CN1282375A - 木糖醇的生产方法 - Google Patents
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Abstract
使属于氧化葡糖杆菌和木质醇杆菌,具有D－阿拉伯糖醇脱氢酶活性和D－木酮糖还原酶(木糖醇脱氧酶)活性及将D－阿拉伯糖醇转化为木糖醇之能力的微生物作用在含有碳源的反应混合物中的D－阿拉伯糖醇上以生产木糖醇。
Description
技术领域
本发明涉及木糖醇的生产方法。木糖醇应用在食品、医药等领域。
技术背景
作为自然界中存在的糖醇，木糖醇的需求量从现在起在不断增加。木糖醇热量比蔗糖低，但甜度类似于蔗糖。因此，它有望做低热量的增甜剂。而且，木糖醇是抗成龋因子和能作为防龋齿的增甜剂。由于木糖醇不升高血糖水平，它已用于输注液治疗糖尿病。
现在，木糖醇在工业范围的生产主要是按美国专利号．4，008，825所描述的通过D-木糖氢化来生产。原材料，D-木糖可通过起始材料如阔叶树，稻草，玉米的穗基，燕麦壳，或其它富含木聚糖的植物来源材料的水解获得。
然而，通过水解植物材料得到的D-木糖由于生产成本高而存在昂贵的缺点。例如，植物材料水解产物产率低导致D-木糖醇生产的纯度低。水解之后，通过离子交换处理除掉水解中用的酸和色素是必须的。并且，D-木糖醇结晶以除掉其他的半纤维素。要求进一步纯化所得的D-木糖醇以能用在食品中。离子交换的处理和结晶结果使生产成本上升。
为了解决上述问题，用容易得到原材料和产生较少量的废料的生产木糖醇的方法是所期望的。例如，用戊五醇作原材料生产木糖醇的方法已经发展起来。容易得到的戊五醇之一是D-阿拉伯糖醇，可以用酵母生产(加拿大微生物杂志31．1985，467-471，普通微生物杂志139，1993，1047-1054)。
几种用D-阿拉伯糖醇做原材料生产木糖醇的方法已开发出来。《应用微生物学》，18，1969，1031-1035报道的方法，包括用汉氏德巴利酵母ATCC 20121发酵从葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇，用弱氧化醋杆菌转化D-阿拉伯糖以得到D-木酮糖，和用季氏假丝酵母Soya变种转化D-木酮糖成木糖醇。
EP-A-403392(申请人：Roquette Freres)和EP-A-421882(申请者：Roquette Freres)均公开了一种方法，包括用耐渗透压酵母菌发酵生产D-阿拉伯糖醇，用醋杆菌属，葡糖杆菌属和克雷伯氏菌属的微生物转化D-阿拉伯糖醇生产D-木酮糖，用葡萄糖(木糖)异构酶处理所得的木酮糖以生产木糖和木酮糖的混合物，并且用氢化的方法转化前面形成的木糖／木酮糖以得到木糖醇。这些出版物也公开了在木糖／木酮糖混合物中初步富集木糖和用氢化的方法转化富集的木糖成木糖醇的方法。
上面所述用D-阿拉伯糖醇作为原材料生产木糖醇的方法能使木糖醇高产量。然而，其缺点在于要求多重反应步骤使工艺复杂化。因此，此方法在经济上不能令人满意。
为解决这些问题，本发明人公开了有能力直接将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的微生物和发展了生产木糖醇的方法，其特征是让微生物作用D-阿拉伯糖醇以生产木糖醇和收集它(日本专利申请号9-285455和10-9598)。这个方法的优点在于它能由发酵的方法在简单的一步工艺中有效地将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇。然而，需进一步改进的是反应的稳定性和木糖醇的产量。
发明公开
本发明的目标是提供用D-阿拉伯糖醇做原材料生产木糖醇的方法且由一个简单过程就完成的方法。
本发明人分析过有能力直接将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的微生物以阐明转化反应，包括D-阿拉伯糖醇掊氢酶活性和D-木酮糖还原酶(木糖醇脱氢酶)活性和创立在将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的反应中容许有高稳定和高产的木糖醇生产的额外碳源和NADH(一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，从而完成本发明。
