CN104120143A - 一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用。利用PCR方法从犬外周血淋巴细胞扩增出犬白细胞介素-2成熟蛋白基因，将该基因连接到酵母表达载体pPICZaA上，构建出重组犬白细胞介素-2成熟蛋白基因重组载体，并通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。犬白细胞介素-2在毕赤酵母中获得了高效表达，表达的重组蛋白具有很好的生物学活性。本发明生产成本低，生产效率高，生物活性好，适合企业化生产。

Description

一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用

一、技术领域

本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用。

二、背景技术

白细胞介素-2（IL-2），可以活化T细胞、NK细胞、巨噬细胞，促进B细胞分泌抗体，诱导T细胞分泌细胞因子，能全面提高机体的细胞免疫和体液免疫功能，是重要的免疫调节因子。因此，IL-2可作为免疫增强剂来提高疫苗的免疫效果。此外，IL-2也可作为一种免疫治疗剂来使用。有研究报道，IL-2可用于动物的免疫疗法，并对肿瘤有良好的治疗作用。1983年Taniguchi等成功克隆了人IL-2基因，此后30多种动物的IL-2基因相继被成功克隆，且已获得IL-2基因重组蛋白。与其他动物相比，犬IL-2（CaIL-2）的研究相对滞后。

1995年Knapp DW等首次报道克隆到CaIL-2 cDNA，相关研究进入到另一个阶段，但一直以来，对重组蛋白的研究很少，且多在原核表达，国内外至今尚未有真核表达的相关报道。20世纪90年代以来，以毕赤酵母(P.Pastoris)为代表的嗜甲醇酵母，作为一种新的外源蛋白表达系统，在基因工程领域中得到日益广泛的应用。酵母系统生产方便，并可对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰，而且蛋白表达后的纯化过程也极其简单，弥补了原核表达系统的不足。

三、发明内容

（一）技术问题

本发明需要解决的问题是提供一种重组犬白细胞介素-2的体外制备方法及其应用。 

（二）技术方案

1、犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的扩增

无菌采犬外周静脉血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞并活化，提取淋巴细胞总RNA。根据GenBank中所公布的犬IL-2基因序列，在编码成熟蛋白基因的两端设计一对引物，用于扩增出犬IL-2成熟蛋白基因。

2、含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定

利用通过RT-PCR扩增的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因前后两端的酶切位

点，将犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的酵母载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经酶切后电泳，能获得大小为408bp的条带的质粒可以鉴定为已连接上犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母表达载体。

3、含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酵母表达载体电转化入酵母菌

制备毕赤酵母菌株X33的感受态细胞，取80 μl与5-10 μg SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，把电转化杯在冰上放置5 min后再在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1500 V，电容25 μF，电阻200 Ω，温度0℃。电击结束，立即加入1 ml冰预冷的1 mol/L山梨醇，轻轻混匀，把电转化杯放入28℃温育30 min左右，再取100 μl转化后的菌液涂在含有Zeocin抗生素的YPDS固体培养基平板上，置28℃恒温培养2-4 d，能在YPDS上生长的菌落为阳性转化子。

4、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的鉴定

根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物。将筛选得到的重组高拷贝菌株，提取酵母染色体DNA，用引物PCR扩增鉴定整合上CaIL-2基因的酵母菌株。

5、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的诱导表达

挑取阳性克隆单菌落转接至BMGY中，28℃摇床培养至OD600=2-6时，室温1,500 g离心5 min收获细胞，将收获的细胞用BMMY培养液重悬，28℃摇床振荡培养诱导表达，每24 h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.5%，以保持诱导的持续表达，在诱导72 h时收集培养上清备用。

6、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株表达产物的初步纯化

将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50 mM的Tris-HCI缓冲液溶解，装入透析袋用50 mM的Tris-HCI透析除去杂质，再用PH7.2左右的PBS于4℃搅拌透析36-48 h，然后用PEG20000浓缩蛋白，最后用滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。

