CN114574469A - 一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用 - Google Patents

一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用，本发明提供了一种基于易错PCR技术，定向进化获得高酶活突变体的方法。本发明共获得了9个酶活提高的突变体，其中突变体T8(R72S/F107Y/N291S/N295D)的酶活水平最高，为2382U/mL，是对照菌酶活的2.1倍。采用培养基组分优化及7L发酵罐扩大培养的发酵研究策略，实现了突变菌产酶量的提升，角蛋白酶活力可达8448U/mL，本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效的策略。采用角蛋白酶与胰蛋白酶复配降解角蛋白废弃物，探究酶解法的最佳条件，为实际生产中高效利用羽毛、提高蛋白利用率提供了理论基础。

Description

一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于定向进化改造的角蛋白酶突变体及其应用，属于蛋白质工程及酶工程技术领域。
背景技术
角蛋白是一类不溶性的硬质蛋白，广泛存在于生物体组织中，是羽毛、毛发、羊毛、指甲、犄角、蹄和鳞片等的主要组成成分。废弃角蛋白中含有90％的蛋白质，是未来饲料业可利用的蛋白资源。传统的处理方法，如加热加压、酸碱法，一方面会破坏氨基酸和多肽的活性，另一方面耗费巨大的能源，污染环境。采用角蛋白酶降解角蛋白废弃物具有高度的特异性和效率，而且是一种环境友好的方式，正受到越来越多的关注。
角蛋白酶是一种由微生物产生、能够专一降解角蛋白底物，如羊毛、羽毛、牛羊角的特异性水解酶。大部分角蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，少部分属于金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。产角蛋白酶的微生物主要来源于细菌、真菌、放线菌等，它们大部分是从羽毛堆或毛发堆中筛选得到的。在细菌中，产生角蛋白酶的主力菌株是芽孢杆菌属，如最先报道的能够分泌角蛋白酶进而降解羽毛的地衣芽孢杆菌PWD-1(Bacillus licheniformis PWD-1)，此外还有枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌属(Bacillus pumilus)、蜡状芽孢杆菌属(Bacillus cereus)等。同时，由于芽孢杆菌属多数为食品安全菌株，芽孢杆菌来源的角蛋白酶具有食品安全性高、应用方便等优势，在饲料、皮革纺织、医疗化妆品、洗涤清洁等方面成为一个研究热点。此外，有研究表明，角蛋白酶降解羽毛废弃物转化的氮源可以用来作为肥料和土壤改良剂，有促进植物生长的作用。
然而，角蛋白酶的大规模生产是其工业化应用的关键。已有多种表达系统被用来生产角蛋白酶。除此之外，提高角蛋白酶的活性也是其工业化应用的重要因素。提高角蛋白酶活的蛋白质工程方法有两种，包括体外定向进化和理性设计。基于结构的理性设计是依据分析可利用的蛋白质的结构，以提高角蛋白酶的活性和稳定性。以来源于地衣芽孢杆菌BBE11-1的角蛋白酶KerZ1为例，通过前导肽工程和饱和位点突变，显著提高了角蛋白酶的活性，成熟酶活性为原突变体(127.6KU/mg)的186％，在亚硫酸盐的辅助下，突变体2-D12可在12h内将90％以上的羽毛废弃物降解为氨基酸和多肽，这为其降解羽毛弥补蛋白资源的不足奠定了基础。但是，为了实现角蛋白酶的高效生产及工业应用，角蛋白酶的酶活还有待进一步提高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于易错PCR的定向进化技术获得高酶活突变体的方法，共获得了9个酶活提高的突变体，其中一株突变体T8(R72S/F107Y/N291S/N295D)的酶活水平最高，为2382U/mL，是对照菌酶活的2.1倍。
本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，所述的角蛋白酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶的第72位精氨酸突变成丝氨酸，第107位的苯丙氨酸突变成酪氨酸，以及，第295位的天冬酰胺突变成天冬氨酸。
进一步地，所述的角蛋白酶突变体还包括将亲本角蛋白酶第291位的天冬酰胺突变成丝氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述的角蛋白酶突变体的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。
本发明的第五个目的是提供一种采用所述的重组菌生产角蛋白酶的方法，具体是将所述的重组菌以1～10％的接种量接种到发酵培养基中发酵培养得到所述的角蛋白酶突变体。
进一步地，所述的发酵培养的条件为：发酵温度27～40℃、转速100～1000rpm、通气量0.5～3vvm、pH为6～9。
