KR20120135157A - 발효 폐기물을 이용한 바이오 연료물질 및 바이오 화학물질 제조방법 - Google Patents

발효 폐기물을 이용한 바이오 연료물질 및 바이오 화학물질 제조방법 Download PDF

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Abstract

알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계, 상기 배양배지에 미생물을 접종하는 단계 및 상기 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함하는 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조 방법이 개시되어 있다.

Description

발효 폐기물을 이용한 바이오 연료물질 및 바이오 화학물질 제조방법{METHOD FOR PREPARING BIOFUELS AND BIOCHEMICALS USING ETHANOL FERMENTATION WASTE}
바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조방법에 관한 것으로, 제조공정에서 원료 및 에너지 비용을 획기적으로 줄일 수 있어 경제적이고 친환경적인 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조방법에 관한 것이다.
미생물을 특수한 환경에서 인위적으로 배양하기 위해서는 배양배지 내에 다양한 영양성분들을 첨가하여야 하며, 이러한 미생물의 영양성분 요구도는 미생물의 종류에 따라서 각각 다르다. 따라서 상기의 미생물 영양성분 요구도를 충족시키기 위하여 일반적으로 무기염류, 아미노산, 비타민, 펩톤(peptone), 옥수수 추출물(corn steep liquor), 효모 추출물(yeast extract) 등의 영양성분들이 첨가된 다양한 배양배지들이 사용되고 있다. 미생물 배양배지는 크게 무기염류, 아미노산, 비타민 등과 같이 화학적으로 성분이 명확히 규명된 영양성분만을 함유하는 합성 배양배지(synthetic medium)와 펩톤, 옥수수 추출물, 효모 추출물 등과 같이 화학적으로 성분이 명확하게 규명되지 않은 영양성분들을 함유하는 복합 배양배지(complex medium)로 나누어진다.
합성 배양배지를 개발하기 위해서는, 상기에서 언급한 바와 같이 미생물 종류에 따라서 요구되는 영양성분들이 각각 다르므로 해당 미생물 배양에 필요한 모든 영양성분들을 밝혀내는 작업이 선행되어야 한다. 이를 위하여 일반적으로 무기염류을 포함하는 배양배지에 모든 종류의 아미노산 및 비타민을 첨가한 배양배지를 제조한 후 상기의 배양배지에서 미생물을 배양하여 이의 성장여부를 확인한다. 미생물 성장이 확인된 경우에는, 상기의 배양배지에 첨가된 영양성분들 중에서 한 영양성분이 제거된 배양배지를 다시 제조한 후 상기의 특정 영양성분이 제거된 배양배지에서 미생물을 배양하여 이의 성장 여부를 확인한다. 미생물 성장이 확인된 경우에는, 상기의 배양배지에 첨가된 영양성분들 중에서 또 다른 한 영양성분이 제거된 배양배지를 다시 제조한다. 이에 반하여 미생물 성장이 확인되지 않은 경우에는, 제거된 영양성분을 합성 배양배지 제조에 첨가되어야 할 필수 영양성분으로 정의하고, 추후의 배양배지 제조에서는 반드시 첨가한다. 현재까지는 일반적으로 상기의 방법을 반복적으로 실행하여 미생물 배양에 필요한 모든 영양성분들을 밝혀내는 작업을 수행하여 합성 배양배지를 개발하여 왔다 (Zhang et al., App. Microbiol. Biotechnol., 51:407, 1997). 하지만 상기의 방법은 단일삭제법(single omission technique)이란 시행착오적인 방법으로 막대한 시간, 인력, 연구비용이 소요된다. 보다 최근에는 단일삭제법을 보완하기 위한 통계적인 배양배지 개발 방법들이 연구자들에 의하여 제안되고 있다.
상기에서 기술한 단일삭제법 및 통계적인 방법들을 이용하여 미생물 배양에 필요한 영양성분들을 모두 확인한 후에는 각각의 영양성분들에 대하여 미생물 성장을 촉진하기 위하여 필요한 배양배지에 첨가하여야 하는 최적의 영양성분 양을 확인하여야 하며, 이 역시 막대한 시간, 인력, 연구비용 등이 소요되는 작업이다. 또한 상기에서 언급한 합성 배양배지 방법은 성공확률이 매우 낮아 실질적으로 널리 사용되지 못하고 있다. 특히 상당수의 미생물들은 모든 아미노산 및 비타민이 함유된 합성 배양배지에서도 성장할 수 없다는 단점을 가지고 있다. 이와 함께 대다수의 미생물들은 합성 배양배지보다 복합 배양배지의 영양성분으로 첨가되는 효모 추출물을 함유하는 배양배지에서 성장이 보다 촉진된다. 무엇보다 화학적으로 성분이 명확히 규명된 합성 배양배지의 제조에 첨가되는 아미노산이나 비타민의 가격이 매우 비싸므로, 미생물 배양을 통한 바이오 연료물질 및 화학물질의 산업적인 대량 생산에 합성 배양배지를 사용하는 것은 한계가 있다.