即，本发明涉及生产木糖醇的方法包含将具有把D-阿拉伯糖醇转化成木糖醇能力的微生物，与D-阿拉伯糖醇反应以生产木糖醇的步骤其中碳源或NADH被加入到反应系统中。
上述的方法更具体的方法是当微生物是微生物细胞时，碳源就加入到反应系统中和当微生物是细胞制剂产品时，NADH就加入到反应系统中。微生物包括那些有D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性和D-木酮糖还原酶活性(木糖醇脱氢酶)的。具体地说，微生物包括那些有能力代谢碳源以生产NADH且更具体地是那些属于葡糖杆菌属和醋杆菌属的，且特别是氧化葡糖杆菌和木质醋杆菌。
碳源包括糖，糖衍生物，醇，醛，有机酸和其混合物。更具体地说，碳源包括葡萄糖，果糖、蔗糖、半乳糖、山梨糖醇，甘油，葡糖，甲醇，乙醇、丙醇、异丙醇、1，4-丁二醇，2，3-丁二醇，甲醛、乙醛、丙醛、异丁醛、甘油醛、甲酸、乙酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸和其混合物。
根据本发明，木糖醇可以通过简单过程由D-阿拉伯糖醇作原材料以高产率生产。
在下文中，将详细描述本发明。<1>有能力将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的微生物
能用在本发明中的微生物是有能力将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的微生物。今后，那些有如此能力的微生物称为“本发明的微生物”作为本发明的微生物，这里引证的那些微生物既有D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性，将D-阿拉伯糖醇氧化为D-木糖醇；也有D-木酮糖还原酶(木糖醇脱氢酶)活性以将D-木酮糖去氧化为木糖醇。进一步，本发明的微生物优选的是有能力代谢合适碳源以生产NADH的。
微生物的具体例子是有D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性和D-木酮糖还原酶活性，也有能力代谢合适碳源以生产NADH的微生物包括属于葡糖杆菌属和醋杆菌属细菌。葡糖杆菌属的细菌包括氧化葡糖杆菌，醋杆菌属包括木质醋杆菌。更具体地，引用下面的菌株：
氧化葡糖杆菌ATCC 621
氧化葡糖杆菌IAM 1839
氧化葡糖杆菌IAM 1842
木质醋杆菌ATCC 14851
注意的是能用于本发明的微生物可以具有上述两种酶活性的任何一种，但不限于上述的微生物。
IAM 1839和IAM 1942是任何人都可以从分子和细胞生物科学研究所(前称，应用微生物学研究所)得到的，研究所座落在日本、东京、Yayoi 1-chome、Bunkyo-ku，东京大学。
本发明的微生物可以包括通过紫外辐射，N-甲基亚硝基胍(NTG)处理，乙基甲磺酸(EMS)处理、亚硝酸处理、吖啶处理等得到的突变体或通过基因工程方法如细胞融合或遗传重组衍生的基因重组体。<2>从D-阿拉伯糖醇转化木糖醇反应途经的阐明
(1)从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应时间过程的观测
本发明的微生物作用于D-阿拉伯糖醇后，木糖醇就产生了。为了增加本转化反应的效率，试图阐明包含从D-阿拉伯糖醇到木糖醇生产的途经。
使用氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞，从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化反应如实施例1中显示的进行了详细的调研。上面反应时间过程的调研，首先伴随着D-木酮糖的生产D-阿拉伯糖醇快速消耗。然后，木糖醇的生产被观测到。
D-阿拉伯糖醇和木糖醇是立体异构体，其对称碳原子在2位，彼此是颠倒关系。D-阿拉伯糖醇或木糖醇2位羟基脱氢作用生成D-木酮糖。因此，从实施例1中得到的结果，估计从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化反应是由D-木酮糖介导的反应且它是由两步反应进行的，即，两步中一步是D-阿拉伯糖醇2位脱氢产生D-木酮糖和一步是D-木酮糖2位的酮基又立体选择性地还原产生木糖醇。基于这个观点，在本发明微生物可能有的D-阿拉伯糖醇的氧化性和D-木酮糖的还原性作了调研。