进一步地，所述的发酵培养基为：8～12g/L葡萄糖，50～70g/L水溶性黄豆饼浸粉，16～20g/L豆粕，12～13g/L K2HPO4，2.1～2.5g/L KH2PO4，0.4～0.6g/L K2SO4。
本发明的第六个目的是提供一种所述的角蛋白酶突变体在饲料业、制革业或农业中的应用。
进一步地，所述的应用是利用所述的角蛋白酶突变体降解羽毛得到降解产物。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于易错PCR的定向进化技术获得高酶活突变体的方法。本发明共获得了9个酶活提高的突变体，其中一株突变体T8(R72S/F107Y/N291S/N295D)的酶活水平最高，为2382U/mL，是对照菌酶活的2.1倍。采用培养基组分优化及7L发酵罐扩大培养的发酵研究策略，实现了突变菌产酶量的提升，角蛋白酶活力可达8448U/mL，本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效的策略。采用角蛋白酶与胰蛋白酶复配降解角蛋白废弃物，探究酶解法的最佳条件，为实际生产中高效利用羽毛，提高蛋白利用率提供了理论基础。
附图说明：
图1为突变菌的角蛋白酶酶活；WT：含pMA5-kerBp质粒的初始对照菌株，1-9：9株正向突变菌；
图2为碳源对发酵产酶的影响；
图3为氮源对发酵产酶的影响；
图4为7L发酵罐放大产酶结果；
图5为角蛋白酶和胰蛋白酶复配降解羽毛的条件优化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：易错PCR技术定向进化角蛋白酶
本发明基于易错PCR的定向进化技术对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本角蛋白酶(MCVKKKNVMTSVLLAVPLLFSAGFGGSMANAETVSKTDSEKSYIVGFKASATTNSSKKQAVIQNGGKLEKQRRLINAAQVKMSEQAAKKLEHDPSIAYVEEDHKAEFYAQTVPYGIPQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQSHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSASLYAVKVLDRYGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPSGSTALKNAVDTANNRGVVVVAAAGNSGSSGSSSTVGYPAKYDSTIAVANVNSNNVRNSSSSAGPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSYTGTSMASPHVAGAAALILSKNPNLTNSQVRQRLENTATPLGDSFYYGKGLINVQAASN)进行突变筛选，以期获得角蛋白酶活性高的突变体。
本发明主要通过改变PCR反应条件，提高Mg2+浓度(5mM)、改变Mn2+浓度(0.2mM)及使用低保真DNA聚合酶，来提高扩增产物的碱基突变频率，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，提高突变谱的多样性，从而得到随机突变的DNA序列，进而选择满足需求的蛋白酶。引物分别为kerBp-F(SEQ ID NO.3):CGG GAT CCA TGT GCG TTAAAA AGAAAA ATG TTA TGA CAA G和kerBp-R(SEQ ID NO.4):CGA CGC GTT TAA TTTGAT GCT GCTTGC ACA TTA ATC。易错PCR扩增体系及条件见表1。
表1易错PCR扩增体系参数
Figure BDA0003557053340000041
经过两轮易错PCR和荧光显色酶活性测定的高通量筛选，构建了一个包含8000多个突变体文库。其中，筛选到9株角蛋白酶活性增加的菌株，具有最高角蛋白酶活性的突变体T8(R72S/F107Y/N291S/N295D)，其酶活为2382U/mL，是原始角蛋白酶活性的2.1倍，其次突变体T9(R72S/F107Y/N295D)酶活也较高，为2243.87U/mL，结果见图1。
下面实施例以突变体T8为例，进行发酵优化和应用。
实施例2：突变体培养基成分优化
分别对TB培养基中碳源的种类(无水葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、β-环糊精、麦芽糖、糊精、甘露糖、山梨醇，甘油、果糖)及浓度(0、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L)，第一氮源种类(蛋白胨、豆粕、羽毛粉、黄豆饼浸粉、牛肉浸膏、玉米浆、水溶性棉籽饼粉、硝酸钠、硫酸二氢铵、尿素、硫酸铵、氯化铵、硫酸氢二铵)及浓度(24g/L、30g/L、36g/L、42g/L、48g/L、54g/L、60g/L、66g/L、72g/L)，第二氮源的种类(蛋白胨、酵母粉、豆粕、羽毛粉、牛肉膏、玉米浆和水溶性棉籽粉)及浓度(1g/L、6g/L、12g/L、18g/L、24g/L、30g/L)，金属离子种类(硫酸钾、硫酸锰、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锌和硫酸亚铁)及浓度(0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L)进行优化，摇瓶培养60h，测定菌株酶活。将突变菌接种于优化培养基(10g/L葡萄糖，60g/L水溶性黄豆饼浸粉，18g/L豆粕，12.54g/L K2HPO4，2.31g/L KH2PO4，0.5g/L K2SO4)发酵产酶，酶活最高可达3707.47U/mL，结果见图2和图3。
