CN116410883A - 一种谷氨酸棒杆菌菌株及其在l-赖氨酸生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌菌株及其在L‑赖氨酸生产中的应用。谷氨酸棒杆菌CathS141的保藏编号为CCTCC M 20211495。本发明还在于提出一种发酵L‑赖氨酸的生产方法，所述方法包括利用谷氨酸棒杆菌CathS141制备种子液，和/或发酵生产L‑赖氨酸。本发明所使用的谷氨酸棒杆菌菌株具有良好的耐受木质纤维素预处理产生的抑制物的性能，对木质纤维素水解液体系具有良好的适应能力，在复杂体系中可以达到较高的L‑赖氨酸产量和得率，具有良好应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐毒性的谷氨酸棒杆菌，以及利用耐毒性谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，本发明属于生物发酵和微生物技术领域。
技术背景
L-赖氨酸是动物可吸收利用的必需氨基酸之一，是世界上仅次于味精的第二大氨基酸，主要应用于饲料工业、食品和医药领域，其次也可作为前体合成聚赖氨酸用于防腐剂，或者合成生物基尼龙新型材料。目前，赖氨酸主要由微生物发酵方式获得，常见菌株有大肠杆菌及谷氨酸棒杆菌，发酵原料范围较广，常见有淀粉、葡萄糖。
生物炼制将生物质转化过程进行整合，生产燃料、能源和生物基化学品，能够利用可再生的生物质作为原料并将其转化为燃料等不同的产品，有利于农业经济和工业发展，受国际油价制约较少。相比于传统的石油炼制，生物炼制在生产过程中温室气体排放量少，对更加环境友好。常见的生物质有农林废弃物、生活垃圾及畜禽粪便等。其中农业废弃物的秸秆来源木质纤维素，已有完整的处理生产发酵的方式。常见的过程为：原料收集、预处理、脱毒、糖化、发酵及产物分离纯化等。木质纤维素的预处理过程会产生多种抑制物，例如糠醛、羟甲基糠醛、松柏醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草醛、乙酰丙酸，抑制物的存在不仅会抑制纤维素酶的活性，降低酶解的糖化效率，还会抑制发酵微生物的生长和代谢从而降低发酵指标。目前已知的脱毒方式有水洗、活性炭吸附、离子交换、氢氧化钙过中和等，其中还有一种“生物脱毒”，即利用微生物自身分泌的酶类降解抑制物。木质纤维素水解液的发酵有两种方式：一是木质纤维素水解液中添加微生物或酶制剂，在发酵阶段之前去除去抑制物，二是通过遗传改造或适应性进化使发酵菌株具备一定的抵抗或降解抑制物的能力。由于抑制物的种类较多，很难达到在发酵前将所有抑制物都去除。因此，获得可以在存在抑制物的水解液中可以生长和发酵的菌株，就显得很有必要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CathS141，其保藏编号为CCTCC M 20211495。
本发明的第二个目的在于提出上述谷氨酸棒杆菌在L-赖氨酸生产中的应用。
本发明的第三个目的在于提出一种L-赖氨酸的生产方法，所述方法包括利用谷氨酸棒杆菌CathS141制备种子液，和/或，发酵生产L-赖氨酸。
本发明具有以下优点：
本发明所使用的谷氨酸棒杆菌菌株具有良好的耐受木质纤维素预处理产生的抑制物的性能，谷氨酸棒杆菌对木质纤维素水解液体系具有良好的适应能力，在复杂体系中可以达到较高的L-赖氨酸产量和得率，具有良好应用前景和经济效益。
具体实施方式
如前所述，本发明第一方面在于提供一株谷氨酸棒杆菌。
本申请的发明人从土壤中，通过分离纯化获得一株可以生产L-赖氨酸的菌株，产酸的菌株参照《常见细菌系统鉴定手册》，并对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；并使用16S rDNA序列在GenBank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用物理及化学诱变方法，再通过存在抑制物培养基中耐受条件下筛选获得上述菌株，命名为谷氨酸棒杆菌CathS141。所述谷氨酸棒杆菌可以在抑制物存在下高效生产高浓度的L-赖氨酸。