(2) D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性检测
已经调研了通过本发明的微生物参与D-阿拉伯糖醇氧化反应的酶的存在。作为作用于糖醇的脱氢酶，据报道有甘露醇脱氢酶(酶学方法，9(1966)147)和在氧化葡糖杆菌中山梨糖脱氢酶(农业生物化学，31(967)640)以及在假单胞菌属细菌中葡萄糖脱氢酶(农业生物化学，44(1980)1505)。不同膜结合型脱氢酶活性可以通过用高铁氰化钾作电子受体的方法进行检测。
已经调研了在用细胞匀浆从实施例2所说明的氧化葡糖杆菌ATCC621匀浆制备的本发明微生物中D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性的存在。结果，D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性通过用高铁氰化钾作电子受体的检测方法检测。
进一步，如实施例3中说明，从氧化葡糖杆菌ATCC 621制备的细胞匀浆准备作用在D-阿拉伯糖醇上，且从D-阿拉伯糖醇生产D-木酮糖的结果已实证了。
上述结果表明本发明的微生物有D-阿拉伯糖醇脱氢酶的活性，其参与了从D-阿拉伯糖醇到D-木酮糖的转化反应。
注意的是本发明还发现了一些有能力将D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的微生物。虽然它们大多在从D-阿拉伯糖醇到D-木酮糖的转化反应中利用NAD做辅酶，还是提出在那些属于葡糖杆菌属或醋杆菌属的细菌一种氧化了的醌的功能作为辅酶。
(3)D-木酮糖还原酶(D-木糖醇脱氢酶)活性的检测
接着，调研了通过本发明微生物参与D-木酮糖还原反应的酶。D-木酮糖还原酶(D-木糖醇脱氢酶)活性将D-木酮糖还原为木糖醇已知广泛存在于动物肝脏(生物化学杂志，225(1957)87)和微生物(生物化学生物生理学报48(1961)26，生物化学生物生理研究通讯，13(1960)554)等等。用NAD(H)或NADP(H)作辅酶细胞脱氢酶反应是可逆的。然而，大量的NAD(H)或NADP(H)对底物氧化作用和还原作用不同可以利用在340nm处吸光度的变化来测量从而检测酶活性。
已调研了D-木酮糖还原酶活性是否存在于本发明如实施例4所说明的用从氧化葡糖杆菌ATCC 621制备的无细胞提取物的微生物中。结果，需要NAD(H)作辅酶，D-木酮糖还原酶(D-木糖醇脱氢酶)活性被从无细胞提取物中检测到。
进一步，如实施例5所说明的，当从氧化葡糖杆菌ATCC 621制备的无细胞提取物被允许作用在D-木酮糖时，木糖醇的生产就被证实。进一步，在这个反应中，木糖醇产生的数量与NADH增加的数量成比例。
结果表明本发明的微生物在D-木酮糖还原酶(D-木糖醇脱氢酶)活性和D-阿拉伯糖转化反应包含这个酶的活性。
(3)通过增加碳源加强D-阿拉伯糖到木糖醇的转化。
如上所述，存在于本发明微生物中D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性和D-木酮糖还原酶(D-木糖醇脱氢酶)活性的证实，它揭示了本发明微生物在作用在从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化反应中，这个是两步反应包括其中D-阿拉伯糖醇被氧化从而转化为D-木酮糖的反应和其中D-木酮糖又被还原从而转化成木糖醇的反应。
在反应中氧化葡糖杆菌ATCC 621被允许作用在D-阿拉伯糖醇上以将其转化为木糖醇，木糖醇如实施例1中说明的那样生产和在一相对高浓缩的状态下富集。然而，产量还是不满意。分析这个反应，在第一步中D-阿拉伯糖醇氧化反应如此有利地进行从而D-阿拉伯糖醇完全消耗而第二步D-木酮糖还原反应不是完全进行从而有一部分D-木酮糖保持不反应，虽然延长反应时间反应也不能进一步进行。从而，认为要增加木糖醇的产量必须在第二步中增加D-木酮糖还原反应的效率。
