：将挑选步骤S21得到的克隆菌体中长势最好的菌体至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL已灭菌的体积浓度为50％的甘油，混合均匀后，在温度为-20℃的条件下，进行保温备用，制得第一克隆菌液；
步骤S23：将步骤S22制得的第一克隆菌液50μL接种至含有50μg/mLchloramphenicol的YPD液态培养基中，在温度为30℃的条件下，过夜培养至OD600为1.5，制得第二克隆菌液；
步骤S24：将离心机预冷至4℃，将步骤S23制得的第二克隆菌液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水50mL重悬沉淀，得到第一悬浮液；
步骤S25：将离心机预冷至4℃，将步骤S24制得的第一悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水25mL重悬沉淀，得到第二悬浮液；
步骤S26：将离心机预冷至4℃，将步骤S25制得的第二悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇25mL重悬沉淀，得到第三悬浮液；
步骤S27：将离心机预冷至4℃，将步骤S26制得的第三悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇500μL重悬沉淀，得到第四悬浮液，将第四悬浮液分装至预冷至4℃的已灭菌的1.5mL离心管中，每管100μL，在-80℃的条件下，进行冻存，制得感受态细胞；
步骤S3：质粒的线性化；
步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将步骤S11制得的重组hEGF质粒用限制性内切酶SacⅠ，在1.5mL离心管中，温度为37℃的条件下，温浴1-2h，制得初酶切液；
步骤S32：将步骤S31制得的初酶切液进行琼脂糖凝胶电泳检测，对未完全酶切的初酶切液用限制性内切酶SacⅠ，继续温育至完全酶切，制得酶切完全液；
步骤S33：向步骤S32制得的酶切完全液中加入500μL的IPA混合均匀后，加入100μLpH值为5.2含3M NaAc-HAc的乙酸钠溶液混合均匀后，用以预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清液，得到第一沉淀物；
步骤S34：将步骤S33得到沉淀物用体积分数75％的乙醇，进行重悬后，用预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min，用移液器去除上清，并烘干乙醇，第二沉淀物；
步骤S35：用10μL ddH2O重悬并溶解沉淀步骤S34制得的第二沉淀物，制得线性化质粒溶液，至于冰上备用；
步骤S4：电转化；
步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S27制得感受态细胞至于冰上，进行融化2min；
步骤S42：将5μL步骤S35制得的线性化质粒溶液加入已融化的感受态细胞中混合均匀后，加入预冷至4℃的电转杯中，将电转杯至于冰上5min；
步骤S43：将电转杯，在电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω的条件下，进行电击10msec，得到电转液；
步骤S44：将步骤S43得到电转液与500μL预冷的至4℃的1M山梨醇混合均匀后，加入灭菌的1.5mL离心管中，静置20min后，加入500μL的YPD液态培养基，在温度为30℃的条件下，进行培养2h，制得培养菌液；
步骤S45：将步骤S44制得的培养菌液取100μL涂布在YPD固态培养平板中，在温度为30℃的条件下，进行导致培养3天，制得菌落；
步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；
步骤S5的具体步骤如下：
步骤S51：取灭菌的24孔摇菌板，向其中20孔中加入含50μg/mL chloramphenicol的无菌BMGY培养基；
步骤S52：取22个PCR反应管，在每个管中均配制PCR反应体系；
步骤S53：用灭菌牙签从步骤S45制得的菌落中挑选20个单克隆菌落，将沾有菌落的一头放入PCR反应管涮一次后，再将其放入已准备好的摇菌板中涮一次，向剩余的两个PCR反应管中分别加入1μL双蒸水和1μL阳性菌液；
步骤S54：PCR反应管盖好管盖，放入PCR仪中，进行PCR反应；
步骤S55：将摇菌板，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行培养至OD600为6；
步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；
步骤S61：将步骤S55完成培养的摇菌板中的培养孔中取500μL培养物加入已灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL体积分数为50％的甘油，在温度为-20℃的条件下，进行保存；
步骤S62：将步骤S61中的摇菌板置于预冷至4℃的离心机中，在转速为1500r/min的条件下，进行离心10min后，将每孔中的上清液去除，向每孔中加入4mL含50μg/mLchloramphenicol的BMMY液体培氧基，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行诱导72h，诱导期间每隔24h向每孔中加入40μL的甲醇，诱导完成后，在转速为1500r/min的条件下，进行离心5min，去除上清；
步骤S63：用Lysis Buffer1mL对步骤S62得到的沉淀进行重悬后，在Φ3，25％，2son/8s off，10min的条件下，超声波破碎后，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min后，取离心至新的1.5mL离心管中，加入10μL Ni-NTA，在温度为4℃的条件下，进行孵育1h后，在转速为3000r/min的条件下，离心5min，去除上清980μL后，加入20μL 5×LoadingBuffer混合均匀后，沸水浴10min，制得缓冲液破碎上清；
步骤S64：用SDS-PAGE电泳与Western Blot对步骤S63制得的缓冲液破碎上清进行检测；
步骤S7：放大纯化；
步骤S71：挑选表达最优的单克隆菌落进行体积放大培养，用Q Sepharose FastFlow凝胶进行离子交换层析，制得最终蛋白。
实施例3
对实施例2制得的最终蛋白进行利用HPLC技术检测纯度，检测结果如图1所示。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1：重组质粒构建；
步骤S2：感受态细胞制备；
步骤S3：质粒的线性化；
步骤S4：电转化；
步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；
步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；
步骤S7：放大纯化。
2.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S1的具体步骤如下：
步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；