7、重组酵母CaIL-2生物活性的测定

     采用MTT法测定重组酵母CaIL-2是否具有生物活性。

本发明中克隆的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因序列如下：

gcacctatta cttcaagctc tacaaaggaa acagagcaac agatggagca attactgctg 60

gatttacagt tgcttttgaa tggagttaat aattatgaga acccccaact ctccaggatg 120 

ctcacattta agttttacac gcccaagaag gccacagaat ttacacacct tcaatgtcta 180

gcagaagaac tcaaaaacct ggaggaagtg ctaggtttac ctcaaagcaa aaacgttcac 240

ttgacagaca ccaaggaatt aatcagcaat atgaatgtaa cacttctgaa actaaaggga 300

tctgaaacaa gttacaactg tgaatatgat gacgagacag caaccattac agaatttctg 360

aacaaatgga ttaccttttg tcaaagcatc ttctcaacac tgacttga              408

该基因核苷酸序列与Genbank上登陆的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因序列（GenBank：D30710）同源性为100%。该基因与酵母表达载体pPICZa-A重组后，在毕赤酵母X33中获得了高效表达。本发明中制取的犬白细胞介素-2具有较高的生物活性。

本发明摸索出一套适用于酵母表达的犬白细胞介素-2的工艺，通过此流程生产出的犬白细胞介素-2具有生物活性。

（三）有益效果

   本发明采用的毕赤酵母基因工程菌生产的犬白细胞介素-2与用大肠杆菌表达的犬白细胞介素-2相比有以下几个优点：

    1、获得具有生物活性的重组犬白细胞介素-2方法和程序简单：只需收集表达的上清进行透析除盐处理后即可投入临床使用。本发明生产成本低，生产效率高。

    2、无毒害物质：酵母不会分泌有毒害的毒素。

3、生物活性高：用MTT法对酵母表达的犬白细胞介素-2进行生物活性测定，发现一定浓度的重组蛋白能够显著促进犬淋巴细胞增殖，可作为免疫增强剂和治疗剂广泛应用于犬的基础研究和临床应用。可制备成犬免疫增强剂和治疗犬肿瘤的药物。

四、附图说明

图1：犬白细胞介素-2成熟蛋白基因PCR产物电泳分析

1，DNA分子量标准；2，犬白细胞介素-2成熟蛋白基因PCR产物；3，阴性对照

图2：pPICZa-A-CaIL-2阳性克隆载体的酶切鉴定

1，DNA分子量标准；2,3，酶切的重组表达载体

图3：转化酵母的PCR鉴定

1，阴性重组酵母；2，DNA分子量标准；3,4，阳性重组酵母图4：重组酵母诱导表达的上清不同时段的SDS-PAGE电泳

1，阴性对照；2，重组酵母表达上清；3，浓缩后的上清；4，低分子量蛋白Marker；5-7，诱导24h、48h和72h的上清

五、具体实施方式

1、犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的扩增

（1）犬外周血淋巴细胞的分离和活化

无菌采犬外周静脉血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，PBS洗涤两到三次，离心，培养于含10%小牛血清的1640营养液，使细胞密度为5×10⁶/ml，然后加入ConA使终浓度为20 μg/mL，于5%CO₂、37℃培养18 h。

（2）细胞总RNA提取

将细胞分装入1.5 mL离心管中，3000 g离心5 min后彻底弃上清。Trizol试剂盒一步法提取淋巴细胞总RNA：加入200 μL Trizol Reagent，剧烈振荡。室温静置5 min。再加入40 μL氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置5 min后， 4℃ 12000 g离心15 min。小心将水相移至1.5 mL离心管中，再加入500 μL异丙醇，振荡混匀，-20℃静置30 min。4℃ 12000 g离心10 min。弃上清，加入500 μL 75%乙醇，振荡片刻后，室温静置5-15 min，7500 g离心5 min。弃上清，风干。用10-20 μl DEPC处理过的水溶解，-70℃保存。

