一种含鸡α干扰素复合益生菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生态制剂技术领域。更具体地,涉及一种含鸡α干扰素复合益生菌剂及其制备方法。
背景技术
中国是最大的养禽国,然而病毒的流行一直困扰着中国养禽业,给养禽业造成了巨大的经济损失,近年来家禽肿瘤和病毒感染引起的鸡马立克病、新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、脑脊髓炎、流感、鸭肝炎等烈性传染性病毒性疾病成地方性流行趋势,给养禽业带来了每年数十亿元的经济损失,是当前养禽业发展的大敌,如何有效治疗家禽肿瘤和病毒感染性疾病一直是困扰禽病防治的重大难题之一。
目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段,化学药物的使用易造成耐药性,而且容易引起动物体内药物残留而影响人类健康,疫苗的研制则须考虑病毒变异和多样性。而应用抗生素易造成菌群失调、出现耐药性菌株及药物的不良反应。干扰素是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋白,具有抗病毒抗肿瘤和免疫调节等生物学活性;但市面上的干扰素产品多为注射液和粉针剂,生产成本高,后期分离纯化工艺复杂,且给药途径多为注射,操作繁琐,加大了人工成本,容易引发动物应激造成损伤,市场接受度不高。
微生态制剂是一种肠道菌群调节剂,目前应用于微生态制剂的益生菌种主要有乳酸菌类、芽孢杆菌和酵母菌等。微生态制剂安全无毒,具有提高生产性能、防治动物疾病、调节免疫功能、改善养殖环境和提高饲料转化率等多种功能,克服了应用抗生素造成的菌群失调、出现耐药性菌株及药物的不良反应,不仅可以防病治病,而且可以降低污染及改善环境,在实际生产中推广应用有着良好的经济效益和社会效益,有效促进我国养殖业的健康发展。在国外,微生态制剂在畜牧业上的作用日益明显,并且应用领域逐渐扩大,在水产养殖上也得到推广应用。目前微生态制剂存在的主要问题是储存期内活菌数低,储存期内不稳定,研制的微生态制剂远远达不到国家规定的标准,且菌型单一,含水量高,对胃酸和胆盐环境不稳定等,严重制约了微生态制剂产品的生产与应用。而且微生态制剂在调节动物肠道菌群,抑制致病菌方面效果明显,但益生菌种的复配很关键需严格筛选控制,且抗病毒效果很差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足,提供一种含鸡α干扰素的复合益生菌剂及其制备方法,解决了现有畜牧养殖应用过程中益生菌剂所存在的菌型单一,抗病毒效果差,储存期短等问题。同时还为鸡α干扰素提供了一种新的制备方法,此方法生产成本低,工艺简单,产品给药途径方便,市场接受度高。
本发明的目的是提供一种制备鸡α干扰素的方法。
本发明另一目的是提供一种含鸡α干扰素复合益生菌剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种制备鸡α干扰素粉末制剂的方法,步骤如下:
S1. 菌株发酵培养:将表达鸡α干扰素的重组菌株发酵,得发酵液;
S2. 发酵液中加入质量体积比0.03%~0.07%煮沸的苯甲酸,用陶瓷膜进行过滤或离心,得到清澈的发酵上清液体;
S3. 在发酵上清液体中加入质量体积比8%~12%的麦芽糊精溶解,按照进风口130~160℃、出风口70~90℃进行喷雾干燥,所得喷干粉即为所述鸡α干扰素粉末制剂。
优选地,步骤S2中加入质量体积比0.05%煮沸的苯甲酸。
优选地,步骤S3中加入质量体积比10%的麦芽糊精。
优选地,步骤S3中按照进风口150℃、出风口80℃进行喷雾干燥。
优选地,步骤S1中所述表达鸡α干扰素的重组菌是指含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株。
更优选地,所述含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株是以毕赤酵母野生型菌株X-33为宿主细胞,以毕赤酵母组成型表达质粒pGAPzα-A为载体,构建所得。