如上述<2>(3)中阐述的，参与本发明微生物的D-木酮糖还原反应的木酮糖还原酶必须NAD(H)作辅酶和为了还原D-木酮糖要求NADH与D-木酮糖等摩尔数。提议认为在从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化反应中仍有D-木酮糖没反应的原因归结于反应所需的NADH不足。
认为如果NADH不足是原因，通过一些方法使NADH增殖就能使木酮糖的还原反应进行完全从而反应的产量就会增加。虽然NADH和NADPH在体内充当不同氧化还原酶的辅酶，众所周知利用细菌的代谢分别从NAD和NADP产生出NADH和NADPH。已报导了利用有需用NADH和NADPH作辅酶的氧化还原酶的微生物的还原反应的大量实例。例如，能被引证的有通过用酵母进行不对称还原反应生产(s)-2-羟基丙基苯基砜(农业生物化学，42(1978)451)，用希氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobium brockii)的休眼细胞进行不对称还原反应生产(S)-3-羟戊酸(Helv．Chim．Acta，68(1985)958)等等。在这些反应中，通过上面反应被氧化的底物一起增加合适的碳源而获得产量的增加。
因此，在通过本发明微生物从D-阿拉伯糖醇生产木糖醇中，预计通过微生代谢增加的碳源从NAD生产NADH是按照增加的碳源被代谢进行的从而在第二步木酮糖的还原反应能有利的进行而增加产量。
基于这个思想，如在实施例6中表明的，葡萄糖和乙醇被增加且被允许反应在用氧化葡糖杆菌ATCC 621的D-阿拉伯糖醇转化反应中且它们增加物的作用被检测。结果，增加物的作用如在实施例6中说明的被再认识。即，当没有碳源增加时，一部份D-木酮糖保持不反应，产生低产量的木糖醇而在增加碳源时，有利进行从D-木酮糖到木糖醇的还原且木糖醇产量最高到98％(基于D-阿拉伯糖醇的产量)。
即使当碳源被代谢时产生NADH，产生的NADH立即在D-木酮糖的还原反应中被使用和消耗，因此难以检测NADH产生的数量。然而，从通过本发明的微生物在D-阿拉伯糖醇转化反应中必须以NADH作辅酶。D-木酮糖还原酶活性的参与和如实施例4和5中说明的NADH依赖于产生的木糖醇数量来判断，推测从NAD产生NADH是根据增加的碳源被代谢而进行的。
如上所述，本发明人分析了有能力直接转化D-阿拉伯糖醇到木糖醇的细菌和阐明了参与转化反应的D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性和D-木酮糖还原酶(木糖醇脱氢酶)活性。同时，本发明人还发现在从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应中增加碳源以让木糖醇高产量稳定生产。
<4>培养本发明的微生物的培养方法和使用该微生物生产木糖醇的生产方法。
在下文中，本发明微生物的培养方法和通过微生物作用D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法将被描述。
培养那些微生物的培养基没有特别的限制是常用的培养基通常含有碳源，氮源，无机离子，且，如需要，有机养份也可被使用。作为碳源，可合适地使用碳水化合物如葡萄糖，醇如甘油，有机酸，或其它。氮源包括氨气、氨水、氨盐、硝酸盐等。磷源包括磷酸钾、磷酸钠等。作为无机离子，如果需求能适当使用镁离子，钾离子、铁离子、锰离子、硫酸根离子等。合适的有机营养包括维生素、氨基酸和肝脏提取物，酵母提取物，麦芽汁、蛋白胨、肉汁、玉米杆汁、酪蛋白水解产物等含有维生素和氨基酸的物质。
进一步，有时实际上作为诱导剂在培养基中增加糖或糖醇如D-木糖、D-木酮糖，D-阿拉伯糖醇，D-山梨醇、D-甘露醇、木糖醇等以增强参与从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应酶的活性。
培养的条件也不特别限制。例如，培养可以在有氧条件下，温度25-40℃，控制pH值pH 5-8 12-72小时实现。
上述培养的微生物在反应混合物中接触D-阿拉伯糖醇而生产木糖醇。在本发明的方法中，上述的“微生物”可以是微生细胞本身或微生物细胞的制剂产品，只要是产品有能力转化D-阿拉伯糖醇为木糖醇。具体地说，那样的制品包括含有微生物细胞的培养物，从培养物中被分离和回收的微生物细胞，微生物细胞代谢产物、用丙酮处理的微生物细胞或冻干的、细胞裂解溶液、细胞裂解溶液的级份或纯化酶级份、和那些处理细胞的固定化产物。
