CN115820612A - 一种角蛋白酶、含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂及其制备促家禽生长的饲料中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种角蛋白酶、含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂及其制备促家禽生长的饲料中应用。本发明使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因进行突变，获得角蛋白酶K1、K2、K3、K4，相比于原始角蛋白酶，它们的酶活力分别提高了25%，45%，50%，30%，且具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果。本发明还利用角蛋白酶与胆汁酸混合制备新的胆汁酸酶制剂，应用于禽畜养殖中，能够明显促进肉鸡生长，降低料重比，因此具有良好的工业价值和市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种角蛋白酶、含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂及其制备促家禽生长的饲料中应用。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白中粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源，以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。
目前，国内角蛋白酶研究较多仍处于菌株的筛选、分离和角蛋白酶分离与纯化以及酶学性质的阶段。但是，能够有效表达高活性的角蛋白酶的潜在菌株仍然很少，普遍存在产酶水平偏低、生产成本较高的问题，这也是角蛋白酶工业化生产及应用的主要障碍。所以，采用蛋白质分子改造策略，进一步提升角蛋白的性质越来越受到研究者的关注。
易错PCR技术是采用DNA聚合酶在进行PCR反应扩增目的片段的同时，通过调整反应条件，增加基因突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，再通过高通量方式筛选需要的正向突变体。易错PCR技术是蛋白质分子改造中的重要手段。
发明内容
本发明提供了一种角蛋白酶、含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂及其制备促家禽生长的饲料中应用。本发明对Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因（GenBank:ADK11044.1）进行改良，筛选得到酶活力提高的角蛋白酶。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种角蛋白酶，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的角蛋白酶K1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的角蛋白酶K2、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的角蛋白酶K3、或者为氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的角蛋白酶K4。
进一步的，所述角蛋白酶K1是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶K2是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第61位丝氨酸变为亮氨酸获得的；所述角蛋白酶K3是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第96位的缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶K4是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第317位的苏氨酸变为丝氨酸获得的。
本发明还提供了所述的角蛋白酶的编码基因，所述角蛋白酶K1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述角蛋白酶K2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述角蛋白酶K3的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；或者所述角蛋白酶K4的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明还提供了所述的编码基因的重组工程菌，所述重组工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或者地衣芽胞杆菌。
本发明还提供了一种含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂，所述胆汁酸酶制剂中是由权利要求1所述的角蛋白酶和胆汁酸共同混合制备而成。
进一步的，在所述胆汁酸酶制剂中，每克胆汁酸中混合有2.5×103U~ 4.0×103U的角蛋白酶液。
进一步的，所述角蛋白酶液的制备方法为：将含有角蛋白酶的编码基因的重组工程菌于含有抗生素的平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落接种于液体培养基中发酵，得到的种子液接种至发酵罐中继续发酵，得到的发酵液经板框过滤机处理得到粗酶液，粗酶液经提纯、喷塔喷干成角蛋白酶喷干粉后，再利用无菌水制备成角蛋白酶液。
本发明还提供了所述的角蛋白酶或者所述的胆汁酸酶制剂在制备促家禽生长的饲料中应用。
进一步的，将所述角蛋白酶或胆汁酸酶制剂以200 g/t~400 g/t的用量混合于普通饲料中，然后饲喂家禽15天以上。
本发明还提供了所述的角蛋白酶或者所述的胆汁酸酶制剂在酶解动物角蛋白中的应用。
进一步的，所述动物角蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛、羊毛、牛毛、猪毛以及角和指甲中的角蛋白。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