优选地,步骤S1菌株发酵培养的步骤如下:首先将毕赤酵母工程菌株在100mL YPD培养基中,于27~29℃,250rpm/min振荡培养17~19小时;再转接到1000mL YPD培养基中,于27~29℃,250rpm/min振荡培养17~19小时后,得到种子液;然后接种至装有发酵培养基的发酵罐中,调pH值5.7~5.75并全程控制,溶氧调至100%,通风量1:1起, 200-250rpm、28℃培养72h。
具体实施案例是:在20L发酵罐中,配制10L发酵培养基,流加灭菌的体积浓度50%磷酸溶液调pH为5.75左右,将种子液接种后将溶氧调至100%,通风量1:1起,培养过程如溶氧降到30%以下适当增加风量,转速200~250rpm,培养温度28℃,全程控pH 5.75(只加磷酸,低于5.75时不用控制),培养至72h放罐。
本发明还提供了一种含鸡α干扰素复合益生菌剂,由鸡α干扰素粉末、枯草芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉、罗伊氏乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、辅美粉混合而成。其抗病毒活性为105~106IU/g,益生菌达100亿cfu/g以上。
优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂10~30%、枯草芽孢杆菌菌粉1~10%、酿酒酵母菌粉0.5~5%、罗伊氏乳杆菌菌粉1~20%、植物乳杆菌菌粉20~40%、辅美粉30~50%。
更优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂10~20%、枯草芽孢杆菌菌粉1~6%、酿酒酵母菌粉0.5~3%、罗伊氏乳杆菌菌粉1~15%、植物乳杆菌菌粉20~30%、辅美粉30~45%。
更优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂15~20%、枯草芽孢杆菌菌粉3~6%、酿酒酵母菌粉1.5~3%、罗伊氏乳杆菌菌粉5~15%、植物乳杆菌菌粉20~25%、辅美粉35~49%。
最优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂20%、枯草芽孢杆菌菌粉5%、酿酒酵母菌粉2%、罗伊氏乳杆菌菌粉15%、植物乳杆菌菌粉20%、辅美粉38%。
另外,优选地,其中所述鸡α干扰素粉末制剂成分包括如下质量比的组分:10%~30%含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株的发酵液固形物、70%~90%麦芽糊精。其抗病毒活性为105~106IU/g。
更优选所述鸡α干扰素粉末制剂为上文所述方法制备得到。
优选地,所述枯草芽孢杆菌菌粉的活菌数为1000~1500亿cfu/g,保护剂为辅美粉。
优选地,所述酿酒酵母菌粉的活菌数为50~100亿cfu/g,保护剂配方按质量比为脱脂奶粉:海藻糖:蔗糖=9~13:8~12:5~8。
优选地,所述罗伊氏乳杆菌菌粉的活菌数为100~500亿cfu/g,保护剂配方按质量比为脱脂奶粉:海藻糖:谷氨酸钠=10~15:5~10:0.5~4。
优选地,所述植物乳杆菌菌粉的活菌数为200~500亿cfu/g,保护剂配方按质量比为脱脂奶粉:乳糖:海藻糖=10~15:5~10:2.5~7。
上述复合益生菌剂可作为禽畜饲料添加剂或是直接配水口服,能调节动物胃肠道微生态平衡,抑制致病菌生长,可显著提高蛋雏鸡的生长水平和饲料的利用率,并能发挥抗病毒和免疫调节作用。
