CN115029337A - 角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用 - Google Patents

角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用。本发明使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因进行突变，筛选获得角蛋白酶突变体KL1、KL2、KL3、KL4，相比于原始角蛋白酶，突变体最适反应温度由55℃，分别降低到52℃、50℃、40℃、45℃，并且突变体KL3在25℃至35℃反应条件下，剩余酶活力在60%以上。并且本发明将突变体与杜仲叶提取物复配制得的制剂，能够促进肉鸡的生长，同时对肉鸡起到一定的防腹泻作用，因此具有良好的工业价值和市场应用前景。

Description

角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于日化行业、畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。角蛋白中其粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。目前，野生角蛋白酶大多属于高温碱性蛋白酶，其最适反应温度一般为60℃左右，在20℃-40℃条件下的酶活或者催化活性一般不高。
易错PCR技术是采用DNA聚合酶在进行PCR反应扩增目的片段的同时，通过调整反应条件，增加基因突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，再通过高通量方式筛选需要的正向突变体。易错PCR技术是蛋白质分子改造中的重要手段。
发明内容
本发明提供了角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用。本发明通过筛选得到在低温条件下，酶解活性提高的突变体：KL1、KL2、KL3、KL4，并将其与杜仲叶提取物制成添加剂，有效促进肉鸡的生长。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体为角蛋白酶突变体KL，其具有如下之一所示的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
进一步的，所述角蛋白酶突变体KL具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸获得的角蛋白酶突变体KL1；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第151位的甘氨酸变为谷氨酸获得的角蛋白酶突变体KL2；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第340位的丝氨酸变为脯氨酸获得的角蛋白酶突变体KL3；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第372位的异亮氨酸变为缬氨酸获得的角蛋白酶突变体KL4。
本发明还提供了一种编码基因，其为所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因，其具有如下之一所示的核苷酸序列：
（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，其包含所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因。
本发明还提供了一种基因工程菌，其包含所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因。
进一步的，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌。
本发明还提供了一种含杜仲叶提取物的添加剂，所述添加剂中同时包含所述的角蛋白酶突变体KL和杜仲叶提取物。
进一步的，所述添加剂是由含角蛋白酶突变体KL的基因工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与杜仲叶提取物以1:2~3的质量比混合而成的。
本发明还提供了所述的角蛋白酶突变体或者所述的添加剂在用于酶解动物角蛋白中的应用。
进一步的，所述动物角蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛、羊毛、牛毛、猪毛以及角和指甲中的角蛋白。
本发明还提供了所述的角蛋白酶突变体或者所述的添加剂在用于制备促进动物生长的动物饲料添加剂中的应用。
进一步的，所述角蛋白酶突变体KL或添加剂的用量为50 g/t动物饲料~200 g/t动物饲料。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
本发明以Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，筛选得到了包含L115H的单点突变体KL1，以及包含L115H/G151E、L115H/S340P、L115H/I372V的双位点突变体KL2和KL3和KL4。本发明改造后的突变体KL1，KL2，KL3和KL4在40℃条件下的酶活力比原始角蛋白酶K0分别提高了15%，24%，33%，18%；突变体KL1，KL2，KL3和KL4的最适反应温度由55℃分别下降至52℃，50℃，40℃，45℃，并且突变体KL3在25℃至35℃反应条件下，剩余酶活力在60%以上，使其在洗涤、制革、饲料等领域具有良好的市场应用潜力。
另外，本发明经过15L发酵罐发酵，角蛋白酶产酶水平达到8100U/mL，处于现有的较高水平。且将其与杜仲叶提取物复配制得的添加剂，能够促进肉鸡的生长，同时对肉鸡起到一定的防腹泻作用。
附图说明
图1是所述角蛋白酶基因扩增电泳结果图。
图2是所述角蛋白酶突变体筛选过程图。
图3是所述角蛋白酶突变体酶活力和最适反应温度分析。
图4是所述角蛋白酶突变体KL3在15L发酵罐中的发酵数据。
图5是所述角蛋白酶突变体发酵液对羽毛蛋白的降解效果。
图6是角蛋白酶体外酶解豆粕抗原蛋白的胶图，其中编号1是豆粕未做处理，编号2-5分别是加入200U/mL角蛋白酶后，处理2h、4h、8h、16h。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
1、菌株和载体
枯草芽胞杆菌WB600，质粒pWB980，大肠杆菌BL21，质粒pET-21a(+)购自Invitrogen公司。
2、试剂与培养基
质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶，蛋白Marker：Blue PlusII Protein Marker (14-120 kDa)等购自南京诺唯赞股份有限公司；氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司。