本发明以Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，经过随机突变，构建突变体文库和高通量定向筛选的方法，得到了包含V150A的单点突变体K1，包含V150A/S61L、V150A/V96A、V150A/T317S的双位点突变体K2和K3和K4。本发明改造后的突变体K1，K2，K3和K4的酶活力比原始角蛋白酶分别提高了25%，45%，50%，30%，酶活力得到了显著的提升。且经过15L发酵罐发酵，角蛋白酶产酶水平达到8100U/mL。本发明还利用该突变体与胆汁酸混合制备新的酶制剂，突变体不仅其具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果，而且胆汁酸酶制剂用于禽畜养殖中，能够明显促进肉鸡生长的作用，因此具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是角蛋白酶基因扩增电泳结果图。
图2是角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵产酶水平分析。
图3是角蛋白酶突变体K3在15L发酵罐中的发酵结果。
图4是角蛋白酶突变体K3发酵液对羽毛蛋白的降解效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
在本发明中，LB培养基配方为：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。发酵培养基配方为：豆粕3.5-10%、棉籽粕5-10%、玉米粉2-6%、PPG-20000 0.5-1.0%、蛋白酶0.5-1.0%、淀粉酶0.5-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。
在本发明中，酶活力测定参照《GBT 23527-2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法。
实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建
参考Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5’端设计Kpn I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点，进行PCR扩增目的条带，使用的引物如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：11）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：12）。
反应体系如下：
| PCR上游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| PCR下游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| dNTP混合液 | 4µL |
| PCR Buffer | 5µL |
| 模板DNA | 1µL |
| DNA聚合酶 | 0.5µL |
| 加双蒸水至总体积 | 50µL |
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
将PCR产物进行电泳，电泳结果如图1所示，将条带单一的PCR产物进行纯化，双酶切，与pWB980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌WB600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
突变体文库构建，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以SEQ ID NO：2的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：11）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：12）。
将扩增好的随机突变PCR产物用Kpn I和BamH I双酶切，连接到pWB980载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600，卡那霉素抗性LB平板筛选阳性克隆。
将筛选的转化子单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入3个表达原始角蛋白酶的单菌落K0为对照。每孔装入500µL 含卡那霉素抗性的LB液体培养基， 37℃，200rpm震荡培养24小时后，将发酵液离心取上清，然后检测角蛋白酶的酶活性。将酶活明显高于对照K0的突变体基因进行重复验证和测序分析。
筛选到以原始角蛋白酶为出发模板的酶活力提高的突变体V150A，命名为K1，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。
实施例2：易错PCR方式构建角蛋白酶K1的突变体文库
以实施例1中筛选到的角蛋白酶基因K1为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以K1为对照，经过检测角蛋白酶突变体的酶活力，将酶活力高于K1的突变体基因进行测序。
最终筛选到酶活力提高的以下突变体：
K2突变方式为V150A/S61L，其氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，核苷酸序列如SEQID No：6所示；
K3突变方式为V150A/V96A，其氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，核苷酸序列如SEQID No：8所示；
K4突变方式为V150A/T317S，其氨基酸序列如SEQ ID No：9所示，核苷酸序列如SEQID No：10所示。
实施例3：酶活力提高的角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵表达验证
分别将含有实施例1和2的角蛋白酶突变体K1-K4的重组菌接种到发酵培养基中，进行摇瓶发酵78h，将培养液离心获得上清，测定每个突变体发酵液上清的平均酶活。
结果如图2所示，突变后得到的角蛋白酶K1，K2，K3和K4的酶活力比原始角蛋白酶K0分别提高了25%，45%，50%，30%，其中角蛋白酶突变体K3的酶活提高的最明显。
实施例4：角蛋白酶突变体在15L发酵罐中发酵和制备