因此,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂在作为或制备禽畜饲料添加剂方面的应用,也应在本发明的保护范围之内。所述禽畜饲料添加剂是指具备调节动物胃肠道微生态平衡,抑制致病菌生长,提高蛋动物生长水平和饲料利用率,并能发挥抗病毒和免疫调节作用的禽畜饲料添加剂。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明提供了一种制备鸡α干扰素粉末制剂的新方法,所得鸡α干扰素粉末制剂的抗病毒活性高,并将具有较强抗病毒效果的鸡α干扰素和益生菌复配,可在动物体内发挥协同效果,既能预防和治疗鸡的病毒性疾病,还能调节动物胃肠道微生态平衡,抑制致病菌生长,可显著提高蛋雏鸡的生长水平和饲料的利用率,并能显著促进免疫器官的发育,增强动物免疫力,提高其抗体水平,可减少或代替抗生素的使用,降低耐药菌的发生和解决药物残留问题。
2、本发明所述鸡α干扰素的复合益生菌制剂,鸡α干扰素无需分离纯化,生产工艺简单,制作成本低廉, 解决了市面上多数鸡α干扰素产品注射液和粉针剂单独使用效果不佳,成本高的问题,有利于鸡α干扰素的推广应用。
3、本发明将鸡α干扰素与益生菌复配,作为微生态制剂用于动物口服饮用,可用于禽类各种病毒性疾病的长期预防和早期治疗,给药途径方便,节约人工成本,避免注射引发的应激等不良反应。
4、本发明所述鸡α干扰素的复合益生菌制剂,在预防鸡的病毒性疾病中有很好的预防效果,有效预防率在80%以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上,根据已有的技术进行常规的替换选择。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 鸡α干扰素粉末制剂的制备
1、工程菌株高密度发酵培养
(1)取表达鸡α干扰素的重组毕赤酵母菌种(即含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株),在100mL YPD培养基中,于27~29℃,250rpm/min振荡培养17~19小时;再转接到1000mL YPD培养基中,于27~29℃,250rpm/min振荡培养17~19小时后,得到种子液;
其中,所述含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株是以毕赤酵母野生型菌株X-33为宿主细胞,以毕赤酵母组成型表达质粒pGAPzα-A为载体(两种均为商业化菌株和质粒),构建所得。
具体地,所述含有鸡α干扰素成熟肽基因序列的毕赤酵母工程菌株的构建方法如下:
首先人工合成12条鸡α干扰素成熟肽扩增引物,引物序列如下表1所示:
表1
引物名称 |
序列(5’-3’) |
P1 |
CG<u>GAATTC</u>AAAAGAGAGGCTGAAGCTTGTAACCACTTAAGACCACAAGACGCTACTTTC |
P2 |
AGTTGGAGCCATATCTCTCAACAACTGCAAGGAATCGTGAGAGAAAGTAGCGTCTTGTG |
P3 |
GAGATATGGCTCCAACTTTGCCACAACTTTGTCCACAACATAACGCTTCTTGCTCTTTC |
P4 |
TATCGGCTTGTCTAGTGTTGGAGGTATCCAAGATGGTATCGTTGAAAGAGCAAGAAGCG |
P5 |
CACTAGACAAGCCGATAAGACTACTCACGATATCTTGCAGCACTTGTTCAAGATCTTGT |
P6 |
GTCTTTGAGAACCGTTCCAATGAGCTGGAGTAGATGGAGAGGACAAGATCTTGAACAAG |
P7 |
GAACGGTTCTCAAAGACAATCCTTGTTGAACAGGATCCACAGATACACCCAACATTTGG |
P8 |
ATCTGGTTCTGGATCTAGTATCGGAAGAATCTAAGCACTGCTCCAAATGTTGGGTGTAT |
P9 |
AGATCCAGAACCAGATGGCCAAGAAATTTGCACTTGACCATCAAGAAGCACTTCTCTTG |
P10 |
AGCGCAAGCTGAATAATCGTTGTCTTGCAAGAAGGTGTGCAAACAAGAGAAGTGCTTCT |
P11 |