在D-阿拉伯糖醇的浓度上没有特别的限制且通常用1-50％(w／v)，优选5-40％(w／v)就产生好结果。上面的反应，底物D-阿拉伯糖醇的增加，其一部分可能导致增加产量。对于反应条件没有特殊的限制，且通常反应是在有氧条件下，反应温度20-60℃，优选30-40℃，反应pH为3．0-10．0，优选的是4．0-7．0，就有好结果。木糖醇的产量有时能通过防止在反应时pH值降低来增加，例如，加入碳酸钙到反应混合物使浓度为2％(w／v)。静止反应和搅拌反应均可用。反应时间优选为1-100小时，虽然它依赖于不同条件如所用微生物活性或D-阿拉伯糖醇的浓度。
在本发明中，为了增加从D-阿拉伯糖醇转化为木糖醇的效率和在高产量下富集木糖醇，合适的碳源或NADH被加入到上面的反应体系中。在实际中有能力代谢碳源的微生物细胞，特别是活细胞被用做微生物，在反应体系中增加碳源，伴随着碳源的代谢导致NADH从NAD产生。结果，从D-木酮糖到木糖醇的转化反应顺利进行。在实际中处理过的细胞产物如细胞匀浆。特别是处理过的那些属于葡糖杆菌属和醋杆菌属的细菌的细胞产物被利用，D-木酮糖的还原反应通过直接加NADH到上述的反应体系中能使反应有效进行。
上面所述的碳源没有特殊的限制只要它的代谢伴随有NADH生成，且包括糖、糖衍生物、醇、醛、有机酸等。糖的实例包括葡萄糖、果糖、蔗糖、和乳糖。糖衍生物实例包括糖醇如山梨醇、甘露醇和甘油，醛糖糖酸如葡糖酸等。另外，醇的例子包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇等。醛的例子包括甲醛、乙醛、丙醛、异丁醛、甘油醛等。有机酸的例子包括甲酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸等。这些碳源可单独或任两个或多个做混合物使用。增加的碳源数量可变化，这取决于使用的细菌细胞的活性、D-阿拉伯糖醇的浓度等条件，当总量在0．2-40％(w／v)的范围、优选为0．5-20％(w／v)时将得到好的结果。增加碳源的时间没有特殊的限制，且他们可以在反应开始或反应期间或部分加入。
如上述培养基产生的木糖醇用传统方法从反应混合物中回收和分离。具体地说，用离心、过滤或类似方法除去固体物，所得液体部分用活性碳或离子交换树脂脱色和脱盐，然后所要的产品从溶液中结晶。
附图简述
图1是用氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应时间进程说明图；
图2是用氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞没有添加任何碳源或添加葡萄糖和乙醇的从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应时间进程说明图。
实现发明的最佳模式
本发明将参照实施例更详细地说明，但不能解释为被这些实例所限制。在下面实施例中，起始原料，D-阿拉伯糖醇和产生的木糖醇用高效液相色谱(HPLC)在下列条件下分析：
柱子：Shodex SC 1211(产于Showa Denko)
流动相：50％ 乙腈／50％ 50ppm Ca-EDTA水溶液
流速：0．8ml／min
温度：60℃
检测器：红外检测器
实施例1
通过氧化葡萄糖杆菌ATCC 621从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化反应时间过程
含有2．4％马铃薯葡萄糖(Difco公司制造)，3％酵母提取液(Difco)，0．5％肉汁(Difco)和1．5％甘油的培养基(pH 7．0)50ml分散于500ml坂口瓶中，120℃消毒15分钟。在D-阿拉伯糖醇溶液120度消毒15分钟之后，加入到上述培养基中到浓度为3．0％。进一步，1g的碳酸钙，200℃消毒120分钟之后，加入到上述培养基中。氧化葡糖杆菌ATCC 621接种到上述培养基中并在30℃振动培养3天。用离心的方法从培养液中收集细菌细胞并立即用生理盐水中洗。