将表达角蛋白酶突变体K1、K2、K3、K4的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落进行发酵。发酵生产工艺如下：
（1）将含突变体的重组菌接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，过夜震荡培养；
（2）将过夜培养的种子液接种15L发酵罐，装液量为8L；
（3）控制条件：37℃，300-600rpm；溶氧20%-60%；罐压0.05Mpa；通气量0-8h 0.6m3/h；8h至停罐 0.8-0.9 m3/h；
（4）发酵至镜检芽孢生成率为90%以上；
（5）停罐，发酵液经过5000 rpm离心5 min后，获得上清酶液；
（6）发酵过程pH自然，发酵16h后开始测定酶活力，待发酵结束后，取发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，经提纯、喷塔喷干成角蛋白酶喷干粉，后续使用。
角蛋白酶突变体K3的发酵过程曲线如图3所示，突变体K3在发酵48h后酶活达到最高点。
实施例5：角蛋白酶突变体对羽毛粉降解实验
收集白色的肉鸡羽毛，将羽毛剪碎取0.02g羽毛碎，加入20mL缓冲液（pH 8.0 0.02M Tris-Hcl 缓冲液）配制成悬浮液；
实验组：将实施例4制备的角蛋白酶突变体K3的发酵液进行离心，获得发酵液上清；对照组：不添加任何酶；
反应条件：将发酵液和底物混合均匀后，于水浴摇床上，37℃，120rpm/min酶解反应2h；
反应完成后，结果如图4所示，和对照组相比，左侧实验组羽毛被明显降解，呈现乳白色，右侧对照组羽毛没有被降解，呈透明色，且悬浮着羽毛。该实验表明角蛋白酶突变体保持了原有高效的降解角蛋白的性质，同时其酶活力有显著提高，所以本发明的角蛋白酶突变体具有很好应用潜力。
实施例6：动物养殖试验
将实施例4中制备的角蛋白酶突变体K3的喷干粉用无菌水制备成角蛋白酶液，添加到胆汁酸中，其中按每克胆汁酸添加2.5×103U~ 4.0×103U的角蛋白酶液计，混合均匀后制备得到胆汁酸酶制剂。
选取白羽肉鸡，实验组和对照组各选取12000羽，做3个重复，每个重复选取4000羽。对照组为正常豆粕型日粮；试验组为豆粕型日粮，同时按300 g/t在豆粕型日粮中添加胆汁酸酶制剂；分别饲喂，试验期共30天。统计料重比和出栏重量。
结果如表1所示，试验组的白羽肉鸡的出栏重和料重比均高于对照组，通过添加胆汁酸酶制剂，不仅可以很好的促进动物饲料中蛋白质的利用率，提高饲料利用率，同时还可以明显降低料重比，提高肉鸡的出栏重，节约养殖成本。
表1动物养殖试验数据
| 出栏重g | 料重比 | |
| 对照组 | 2528±11.1 | 1.54±0.16 |
| 试验组 | 2615±10.5 | 1.49±0.25 |
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的角蛋白酶K1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的角蛋白酶K2、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的角蛋白酶K3、或者为氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的角蛋白酶K4。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶K1是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶K2是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第61位丝氨酸变为亮氨酸获得的；所述角蛋白酶K3是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第96位的缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶K4是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第150位的缬氨酸变为丙氨酸和第317位的苏氨酸变为丝氨酸获得的。
3.权利要求1所述的角蛋白酶的编码基因，其特征在于，所述角蛋白酶K1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述角蛋白酶K2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述角蛋白酶K3的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；或者所述角蛋白酶K4的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.包含权利要求3所述的编码基因的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或者地衣芽胞杆菌。
5.一种含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸酶制剂中是由权利要求1所述的角蛋白酶和胆汁酸共同混合制备而成。
6.根据权利要求5所述的胆汁酸酶制剂，其特征在于，在所述胆汁酸酶制剂中，每克胆汁酸中混合有2.5×103U~ 4.0×103U的角蛋白酶液。
7.根据权利要求6所述的胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述角蛋白酶液的制备方法为：将含有角蛋白酶的编码基因的重组工程菌于含有抗生素的平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落接种于液体培养基中发酵，得到的种子液接种至发酵罐中继续发酵，得到的发酵液经板框过滤机处理得到粗酶液，粗酶液经提纯、喷塔喷干成角蛋白酶喷干粉后，再利用无菌水制备成角蛋白酶液。
8.权利要求1所述的角蛋白酶或者权利要求5所述的胆汁酸酶制剂在制备促家禽生长的饲料中应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述角蛋白酶或胆汁酸酶制剂以200 g/t~400 g/t的用量混合于普通饲料中，然后饲喂家禽15天以上。
10.权利要求1所述的角蛋白酶或者权利要求5所述的胆汁酸酶制剂在酶解动物角蛋白中的应用。
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