重组hEGF质粒的基因序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*。
3.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S2的具体步骤如下：
步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；
步骤S22：将挑选步骤S21得到的克隆菌体中长势最好的菌体至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL已灭菌的体积浓度为50％的甘油，混合均匀后，在温度为-20℃的条件下，进行保温备用，制得第一克隆菌液；
步骤S23：将步骤S22制得的第一克隆菌液50μL接种至含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基中，在温度为30℃的条件下，过夜培养至OD600为1.3-1.5，制得第二克隆菌液；
步骤S24：将离心机预冷至4℃，将步骤S23制得的第二克隆菌液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水50mL重悬沉淀，得到第一悬浮液；
步骤S25：将离心机预冷至4℃，将步骤S24制得的第一悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水25mL重悬沉淀，得到第二悬浮液；
步骤S26：将离心机预冷至4℃，将步骤S25制得的第二悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇25mL重悬沉淀，得到第三悬浮液；
步骤S27：将离心机预冷至4℃，将步骤S26制得的第三悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇500μL重悬沉淀，得到第四悬浮液，将第四悬浮液分装至预冷至4℃的已灭菌的1.5mL离心管中，每管100μL，在-80℃的条件下，进行冻存，制得感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将步骤S11制得的重组hEGF质粒用限制性内切酶SacⅠ，在1.5mL离心管中，温度为37℃的条件下，温浴1-2h，制得初酶切液；
步骤S32：将步骤S31制得的初酶切液进行琼脂糖凝胶电泳检测，对未完全酶切的初酶切液用限制性内切酶SacⅠ，继续温育至完全酶切，制得酶切完全液；
步骤S33：向步骤S32制得的酶切完全液中加入500μL的IPA混合均匀后，加入100μLpH值为5.2含3M NaAc-HAc的乙酸钠溶液混合均匀后，用以预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清液，得到第一沉淀物；
步骤S34：将步骤S33得到沉淀物用体积分数75％的乙醇，进行重悬后，用预冷至4℃的离心机，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min，用移液器去除上清，并烘干乙醇，第二沉淀物；
步骤S35：用10μL ddH2O重悬并溶解沉淀步骤S34制得的第二沉淀物，制得线性化质粒溶液，至于冰上备用。
5.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S27制得感受态细胞至于冰上，进行融化2min；
步骤S42：将5μL步骤S35制得的线性化质粒溶液加入已融化的感受态细胞中混合均匀后，加入预冷至4℃的电转杯中，将电转杯至于冰上5min；
步骤S43：将电转杯，在电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω的条件下，进行电击10msec，得到电转液；
步骤S44：将步骤S43得到电转液与500μL预冷的至4℃的1M山梨醇混合均匀后，加入灭菌的1.5mL离心管中，静置20min后，加入500μL的YPD液态培养基，在温度为30℃的条件下，进行培养2h，制得培养菌液；
步骤S45：将步骤S44制得的培养菌液取100μL涂布在YPD固态培养平板中，在温度为30℃的条件下，进行导致培养2-3天，制得菌落。
6.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S5的具体步骤如下：
步骤S51：取灭菌的24孔摇菌板，向其中20孔中加入含50μg/mL chloramphenicol的无菌BMGY培养基；
步骤S52：取22个PCR反应管，在每个管中均配制PCR反应体系；
步骤S53：用灭菌牙签从步骤S45制得的菌落中挑选20个单克隆菌落，将沾有菌落的一头放入PCR反应管涮一次后，再将其放入已准备好的摇菌板中涮一次，向剩余的两个PCR反应管中分别加入1μL双蒸水和1μL阳性菌液；
步骤S54：PCR反应管盖好管盖，放入PCR仪中，进行PCR反应；
步骤S55：将摇菌板，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行培养至OD600为2-6。
7.根据权利要求6所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S6所述的无菌BMGY培养基的成分为1％Yeast Extract，2％Peptone，1.34％YNB，100mMPhosphate Buffer，1％Glycerol，4×10-5％Biotin，pH6.0。
8.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S6的具体步骤如下：
步骤S61：将步骤S55完成培养的摇菌板中的培养孔中取500μL培养物加入已灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL体积分数为50％的甘油，在温度为-20℃的条件下，进行保存；
步骤S62：将步骤S61中的摇菌板置于预冷至4℃的离心机中，在转速为1500r/min的条件下，进行离心10min后，将每孔中的上清液去除，向每孔中加入4mL含50μg/mLchloramphenicol的BMMY液体培氧基，在温度为30℃，转速为220r/min的条件下，进行诱导72h，诱导期间每隔24h向每孔中加入20-40μL的甲醇，诱导完成后，在转速为1500r/min的条件下，进行离心5min，去除上清；
步骤S63：用Lysis Buffer1mL对步骤S62得到的沉淀进行重悬后，在Φ3，25％，2s on/8s off，10min的条件下，超声波破碎后，在转速为12000r/min的条件下，进行离心2min后，取离心至新的1.5mL离心管中，加入10μL Ni-NTA，在温度为4℃的条件下，进行孵育1h后，在转速为3000r/min的条件下，离心5min，去除上清980μL后，加入20μL 5×Loading Buffer混合均匀后，沸水浴10min，制得缓冲液破碎上清；
步骤S64：用SDS-PAGE电泳与Western Blot对步骤S63制得的缓冲液破碎上清进行检测。
9.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S7的具体步骤如下：
步骤S71：挑选表达最优的单克隆菌落进行体积放大培养，用Q Sepharose Fast Flow凝胶进行离子交换层析，制得最终蛋白。
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