D-阿拉伯糖醇溶解在0．1M磷酸缓中液(pH 6．0)中到浓度5％(w／v)，将中洗过的细胞按湿重约10％(w／v)加入到溶液中。10ml这种反应液放置到试管中，30℃振动使之反应，从反应开始后6，12，24和48小时分别取出1ml样品。通过离心方法除去细菌细胞，反应产物采用HPLC分析。图1说明了结果。
按照图1的说明，首先D-阿拉伯糖醇被快速消耗且伴随着其消耗，观测到D-木酮糖生产，当生产半途停止时，即使反应时间延长，反应也不能继续进行。
实施例2
氧化葡糖杆菌ATCC 621的阿拉伯糖醇脱氢酶活性检测
含有2．4％(w／v)马铃薯葡萄糖(Difco公司制造)，3％酵母提取液(Difco)，0．5％肉汁(Difco)的培养基(pH 7．0)50ml分散于500ml坂口瓶中，120℃消毒15分钟。在D-阿拉伯糖醇溶液120℃消毒15分钟之后，加入到上述培养基中到浓度为2．0％。进一步，1g的碳酸钙，200℃消毒120分钟之后，加入到上述培养基中。将氧化葡糖杆菌ATCC 621接种到上述培养基中并在30℃振动培养3天。用离心的方法从培养液中收集细菌细胞并立即用生理盐水冲洗一次。
从100ml的培养液中收集的湿重约1．0g培养的细菌细胞悬浮在10ml 0．1M磷酸缓中液(pH 7．0)中，4℃超声20分钟制备细胞匀浆。匀浆的蛋白质浓度通过用BSA(牛血清白蛋白)(SIGMA公司制造)以Bradford方法(生物化学分析，72．248(1976))和Bio-rad蛋白分析试剂(Bio-rad制造)测定。
按照Iiyama等的方法(农业生物化学，42(1978)2063)D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性被测定。反应是在25℃，30分钟完成的，600μl反应混合物含有10mM高铁氰化钾，100mM D-阿拉伯糖醇，100mM醋酸钠缓中液(pH 5．0)和2μl的pH 5．0细胞匀浆。300μl的Dupanol试剂(5g／L n-水合硫酸铁(Ⅲ)，3g／L SDS，95ml／l 85％磷酸)加入以停止反应且加入2100μl的无菌水，接着，在室温20分钟后在660nm测吸光度以测定高铁氰化钾的产生。酶的活性是在本发明的反应条件下在1分钟内通过氧化1μmol的D-阿拉伯糖醇产生1μmol的高铁氰化钾定义为1个单位。作为用本方法测定的D-阿拉伯糖醇脱氢酶活性的结果，测定活性为1．46单位／毫克蛋白。
实施例3
用从氧化葡糖杆菌ATCC 261细胞制备的细胞匀浆的D-阿拉伯糖醇的氧化反应
用如实施例2中同样的方式从氧化葡糖杆菌ATCC 261细胞制备的细胞匀浆，进行D-阿拉伯糖醇的氧化反应。D-阿拉伯糖醇的氧化反应是在1ml的反应混合物中完成的。反应混合物含有1％(w／v)D-阿拉伯糖醇，0．1M醋酸钠缓中液(pH 5．0)和0．1ml的细胞匀浆。反应混合物在pH 5．0和25℃下温和地振动下，反应进行24小时。反应完成后，反应产物用HPLC分析，表明D-阿拉伯糖醇彻底消耗，产生和累积了0．88％(w／v)D-木糖和0．05％木糖醇。
实施例4
在氧化葡糖杆菌中D-木酮糖还原酶活性的测定
湿重大约1．0g如实例2中同样方式制备的氧化葡糖杆菌ATCC 621培养细胞悬浮在10ml，0．1M磷酸盐缓冲液中(pH 7．0)中，4℃超声20分钟以制备细胞匀浆。细胞匀浆离心(8000rpm，10分钟)以除去细胞碎片制备无细胞提取液。
按照Kerster等的方法(酶学方法，9(1966)170)，D-木酮糖还原酶必须是NADH或NADPH作辅酶，其活性通过木糖醇脱氢反应测量，这是木糖醇生产反应的逆反应。反应在1ml的反应混合物中在30℃进行10分钟，反应混合物含有2mM NAD或NADP，100mM木糖醇，100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8．0)和50μl pH 8．0的无细胞提取液。反应在小杯中进行且连续测量在340nm的吸光度化。以340nm下吸光度的增加检测NADH或NADPH的生产。在本反应条件下在一分钟内氧化1μmol的木糖醇生成1μmol的NADH或NADPH的酶活性被定义为1个单位。
当NAD被作辅酶加入时，结果检测到2．57单位／mg蛋白的高活性。另一方面，当NADP(H)被加入时，没有活性，表示NADPH不能充当辅酶。
实施例5