实施例3：突变体在7L发酵罐中产酶情况
为了进一步提高角蛋白酶的表达量，将突变菌接种于7L发酵罐进行放大培养。在发酵过程中，突变株在0～16h内呈对数增长，而酶活性逐渐升高。在16～60h内，细胞继续生长并趋于稳定。在这个阶段，角蛋白酶不断产生和积累，酶的表达水平不断提高。随后，通过流加培养基，细胞继续生长，并在92h时达到最大浓度，OD600值为51.41。酶活性持续累积，在108h达到最大值，达到8448U/mL，结果见图4。
实施例4：角蛋白酶活性的测定方法
1％角蛋白底物的配制：将5％角蛋白底物与0.05M Tris-HCl(pH 9)以体积比1：4的比例配制反应所需浓度的角蛋白溶液。
测定方法：取经过稀释的酶液100μL，加入100μL 1％角蛋白底物溶液，置于50℃水浴反应20min，反应结束后立即加入200μL 5％(w/v)TCA终止反应。对照组中先加入200μLTCA，酶反应结束后再加入100μL角蛋白底物溶液。反应结束后样品以12000rpm离心5min，然后分别吸取200μL上清液到离心管中，加1mL 0.4M Na2CO3，再加入200μL福林酚溶液，置40℃水浴锅中反应20min后在660nm处检测吸光值。
角蛋白酶活性的定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在660nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位U。
实施例5：角蛋白酶与胰蛋白酶复配降解羽毛
用于降解的羽毛废弃物是从家禽养殖场(中国，无锡)收集的。羽毛降解实验在装有50mL酶溶液和10g/L鸡羽毛废弃物的500mL烧瓶中进行。将制备的角蛋白酶(1600U/mL)与胰蛋白酶(1600U/mL)按照1：1复配应用于羽毛降解并优化复合酶的降解条件，温度(30，35，40，45，50，55℃)，pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0)，降解时间(8，16，24，32，40，48h)和亚硫酸盐含量(0.1％，0.5％，1％，1.5％，2.0％，2.5％)。经过条件优化，羽毛降解率由49％提高到89％，结果见图5。12h羽毛降解液含有氨基酸的总浓度为4.97mg/mL，结果见表2。
表2突变体T8降解羽毛过程中氨基酸浓度的变化
Figure BDA0003557053340000051
Figure BDA0003557053340000061
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述的角蛋白酶突变体是以氨基酸序列如SEQID NO.1所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶的第72位精氨酸突变成丝氨酸，第107位的苯丙氨酸突变成酪氨酸，以及，第295位的天冬酰胺突变成天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述的角蛋白酶突变体还包括将亲本角蛋白酶第291位的天冬酰胺突变成丝氨酸。
3.一种编码权利要求1或2所述的角蛋白酶突变体的基因。
4.一种携带权利要求3所述基因的重组质粒。
5.一种表达权利要求1或2所述的角蛋白酶突变体的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。
7.一种采用权利要求5或6所述的重组菌生产角蛋白酶的方法，其特征在于，具体是将所述的重组菌以1～10％的接种量接种到发酵培养基中发酵培养得到所述的角蛋白酶突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养的条件为：发酵温度27～40℃、转速100～1000rpm、通气量0.5～3vvm、pH为6～9。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：8～12g/L葡萄糖，50～70g/L水溶性黄豆饼浸粉，16～20g/L豆粕，12～13g/L K2HPO4，2.1～2.5g/LKH2PO4，0.4～0.6g/L K2SO4。
10.一种权利要求1或2所述的角蛋白酶突变体在饲料业、制革业或农业中的应用，其特征在于，所述的应用是利用所述的角蛋白酶突变体降解羽毛得到降解产物。
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