如前所述的，本发明的第二个目的在于提出上述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CathS141在L-赖氨酸生产中的应用。
如前所述的，本发明的第三个目的在于提出一种L-赖氨酸的生产方法，所述方法包括：通过利用如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌CathS141制备种子液，和/或，发酵生产L-赖氨酸。
于一些实施方式中，发酵过程中的pH为6～8，进一步为6～7。
于一些实施方式中，发酵赖氨酸过程中使用pH中和剂对pH值进行调控，使用的pH中和剂包括但不限于氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钙中的一种或几种。
于一些实施方式中，发酵培养基的种子液的接种量为5％～20％，例如10％，所述百分比为体积百分比。优选地，所述种子液稀释40倍后的菌体光密度OD600为0.1～0.8，优选为0.2～0.6，例如为0.35、0.40、0.42。
于一些实施方式中，发酵温度为28℃～32℃，例如30℃。
作为本发明的一优选实施方式，利用谷氨酸棒杆菌CathS141发酵生产L-赖氨酸的方法包括：
向发酵培养基中接种谷氨酸棒杆菌CathS141的种子液，种子液的接种量为5％～20％(v/v)，在28℃～32℃、pH为6～8的条件下发酵生产L-赖氨酸。
于一些实施方式中，发酵培养基中含有10～150g/L的葡萄糖，进一步为含有25～130g/L的葡萄糖。
于一些实施方式中，除葡萄糖外，发酵培养基中还含有供发酵菌株生长、繁殖或合成L-赖氨酸的其他成分，例如磷酸二氢钾，和/或，尿素，和/或，硫酸镁，和/或，甲硫氨酸，和/或，玉米浆，和/或酵母膏。
于一实施方式中，所述发酵培养基中含有25～130g/L葡萄糖，0.05～5g/L磷酸二氢钾，0.5～10g/L尿素，0.05～3g/L硫酸镁，0.05～4g/L甲硫氨酸，5～80g/L玉米浆。
于一实施方式中，所述发酵培养基中的葡萄糖来源于农林废弃物水解处理获得的水解液。
于一实施方式中，发酵培养基含有农林废弃物水解处理获得的水解液。用于提供发酵用的葡萄糖。
于一实施方式中，通过向农林废弃物的水解液中添加玉米浆、磷酸二氢钾、尿素、硫酸镁、甲硫氨酸后制备得到发酵培养基。
于一实施方式中，所述农林废弃物包括但不限于秸秆(优选包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆)、稻草、稻壳、蔗渣、木材、木屑中的至少一种。农林废弃物中含有大量的木质纤维素。
于一实施方式中，利用纤维素酶将农林废弃物水解处理为含有葡萄糖的水解液。
于一实施方式中，所述的水解液中含有10～150g/L的葡萄糖，进一步为含有25～135g/L的葡萄糖。上述水解液可以是经过浓缩或稀释处理后的，也可以是未经过浓缩或稀释处理的。
于一些实施方式中，在水解处理前，可以将所述农林废弃物进行预处理。所述预处理例如为干法稀酸预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维爆破预处理、碱预处理和离子液体预处理。
于一实施方式中，所述的水解液可以经过或不经过脱毒处理。
于一些实施方式中，在水解处理前、水解处理的同时、或水解处理后进行脱毒处理。
例如，在水解处理前，将所述农林废弃物进行脱毒处理。
例如，在水解处理后，将所述水解液进行脱毒处理。
通过脱毒处理去除对菌株发酵L-赖氨酸有影响的毒性抑制物。本发明对脱毒处理的方式不作特别限定。脱毒处理的方式包括水洗、石灰处理、离子交换吸附、活性炭吸附和利用微生物菌株脱毒(简称生物脱毒)等。
于一优选实施方式中，通过能够降解毒性抑制物的菌株例如宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii Bainier)对所述农林废弃物或所述的水解液进行脱毒处理，从而降低毒性抑制物的含量。
在一些实施方式中，所述秸秆水解液含有葡萄糖和以下所列的至少一种成分：糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、乙酰丙酸。
在一些实施方式中，秸秆水解处理液中含有糠醛0～3g/L，和/或，羟甲基糠醛0.02～5g/L，和/或，4-羟基苯甲醛0.01～3g/L，和/或，乙酰丙酸0.5～15g/L。