用从氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞制备的无细胞提取液的D-木酮糖的还原反应
如实施例4中同样的方式从氧化葡糖杆菌ATCC 621制备无细胞提取液。无细胞提取液被2L的0．1M磷酸盐缓冲液透析以除去低分子量化合物。D-木酮糖的还原反应用无细胞提取液进行。D-木酮糖的还原反应在1ml的反应混合物中进行，反应混合物含有1％(w／v)D-木酮糖，0．1M醋酸钠缓中液(pH 5．0)，在表1中表明的每种辅酶浓度，和0．1ml的无细胞提取物。反应混合物在pH 5．0 30℃下温和振动，反应进行24小时。反应完成后，细菌细胞由离心移去，反应产物由HPLC分析。
如表1显示的结果，木糖醇产物只有在NADH加入时被检测。木糖醇的生产量依赖于NADH的加入量，且木糖醇产量与NADH加入的数量成大致或等摩尔关系。
表1：通过用从氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞制备的无细胞提取液的D-木酮糖还原反应生成的木糖醇的量
| 添加的辅酶 | 添加的浓度(mM) | 产生的木糖醇(％(w／v)) | 产生的木糖醇(mM) |
| 没有 | 0 | 未测到 | - |
| NADH | 5 | 0．07 | 4．6 |
| NADH | 10 | 0．15 | 9．9 |
| NADH | 15 | 0．21 | 13．8 |
| NADPH | 5 | 未测到 | - |
| NAD | 5 | 未测到 | - |
| NADP | 5 | 未测到 | - |
实施例6
通过氧化葡糖杆菌ATCC 621细胞从D-阿拉伯糖醇到木酮糖的转化反应中加入葡萄糖和乙醇的影响
含有2．4％马铃薯葡萄糖(Difco公司制造)，3％酵母提取液(Difco)，0．5％肉汁(Difco)和1．5％甘油的培养基(pH 7．0)50ml分散于500ml坂口瓶中，120℃消毒15分钟。在D-阿拉伯糖醇溶液120℃消毒15分钟之后，加入到上述培养基中到浓度为3．0％。进一步，1g的碳酸钙，200℃消毒120分钟之后，加入到上述培养基中。氧化葡糖杆菌ATCC 621接种到上述培养基中并在30℃振动培养3天。用离心的方法从培养液中收集细菌细胞并立即用生理盐水冲洗一次。
D-阿拉伯糖醇溶解在0．1M磷酸缓冲液(pH 6．0)中到最终浓度5．24％(w／v)，各10ml这种反应液分配到试管中。向反应混合物中加入按湿重约10％(w／v)的细菌细胞和2％(w／v)的碳酸钙以防止在反应时pH降低。反应在30℃振动进行。在其中加入碳源，1％(w／v)葡萄糖在反应开始时被加入，5％(w／v)乙醇为进一步反应在反应开始后6小时加入。在反应开始了分别6、24和48小时，每1ml样品被取出，然后用离心方法除去细菌细胞，用HPLC分析反应产物。
按图2的说明，葡萄糖和乙酸的增加导致在产物中木糖醇量显著增加，因此这些增加物相当的影响被观察到。如果无碳源加入，D-阿拉伯糖醇基本上被完全氧化为D-木酮糖。甚至不增加任何碳源的反应中，通过加碳酸钙防止反应时pH下降也导致木糖醇产量少量增加，更具体地说1．23％(w／v)的木糖醇在24小时的反应中生成。然而，部份D-木酮糖仍不反应，产量没没进一步的增加。相反，有碳源的增加，D-木酮糖基本上完全还原为木糖醇，且在24小时时，木糖醇生产和富集高达5．24％(w／v)(98％基于D-阿拉伯糖醇)。
实施例7
通过氢化葡糖杆菌ATCC 621细胞在从D-阿拉伯糖醇到木糖醇转化反应中加入糖和糖醇的效果
D-阿拉伯糖醇溶解在0．1M磷酸缓中液(pH 6．0)中到最终浓度5％(w／v)，各5ml这种反应液分配到试管中。向反应液中按湿重加10％(w／v)与例6中同样方法制备的细菌细胞和2％(w／v)的碳酸钙，反应在30℃振动进行。反应6小时后，5％(w／v)不同糖和糖醇如表2所示加入以进一步反应。反应进行27小时后，离心除去细菌细胞和用HPLC测定木糖醇产生的量。如表2所示，木糖醇产量增加由加入不同糖和糖醇再一次确认。
表2木糖醇生产反应中加入糖和糖醇的影响
| 增加的碳源 | 产生木糖醇量(％(w／v)) |
| 无 | 1．7 |
| D-葡萄糖 | 4．5 |
| D-果糖 | 2．81 |
| D-山梨醇 | 2．62 |