TTATTCAGCTTGCGCTTGGGAACACGTTAGATTACAAGCTAGAGCTTGGTTCTTGCAT |
P12 |
GAA<u>GCGGCCGC</u>TCAGGTTCTGGTGTTACCGGTCAAGTTGTGGATATGCAAGAACCAAGC |
运用PCR方法搭桥合成鸡α干扰素成熟肽基因片段,并在片段两端设计两个限制性酶切位点EcoR I和Not I酶切位点,通过酶切连接反应连入被同样限制性内切酶切割的质粒pGAPzα-A中,通过菌落PCR,双酶切鉴定,筛选阳性克隆。
将重组质粒转入大肠杆菌中进行培养增殖,提取质粒,单酶切后用电转化仪转入毕赤酵母野生型菌株X-33中,通过PCR筛选阳性克隆,并用高浓度的抗生素筛选高拷贝菌株,最终得到抗4mg/mLzeocin的毕赤酵母工程菌株。
(2)在20L发酵罐中,配制10L发酵培养基,流加灭菌的体积浓度50%磷酸溶液调pH为5.75左右,接种后将溶氧调至100%,通风量1:1起,培养过程如溶氧降到30%以下适当增加风量,转速200~250rpm,培养温度28℃,全程控pH 5.75(只加磷酸,低于5.75时不用控制),培养至72h放罐;
2、鸡α干扰素喷雾粉剂的制备
(1)上述结束培养后,加入质量体积比0.05%煮沸的苯甲酸,用陶瓷膜进行过滤或离心得到清澈的发酵上清液体;
(2)在发酵上清中加入质量体积比10%的麦芽糊精溶解,按照进风口150℃、出风口80℃进行喷雾干燥,所得喷干粉即为鸡α干扰素粉末制剂,封好口放于阴凉干燥处保存。
该鸡α干扰素粉末制剂的抗病毒活性为105~106IU/g。
实施例2 含鸡α干扰素复合益生菌剂的制备
1、称量以下质量百分比的各个组分:鸡α干扰素粉末制剂20%、枯草芽孢杆菌菌粉5%、酿酒酵母菌粉2%、罗伊氏乳杆菌菌粉15%、植物乳杆菌菌粉20%、辅美粉38%。
其中,枯草芽孢杆菌菌粉含有活菌数为1000亿cfu/g,酿酒酵母菌粉活菌数为50亿cfu/g,罗伊氏乳杆菌菌粉活菌数为100亿cfu/g,植物乳杆菌菌粉活菌数为200亿cfu/g。
2、以上组分用混料机搅拌混合后,粉碎后过100目筛,即得含鸡α干扰素复合益生菌剂。
实施例3 含鸡α干扰素复合益生菌剂的制备
参照实施例2,复合益生菌剂的各组分配比为:鸡α干扰素粉末制剂15%、枯草芽孢杆菌菌粉3%、酿酒酵母菌粉3%、罗伊氏乳杆菌菌粉5%、植物乳杆菌菌粉25%、辅美粉49%。
实施例4 含鸡α干扰素复合益生菌剂的制备
参照实施例2,复合益生菌剂的各组分配比为:鸡α干扰素粉末制剂10%、枯草芽孢杆菌菌粉1%、酿酒酵母菌粉0.5%、罗伊氏乳杆菌菌粉15%、植物乳杆菌菌粉30%、辅美粉43.5%。
实施例5 含鸡α干扰素复合益生菌剂的制备
参照实施例2,复合益生菌剂的各组分配比为:鸡α干扰素粉末制剂23%、枯草芽孢杆菌菌粉1%、酿酒酵母菌粉5%、罗伊氏乳杆菌菌粉1%、植物乳杆菌菌粉40%、辅美粉30%。
实施例6 含鸡α干扰素复合益生菌剂对蛋雏鸡生长性能及免疫功能的影响
1、实验方法:
(1)实验分组及处理
选取7日龄蛋雏鸡,正常饲喂3天,淘汰病鸡和弱鸡后,选取600只体重相近的健康蛋雏鸡,随机分为一个对照组和五个试验组,每组100只。
所有蛋雏鸡采取自由采食和饮水,在14日龄时采取滴鼻方式接种鸡新城疫疫苗。试验周期为 6 周,其他饲养操作严格按照蛋雏鸡饲养管理方法进行。
分组情况如下:
对照组:基础日粮+自由饮水;
试验组1:在对照组的基础上,将实施例2的含鸡α干扰素复合益生菌剂中鸡α干扰素成分用等量的可溶性淀粉代替,保留其它成分,配方比例同实施例2,按照200mg/L的添加量溶于水中饲喂蛋雏鸡;
试验组2: 在对照组的基础上,将实施例2的含鸡α干扰素复合益生菌剂按照200mg/L的添加量溶于水中饲喂蛋雏鸡。
试验组3: 在对照组的基础上,将实施例3的含鸡α干扰素复合益生菌剂按照200mg/L的添加量溶于水中饲喂蛋雏鸡。
试验组4: 在对照组的基础上,将实施例4的含鸡α干扰素复合益生菌剂按照200mg/L的添加量溶于水中饲喂蛋雏鸡。
试验组5: 在对照组的基础上,将实施例5的含鸡α干扰素复合益生菌剂按照200mg/L的添加量溶于水中饲喂蛋雏鸡。
(2)结果统计