具体实施方式
下面结合实施例来解释本发明，实施例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权力要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
预备例1秸秆水解液的制备
将玉米秸秆和稀硫酸溶液(浓度7％～15％)以(1～7):1的固液比(g/g)加入到反应容器中，利用168～200℃的饱和水蒸汽对反应物进行加热，加热时间为6～20min，然后利用纤维素酶在温度为49～53℃酶解，获得秸秆水解液。向秸秆水解液中接种脱毒菌株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii Bainier)，在33～38℃条件下进行生物脱毒，然后离心，收集上清液，获得秸秆水解液。
参照上述操作条件，制备得到抑制物含量不同的秸秆水解液，组成见表1。
表1
上述含有抑制物的秸秆水解液用于后续配制发酵培养基，提供发酵需要的糖。
实施例1耐毒性谷氨酸棒杆菌的筛选、分离与鉴定
收集乌苏土壤样品，每1g土壤样品添加至10mL无菌水中，剧烈混匀1min后将静置沉淀一段时间，再将原样品分别稀释成10-3、10-4、10-5涂布在含有100mg/L制霉菌素的LB琼脂平板上，并在30℃下培养。经多次划线分离培养，获得纯化单菌落。
通过分离纯化获得一株可以生产L-赖氨酸的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取该菌株的DNA，以其DNA为模版，使用细菌通用引物27F和1492R，并使用16S rDNA进行PCR扩增，进行测序后获得菌株16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
小麦秸秆经过酸预处理、脱毒和酶水解后得到秸秆水解液，以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用紫外线、亚硝基胍、5-氟尿嘧啶、ARTP等多次单独诱变及复合诱变，获得能够耐受秸秆水解液中的毒性抑制物进行正常的生长和赖氨酸生产的稳定菌株。将该菌株命名为CathS141，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC M 20211495，保藏日期2021年11月29日。
实施例2谷氨酸棒杆菌CathS141生产L-赖氨酸的稳定性
种子培养基：25g/L葡萄糖，1.5g/L磷酸二氢钾，2.5g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，25g/L玉米浆。
发酵培养基：1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，0.5g/L甲硫氨酸，20g/L玉米浆，70g/L葡萄糖。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CathS141经过传代实验验证，经过八次传代后菌落形态及生产转化L-赖氨酸的能力均未出现明显变化。
使用谷氨酸棒杆菌CathS141发酵生产L-赖氨酸，具体的方法如下：将前述获得的第一代和第七代菌株进行摇瓶发酵生产L-赖氨酸的性能验证。取一支谷氨酸棒杆菌CathS141甘油管(第一代和第七代各一支)分别在LB琼脂平板上划线，在30℃下培养48h至平板上长出单克隆，第一代和第七代分别挑取单克隆接入种子培养基中，在30℃条件下培养过夜，然后以10％(v/v)的接种量接入另一新鲜的种子培养基中，继续在30℃条件下培养至OD600为0.4(水稀释40倍)，最后接种到装有发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(v/v)，于30℃、200rpm条件下发酵，发酵过程中控制pH值为6.5-7.0，发酵至不再产生L-赖氨酸时发酵结束，核磁法检测第一代和第七代菌株的L-赖氨酸产量分别为13.9g/L和14.4g/L。
可以看出，谷氨酸棒杆菌CathS141可以将葡萄糖转化为L-赖氨酸，且传代稳定性良好。