| 甘油 | 3．08 |
实施例8
通过氢化葡糖杆菌ATCC 621细胞从D-阿拉伯糖到木糖醇转化反应中加入有机酸和醇的影响
D-阿拉伯糖醇溶解在0．1M磷酸缓中液(pH 6．0)中到最终浓度5％(w／v)，5ml这种反应液放置到试管中。向反应液中按湿重加10％(w／v)与实施例6中同样方法制备的细菌细胞和2％(w／v)的碳酸钙，反应在30℃振荡进行。反应开始6小时和10小时后，5％(w／v)延胡索酸、乙酸、葡醛酸或柠檬酸、或1％(w／v)甲醇、乙醇或丙醇加入以进一步反应。反应进行27小时后，离心除去细菌细胞和用HPLC测定木糖醇产生的量。如表3所示，木糖醇产量增加由加入不同有机酸和醇再一次确认。
表3：在木糖醇生产反应中加入有机酸或醇的影响
| 增加的碳源 | 产生木糖醇量(％(w／v)) |
| 无 | 1．7 |
| 甲酸 | 2．63 |
| 乙酸 | 2．43 |
| 葡糖酸 | 2．23 |
| 柠檬酸 | 2．44 |
| 甲醇 | 1．9 |
| 乙醇 | 3．31 |
| 丙醇 | 2．98 |
实施例9
通过木质醋杆菌ATCC 14851细胞反应的木糖醇生产
含有2．4％马铃薯葡萄糖(Difco公司制造)，3％酵母提取液(Difco)，0．5％肉汁(Difco)和1．5％甘油的培养基(pH 7．0)40ml分散于500ml坂口瓶中，120℃消毒15分钟。在分别含有D-阿拉伯糖醇、木糖醇和木酮糖溶液120℃消毒15分钟之后，分别加入到上述培养基中到浓度为2．0％、1．0％和1．0％。进一步，1g的碳酸钙，200℃消毒120分钟之后，加入到上述培养基中。木质醋杆菌ATCC 14851接种到上述培养基中并在30℃振动培养3天。用离心的方法从培养液中收集细菌细胞并立即用生理盐水中洗。
D-阿拉伯糖醇和D-葡萄糖溶解在0．1M磷酸缓中液(pH 6．0)中到最终浓度分别为5％(w／v)和1％(w／v)，5ml这种反应液放置到试管中。向反应液中按湿重加1％(w／v)细菌细胞和加2％(w／v)的碳酸钙。反应在30度振动进行。如果碳源加入其中，反应开始时1％(w／v)葡萄糖被加入和5％(v／v)乙醇在从反应开始6小时后加入以进一步反应。反应在开始后24小时被中止。用离心除去细菌细胞，反应产物用HPLC分析。如果没有加碳源，部分D-木酮糖仍保持不反应且产生的木糖醇的量是0．98％(w／v)(产量20％是基于D-阿拉伯糖醇)，而如果加入碳源，转化反应的效率被增加和木糖醇被产生和富集，产量高达2．57％(w／v)(产量的51％基于D-阿拉伯糖醇)。
工业实用性
本发明能利用D-阿拉伯糖醇作起始原料由一个简单方法生产木糖醇。
Claims (8)
1．生产木糖醇的方法，包括将具有转化D-阿拉伯糖醇为木糖醇能力的微生物与D-阿拉伯糖醇反应以生产木糖醇的步骤，其中碳源或NAOH被加入到反应系统中。
2．在权利要求1的方法，其中所说的微生物是微生物细胞，碳源被加入到反应系统中或当所说的微生物是细胞的制品时，NADH被加入到反应系统中。
3．在权利要求1的方法，其中所说的微生物有D-阿拉伯糖醇脱氢酶的活性和D-木酮糖还原酶(木糖醇脱氢酶)活性。
4．权利要求1的方法，其中所说的微生物是具有代谢碳源产生NADH之能力的微生物。
5．在权利要求1中要求的方法，其中所说的微生物是属于葡糖杆菌属和醋杆菌属的微生物。
6．在权利要求5中要求的方法，其中所说的属于葡糖杆菌属和醋杆菌属的微生物是氧化葡糖杆菌或木质醋杆菌。
7．在权利要求2中要求的方法，其中被加入到反应系统中的碳源选自糖、糖衍生物、醇、醛、有机酸和其混合物。
8．在权利要求7中要求的方法，其中所说的糖、糖的衍生物、醇、醛和有机酸选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇、甘油、葡糖酸、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1，4-丁二醇，2，3-丁二醇，甲醛、乙醛、丙醛、异丁醛、甘油醛、甲酸、乙酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸及其混合物。
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