（3）引物的设计与合成

根据GenBank中所公布的犬IL-2基因序列，在编码成熟蛋白基因的两端设计引物，上下游引物序列分别为：

P1：5’- GAATTCGCACCTATTACTTCAAGCTCTAC-3’；

P2：5’- TCTAGATCAAGTCAGTGTTGAGAAGATGC-3’。

在5’和3’端分别加上EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点。

（4）反转录cDNA的合成

20 μl反转录体系中含：25 mM MgCl₂ 4 μl，10×RNA PCR Buffer 2 μl，DEPC-H₂O 7.5 μl，2.5 mM dNTP mixture 2 μl，40 U/ul RNA Inhibitor 0.5 μl，5 U/μl AMV Reverse Transcriptase 1 μl，10 nM 下游引物 0.5 μl，RNA样品2.5 μl。充分混合后，42℃ 60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。

（5）PCR扩增PCR反应总体积20 μl：25 mM MgCl₂ 1.2 μl，10×PCR Buffer2 μl，2.5 mM dNTP mixture 1.8 ul，ddH₂O 8.5 μl，5 U/μl Taq酶0.5 μl，RT产物4 μl，10 nM P₁和P₂各0.6 μl。反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因大小为408bp（图1）。我们克隆的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因序列的测序结果（大连宝生物工程有限公司测序）与GenBank上公布的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因序列D30710比对同源性为100%。

2、含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定

利用通过RT-PCR扩增的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因前后两端的酶切位点，将犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的酵母载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经酶切后电泳，能获得大小为408bp的条带的质粒可以鉴定为已连接上犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母表达载体（图2）。

3、感受态酵母菌的制备

挑取毕赤酵母X-33平板上的单菌落接于2ml YPD试管中，28℃ 250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500μl的活化后酵母菌液转接于50ml的含有无菌5ml YPD培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床250rpm培养20h左右。待菌液OD₆₀₀=1.3-1.5时，4℃ 1500rpm离心4min收获细胞。细胞依次用1000ml冰预冷水和1000ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃ 1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，分装不同的EP管后，置4℃待用。

4、含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因酵母表达载体电转化入酵母菌

取80 μl与5-10 μg SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，把电转化杯在冰上放置5 min后再在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1500 V，电容25 μF，电阻200 Ω，温度0℃。电击结束，立即加入1 ml冰预冷的1 mol/L山梨醇，轻轻混匀，把电转化杯放入28℃温育30 min左右，再取100 μl转化后的菌液涂在含有Zeocin抗生素的YPDS固体培养基平板上，置28℃恒温培养2-4 d，能在YPDS上生长的菌落为阳性转

化子。

5、用来鉴定阳性重组酵母菌的PCR引物根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物：

5’AOX1引物：5’-GACTGGTTCCAATTGAGAAGC-3’；

3’AOX1引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

6、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的鉴定

将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入EP管中，加100μl灭菌水，100℃煮10min，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30min，100℃煮10min，12000rpm/min离心取上清，以其中少量基因组DNA为模板，PCR扩增鉴定整合上CaIL-2基因的酵母菌株。发现以阳性克隆酵母菌株的染色体为模板的扩增出现了大小约为1,000 bp的条带，而阴性克隆仅扩增出大小500 bp左右的条带（图3）。

7、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的诱导表达

挑取阳性克隆单菌落转接至BMGY中，28℃摇床培养至OD600=2-6时，室温1,500 g离心5 min收获细胞，将收获的细胞用BMMY培养液重悬，28℃摇床振荡培养诱导表达，每24 h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.5%，以保持诱导的持续表达，在诱导72 h时收集培养上清备用。