LB培养基配方：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。
发酵培养基配方：豆粕3.5-10%、棉籽粕5-10%、玉米粉2-6%、PPG-20000 0.5-1.0%、蛋白酶0.5-1.0%、淀粉酶0.5-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。
3、酶活力测定：参照《GBT 23527-2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法
实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建
参考Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5’端设计Kpn I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点，进行PCR扩增目的条带，使用引物如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：11）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：12）。
反应体系如下：
PCR上游引物（25pmol/µL） 1µL
PCR下游引物（25pmol/µL） 1µL
dNTP混合液 4µL
PCR Buffer 5µL
模板DNA 1µL
DNA聚合酶 0.5µL
加双蒸水至总体积 50µL
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
将PCR产物进行电泳，电泳结果如图1所示，将条带单一的PCR产物进行纯化，双酶切，与pWB980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌WB600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
突变体文库构建，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以SEQ ID NO：2的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：11）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：12）。
将扩增好的随机突变PCR产物用Kpn I和BamH I双酶切，连接到pWB980载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600，卡那霉素抗性LB平板筛选阳性克隆。
将筛选的转化子单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入3个表达原始角蛋白酶K0的单菌落为对照。每孔装入500uL 含卡那霉素抗性的LB液体培养基， 37℃、200rpm震荡培养24小时后， 将发酵液离心取上清，然后检测角蛋白酶的酶活性。结果如图2所示，将低温条件下（20℃-40℃）酶活明显高于对照K0的突变体基因进行重复验证和测序分析。
筛选到以原始角蛋白酶为出发模板的低温条件下酶解活性提高的突变体L115H，命名为KL1，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。
实施例2：易错PCR方式构建角蛋白酶KL1的突变体文库
以实施例1中筛选到的角蛋白酶基因KL1为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以KL1为对照，经过检测角蛋白酶突变体的酶活力，将低温条件下酶活力高于KL1的突变体基因进行测序。
最终筛选到以下突变体：
KL2突变方式为L115H/G151E，氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，基因序列如SEQ IDNo：6所示；
KL3突变方式为L115H/S340P，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，基因序列如SEQ IDNo：8所示；
KL4突变方式为L115H/I372V，氨基酸序列如SEQ ID No：9所示，基因序列如SEQ IDNo：10所示。
实施例3：低温条件下酶解活性提高的角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵表达验证
分别将上述含有突变体KL1-KL4的重组菌接种到发酵培养基中，进行摇瓶发酵78h后，将培养液离心获得上清，40℃条件下测定每个突变体发酵液上清的平均酶活，同时测定突变体的最适温度。
结果如图3，突变后得到的角蛋白酶KL1，KL2，KL3和KL4在40℃条件下的酶活力比原始角蛋白酶K0分别提高了15%，24%，33%，18%；突变体KL1，KL2，KL3和KL4的最适反应温度由55℃分别下降至52℃，50℃，40℃，45℃，并且突变体KL3在25℃至35℃反应条件下，剩余酶活力在60%以上。
实施例4：角蛋白酶突变体在15L发酵罐中发酵和制备
将表达角蛋白酶突变体KL3的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落进行发酵。发酵生产工艺：
（1）重组进接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，过夜震荡培养；
（2）将过夜培养的种子液接种15L发酵罐，装液量为8L；
（3）控制条件：37℃，300-600rpm；溶氧20%-60%；罐压0.05Mpa；通气量0-8h 0.6m3/h； 8h至停罐 0.8-0.9 m3/h。
（4）发酵至镜检芽孢生成率为90%以上。
（5）停罐，发酵液经过5000 rpm离心5 min后，获得上清酶液。
（6）发酵过程pH自然，发酵24h后开始测定酶活力，待发酵结束后（一般48h），发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，经喷塔喷干成酶制剂，用于应用测试。
发酵过程曲线如图4所示：每隔4h取样，测定产酶水平，角蛋白酶突变体KL3发酵40h后抑菌活性达到最高点。
实施例5：角蛋白酶突变体对羽毛粉降解实验
收集白色的羽毛，将羽毛剪碎取0.02g羽毛碎，加入20mL缓冲液（pH 8.0 0.02MTris-Hcl 缓冲液）配制成悬浮液；
实验组：将实施例4得到的角蛋白酶突变体KL3基因工程菌的发酵液，进行离心，获得发酵液上清，将其添加至羽毛悬浮液中；
对照组：不添加酶，处理过程与试验组一致；
反应条件：将酶液和底物混合均匀后，于水浴摇床上，37℃，120rpm/min酶解反应2h。
反应完成后，结果如图5所示，和对照组相比，左侧实验组羽毛被明显降解，呈现乳白色，右侧对照组羽毛没有被降解，呈透明色，且悬浮着羽毛。该实验表明，角蛋白酶突变体保持了原有高效的降解角蛋白的性质，同时其最适反应温度降低，所以角蛋白酶突变体在洗涤、制革等要求较低温度下进行酶解反应的领域具有很好应用潜力。