实施例3谷氨酸棒杆菌CathS141利用秸秆水解液1进行发酵
种子培养基：25g/L葡萄糖，1.5g/L磷酸二氢钾，2.5g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，25g/L玉米浆。
发酵培养基：秸秆水解液1中添加1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，0.5g/L甲硫氨酸，20g/L玉米浆。
取1支实施例1获得的谷氨酸棒杆菌CathS141甘油管种子接入种子培养基中，接种量10％(v/v)，30℃培养活化后，得到一级种子液，将一级种子液接入另一新鲜的种子培养基中，接种量10％(v/v)，接入二级种子液，在30℃、200rpm条件下培养至种子液的OD600达到了0.42(水稀释40倍)，得到成熟的种子液。
将5mL成熟的种子液接种至装有50mL发酵培养基的摇瓶中。发酵过程中控制pH为6.5-7.0，温度30℃，发酵至不再产生L-赖氨酸时发酵结束。以出发菌株为对照菌株。发酵结果见表2。
表2
实施例4谷氨酸棒杆菌CathS141利用秸秆水解液2进行发酵
与实施例3的区别仅仅在于：本实施例4中发酵培养基为秸秆水解液2中添加1g/L磷酸二氢钾，3g/L尿素，0.6g/L硫酸镁，0.5g/L甲硫氨酸，20g/L玉米浆。
以出发菌株为对照菌株。发酵结果见表3。
表3
对照组菌株生长受到毒性抑制物的抑制，即使再延长时间也无法再发酵生产L-赖氨酸。说明谷氨酸棒杆菌CathS141具有良好的耐受木质纤维素预处理产生的抑制物的性能。
Claims (10)
1.一种谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为谷氨酸棒杆菌CathS141，菌株的保藏编号为：CCTCC M 20211495。
2.一种如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌在L-赖氨酸生产中的应用。
3.一种L-赖氨酸的生产方法，所述方法包括：通过利用如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌CathS141制备种子液，和/或，发酵生产L-赖氨酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，用于生产L-赖氨酸的发酵培养基中含有10～150g/L的葡萄糖，进一步为含有25～130g/L的葡萄糖。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养基中的葡萄糖来源于农林废弃物水解处理获得的水解液；
优选地，所述农林废弃物包括但不限于秸秆、稻草、稻壳、蔗渣、木材、木屑中的至少一种，所述秸秆优选包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用纤维素酶将农林废弃物水解处理为含有葡萄糖的水解液；和/或，
在水解处理前，将所述农林废弃物进行预处理；和/或，
在水解处理前、水解处理的同时、或水解处理后进行脱毒处理。
7.如权利要求3或4或5所述的方法，发酵温度为28℃～32℃，和/或发酵控制pH为6～8，进一步为6～7。
8.如权利要求3或4或5所述的方法，发酵培养基的种子液的接种量为5％～20％，所述百分比为体积百分比，
优选地，所述种子液稀释40倍后的菌体光密度OD600为0.1～0.8，进一步为0.2～0.6。
9.如权利要求5或6所述的方法，水解液中含有10～150g/L的葡萄糖，进一步为含有25～135g/L的葡萄糖。
10.如权利要求4所述的方法，除葡萄糖外，发酵培养基中还含有供发酵菌株生长、繁殖或合成L-赖氨酸的其他成分，例如磷酸二氢钾，和/或，尿素，和/或，硫酸镁，和/或，甲硫氨酸，和/或，玉米浆，和/或酵母膏；
优选地，发酵培养基中含有25～130g/L葡萄糖，0.05～5g/L磷酸二氢钾，0.5～10g/L尿素，0.05～3g/L硫酸镁，0.05～4g/L甲硫氨酸，5～80g/L玉米浆。
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