8、含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株表达产物的初步纯化

将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50 mM的Tris-HCI缓冲液溶解，装入透析袋用50 mM的Tris-HCI透析除去杂质，再用PH7.2左右的PBS于4℃搅拌透析36-48 h，然后用PEG20000浓缩蛋白，最后用滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。将发酵上清浓缩10倍后进行SDS-PAGE电泳分析，发现在发酵上清的电泳分析图上均有一条非常明显的蛋白带，大小约为19 kD（图4）。

9、重组酵母CaIL-2生物活性的测定

无菌从犬前肢静脉采血，常规分离淋巴细胞，调整细胞密度至5.0×10⁶/mL，加入RPIM1640营养液培养，同时加入终浓度20 μg/mL ConA共培养48 h。离心收集细胞，细胞用RPIM1640营养液重悬，计数调整其浓度为5.0×10⁶/mL作为应答细胞。取无菌96孔板，每孔加入应答细胞50 μL，调零孔不加细胞。将样品分别稀释10¹、10²、10³和10⁴，以RPIM1640营养液作阴性对照，每孔加入样

品50 μL，每个组做6个重复孔。5% CO₂、37℃培养36 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，每孔加入SDS-N-N-二甲基甲酰胺100 μL，酶联免疫检测仪测定A₅₇₀值。SPSS软件分析结果发现，10³组和10⁴组与对照组相比差异均极显著，且10³组和10¹组与10²组相比差异显著，其它组无显著差异。说明一定浓度的重组酵母CaIL-2能够促进体外犬淋巴细胞的生长和增殖，本发明中的犬白细胞介素-2具有很好的生物活性。

Claims (4)

1.一种重组犬白细胞介素-2的制备方法，其特征是由以下步骤构成：

（1）重组载体pPICZaA-CaIL-2的构建：

根据genbank上公布的序列，设计一对引物，通过PCR方法扩增出犬白细胞介素-2成熟蛋白基因，将犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的PCR产物酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的pPICZaA酵母载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经EcoR I和Xba I酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，408bp大小的犬白细胞介素-2成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组pPICZaA-CaIL-2酵母表达载体已经构建成功；

（2）含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌：

制备毕赤酵母菌株X33的感受态细胞，取80 μl与5-10 μg SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，把电转化杯在冰上放置5 min后再在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件为电压1500 V，电容25 μF，电阻200 Ω，温度0℃，电击结束，立即加入1 ml冰预冷的1 mol/L山梨醇，轻轻混匀，把电转化杯放入28℃温育30 min左右，再取100 μl转化后的菌液涂在含有Zeocin抗生素的YPDS固体培养基平板上，置28℃恒温培养2-4 d，能在YPDS上生长的菌落为阳性转化子；

（3）含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的鉴定：

根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物，将筛选得到的重组高拷贝菌株，提取酵母染色体DNA，用引物PCR扩增鉴定整合上CaIL-2基因的酵母菌株；

（4）含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的诱导表达：

挑取阳性克隆单菌落转接至BMGY中，28℃摇床培养至OD600=2-6时，室温1,500 g离心5 min收获细胞，将收获的细胞用BMMY培养液重悬，28℃摇床振荡培养诱导表达，每24 h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.5%，以保持诱导的持续表达，在诱导72 h时收集培养上清备用；

（5）含犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株表达产物的初步纯化：

将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50 mM的Tris-HCI缓冲液溶解，装入透析袋用50 mM的Tris-HCI透析除去杂质，再用PH7.2的PBS于4℃搅拌透析36-48 h，期间换液两次，然后用PEG20000浓缩蛋白，最后用滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。

2.权利要求1所述重组犬白细胞介素-2的制备方法所构建的重组载体，其特征为含有犬白细胞介素-2成熟蛋白基因的酵母表达载体。

3.权利要求1所述重组犬白细胞介素-2制备方法所制备的犬白细胞介素-2重组蛋白在制备犬免疫增强剂中的应用。

4.权利要求1所述重组犬白细胞介素-2制备方法所制备的犬白细胞介素-2重组蛋白在制备治疗犬肿瘤药物中的应用。