实施例6：角蛋白酶体外酶解豆粕抗原蛋白实验
豆粕是最常用的饲料原料，是畜禽重要的蛋白质营养来源，多年来一直占我国蛋白质饲料原料的70%以上。角蛋白酶可以有效消除胰蛋白酶抑制因子的作用，降解植物角蛋白、抗原蛋白（致敏原），提高蛋白原料的利用效率，显著降低粪尿中氮排出量，预防食源性腹泻和促进生长。已经确认的大豆抗原蛋白有32种，其中大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白是免疫原性最强的大豆抗原蛋白，占大豆籽实总蛋白的65%～80%，是大豆中主要的抗原蛋白。
本实施例中，将豆粕经过研磨，磨成细粉后，用磷酸缓冲液（pH 7.5-9.0）配制成0.1g/mL的豆粕悬浮液。将实施例4制备的角蛋白酶发酵酶液经过过滤0.22μm的无菌过滤膜除菌后，稀释至200U/mL备用。对照组取5mL上述悬浮液加入1mL无菌水；实验组取5mL上述悬浮液加入1mL含有200U/mL的角蛋白酶的酶液。试验组和对照组一起放入40℃、100转的水浴摇床，进行酶解消化，分别去2h、4h、8h和16h的酶解样品。经过SDS-PAGE分析酶解消化情况和抗原蛋白去除情况。
从图6可以看出，经过酶解8h后，本发明的角蛋白酶突变体可以去除大部分抗原蛋白，显著降低致敏原，同时将难以消化的大分子蛋白质酶解成小肽，可以对畜禽等动物起到很好的促生长作用。
实施例7：添加剂的制备和动物养殖试验
将实施例4中制备的角蛋白酶酶制剂以2:3的质量比与杜仲叶提取物均匀混合，制备成混合添加剂。所述杜仲叶提取物的主要成分：绿原酸≥5%；杜仲多糖≥20%；杜仲黄酮≥8%。
选取某肉鸡养殖场中10周龄肉鸡，体重在843±6.8 g/只，对照组选取30只，做3个重复，每个重复选取10只；试验组选取30只，做3个重复，每个重复选取10只。对照组和试验组均饲喂日常饲料，但试验组同时在饲料中添加100 g/t的添加剂；分别饲喂，试验期共14天。定期统计采食量，称重，计算料重比和腹泻指数。
结果如表1所示，试验组的周增重明显高于对照组，其料重比和腹泻指数均较对照组明显降低，说明通过添加本发明的添加剂，可以在促进肉鸡的生长，同时可以起到一定的防腹泻作用。
表1动物养殖试验数据
周增重/g 料重比 腹泻指数
对照组 86±2.78 1.46±0.12 1.92±0.21
试验组 92±1.94 1.43±0.088 1.68±0.40
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 山东龙昌动物保健品有限公司
<120> 角蛋白酶突变体与杜仲叶提取物复配的添加剂及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50 55 60
Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Ile Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ala Leu Glu Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
85 90 95
Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly
115 120 125
Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130 135 140
Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
165 170 175
Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Asn Val
180 185 190
Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
195 200 205
Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210 215 220
Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys
225 230 235 240
Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
245 250 255
Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro
260 265 270
Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser
275 280 285
Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290 295 300
Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
325 330 335
Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
340 345 350
Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
355 360 365
Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370 375
<210> 2
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60
atggccttca gcgattccgc gtctgctgct cagccggcga aaaatgttga aaaggattat 120
attgtcggat ttaagtcggg agtgaaaacc gcatccgtca aaaaggacat catcaaagag 180
agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaatagc gaagctagac 240
aaagaagcgc ttgaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcac 300
gtagctcatg ctttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360
gtgcaggctc aaggctacaa gggagcgaac gtaaaagtcg ccgtcctgga tacaggaatc 420
caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gcttcgtagc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcacg catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540
aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgccg aacgtatcct tgtacgcggt taaagtgctg 600
aattcaagcg gaagcggatc ttacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacgaca 660
aacggcatgg atgttatcaa catgagcctt ggaggaccat caggctcaac agcgatgaaa 720
caggcggttg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tggcggctgc tgggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaatcggc tatcctgcga aatacgactc tgtcatcgca 840
gttggcgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagcgtcgg agcagagctt 900
gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtgtac agcacttacc caaccagcac ttatgcaaca 960
ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020
aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagtac ggcgacttat 1080
ttgggaagct ccttctacta tggaaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140
<210> 3
<211> 379
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
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115 120 125
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<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gcttcgtagc tggcgaagct 480
tataacaccg acggcaacgg acacggcacg catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540
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aattcaagcg gaagcggatc ttacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacgaca 660
aacggcatgg atgttatcaa catgagcctt ggaggaccat caggctcaac agcgatgaaa 720
caggcggttg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tggcggctgc tgggaacagc 780
ggatcttcag gaaacacgaa tacaatcggc tatcctgcga aatacgactc tgtcatcgca 840
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcccatcct tattgagcgg cagcttcga 29

Claims (10)

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述角蛋白酶突变体为角蛋白酶突变体KL，其具有如下之一所示的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述角蛋白酶突变体KL具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸获得的角蛋白酶突变体KL1；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第151位的甘氨酸变为谷氨酸获得的角蛋白酶突变体KL2；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第340位的丝氨酸变为脯氨酸获得的角蛋白酶突变体KL3；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第115位的亮氨酸变为组氨酸和第372位的异亮氨酸变为缬氨酸获得的角蛋白酶突变体KL4。
3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因为权利要求1所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因，其具有如下之一所示的核苷酸序列：
（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求3所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因。
5.一种基因工程菌，其特征在于，其包含权利要求3所述的角蛋白酶突变体KL的编码基因。
6.一种含杜仲叶提取物的添加剂，其特征在于，所述添加剂中同时包含权利要求1所述的角蛋白酶突变体KL和杜仲叶提取物。
7.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂是由含角蛋白酶突变体KL的基因工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与杜仲叶提取物以1:2~3的质量比混合而成的。
8.角蛋白酶突变体或者添加剂在用于酶解动物角蛋白中的应用，其特征在于，所述角蛋白酶突变体为权利要求1所述的角蛋白酶突变体KL；所述添加剂为权利要求6所述的含杜仲叶提取物的添加剂。
9.角蛋白酶突变体或者添加剂在用于制备促进动物生长的动物饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述角蛋白酶突变体为权利要求1所述的角蛋白酶突变体KL；所述添加剂为权利要求6所述的含杜仲叶提取物的添加剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述角蛋白酶突变体KL或添加剂的用量为50 g/t动物饲料~200 g/t动物饲料。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

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