于试验期的 0、1、2、3、4、5、6 周第一天早晨称取所有雏鸡空腹重量和饲料重量,计算周增重,耗料重及料重比,于免疫3周后检测抗体水平,饲喂6周后检测免疫器官发育水平。
2、测试结果
结果如表1:
表1 含鸡α干扰素复合益生菌剂对蛋雏鸡生长性能和免疫性能的影响
|
对照组 |
试验组1 |
试验组2 |
试验组3 |
试验组4 |
试验组5 |
周增重(g) |
94.25 |
103.28 |
108.35 |
107.94 |
107.16 |
106.89 |
料重比 |
3.18 |
2.65 |
2.34 |
2.39 |
2.43 |
2.49 |
脾脏(g/Kg) |
2.03 |
2.87 |
3.45 |
3.39 |
3.37 |
3.31 |
法氏囊(g/Kg) |
1.23 |
2.16 |
2.59 |
2.48 |
2.45 |
2.40 |
胸腺(g/Kg) |
3.98 |
4.13 |
5.23 |
5.19 |
5.15 |
5.11 |
新城疫病毒抗体 |
0.67 |
0.76 |
1.12 |
1.09 |
1.06 |
1.02 |
注:表1中数据均为各组相应指标的平均值。
由表1可知,在饲料中不添加抗生素的前提下,用复合益生菌剂饲喂蛋雏鸡,均可以显著提高蛋雏鸡的生长水平和饲料的利用率,并能显著促进免疫器官的发育,提高其抗体水平。同时,在益生菌剂中加入鸡α干扰素成分,其生长水平、免疫器官发育水平和抗体含量均高于单独使用益生菌剂试验组,说明鸡α干扰素可与益生菌剂协同作用,提高其生长水平和免疫水平,并能显著提高抗体含量,增强对疫苗的免疫应答,预防和治疗病毒性疾病。
表2蛋雏鸡在试验期中病毒性疾病的发病率
|
对照组 |
试验组1 |
试验组2 |
试验组3 |
试验组4 |
试验组5 |
新城疫 |
12% |
10% |
0 |
0 |
1% |
1% |
流感 |
9% |
7% |
1% |
2% |
2% |
3% |
支气管炎 |
8% |
7% |
1% |
1% |
2% |
2% |
病毒性肠炎 |
11% |
10% |
0 |
0 |
1% |
2% |
由表2可知,在饲料中不添加抗生素的前提下,用复合益生菌剂饲喂蛋雏鸡,可以显著降低病毒性疾病的发病率。同时,在益生菌剂中加入鸡α干扰素成分,其病毒性疾病发病率低于单独使用益生菌剂试验组,说明鸡α干扰素可与益生菌剂协同作用,预防病毒性疾病的发生,尤其对新城疫和病毒性肠炎预防效果明显,与对照组相比,含鸡α干扰素的复合益生菌剂试验组对病毒性疾病的总体预防率在80%以上。
3、另外,经过实验结果也表明,复合益生菌剂中各组分的配比是非常关键的,对菌剂的效果具有较明显的影响。
更进一步地,以表1中的指标作为筛选依据,经过大量的优化对比试验和正交实验得出本发明复合益生菌剂各组分的配比关系如下:
优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂10~30%、枯草芽孢杆菌菌粉1~10%、酿酒酵母菌粉0.5~5%、罗伊氏乳杆菌菌粉1~20%、植物乳杆菌菌粉20~40%、辅美粉30~50%。
更优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂10~20%、枯草芽孢杆菌菌粉1~6%、酿酒酵母菌粉0.5~3%、罗伊氏乳杆菌菌粉1~15%、植物乳杆菌菌粉20~30%、辅美粉30~45%。
更优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂15~20%、枯草芽孢杆菌菌粉3~6%、酿酒酵母菌粉1.5~3%、罗伊氏乳杆菌菌粉5~15%、植物乳杆菌菌粉20~25%、辅美粉35~49%。
最优选地,所述含鸡α干扰素复合益生菌剂由以下重量百分比的组分组成:鸡α干扰素粉末制剂20%、枯草芽孢杆菌菌粉5%、酿酒酵母菌粉2%、罗伊氏乳杆菌菌粉15%、植物乳杆菌菌粉20%、辅美粉38%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。