미생물 배양을 통한 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조에 있어서는, 비록 화학적 성분이 명확하게 규명되어 있지는 않지만 미생물 배양에 필요한 거의 모든 영양성분들을 함유하고 있는 펩톤, 옥수수 추출물, 효모 추출물 등이 첨가된 복합 배양배지가 널리 사용되고 있다. 펩톤은 단백질이 분해된 물질로서 펩티다아제에 의하여 아미노산으로 다시 전환되어 미생물 배양에 있어서 질소원으로 사용이 가능하다. 하지만 펩톤 역시 산업적인 규모의 미생물 배양을 통한 바이오 연료물질 및 화학물질 생산을 위하여 사용하기에는 매우 비싼 물질이다. 옥수수 추출물은 옥수수 습식가공(corn wet-milling) 공정에서 부산물로 발생하는 물질로서 가격이 매우 저렴하여 미생물 배양배지의 중요한 영양성분으로서 널리 사용되어 왔다(Liggett et al., Bacteriol. Rev., 12:297, 1948; Liggett et al., Bacteriol. Rev., 12:300, 1948). 또한 옥수수 추출물은 미생물 배양을 위한 질소원 뿐 아니라 비타민과 아미노산 이외에도 다양한 영양성분을 함유하고 있다는 장점이 있다(Atkinson et al., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, The Nature Press, NY, 57, 1983; Miller et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, American Society of Microbiology, Washington DC, 122, 1986; Akhtar et al., Tapi J. 80:161, 1997). 옥수수 추출액은 미생물 배양에 있어서 가격이 저렴한 매우 우수한 영양성분이지만, 펩톤이나 효모 추출액과 비교하여 상대적으로 많은 양을 배양배지에 첨가해야 하는 단점이 있다. 또한 옥수수 추출액에는 미생물 성장을 저해하는 알려지지 않은 성분이 존재하므로 동일한 양의 효모 추출액을 배양배지에 첨가한 경우와 비교하여 미생물 성장속도, 미생물 농도, 생산하고자 하는 목적 물질의 생산성이 매우 낮다(Amartey et al., Bullet. Chem. Technol., Macedonia, 19:65, 2000; Silveira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 55:442, 2001;　 Underwood et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:2734).
효모 추출액은 많은 연구자들에 의하여 미생물 배양을 위한 최고의 영양성분으로 확인되고 있으며, 특히 미생물 성장을 촉진하여 미생물 배양을 통하여 생산하고자 하는 목적 물질의 생산성을 매우 향상시키는 것으로 보고되고 있다(Laube et al., Biotechnol. Lett., 6:535, 1984; Bibal et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30:630, 1989; Aeschlimann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:398, 1990; Norton et al., J. Dairy Sci., 77:2494, 1994; Kazamias et al., Appl. Environ. Microbiol., 61:2425, 1995; Potvin et al., J. Microbiol. Methods, 29:153, 1997; Bafrncova et al., Biotechnol. Lett., 21:337, 1999; Bury et al., Czech J. Food Sci., 19:166, 2001). 또한, 효모 추출액에는 상당양의 탄수화물 및 용해성 당이 포함되어 있어, 미생물 배양에 있어서 영양성분 뿐 아니라 탄소원도 동시에 공급 한다(Revillion et al., Braz. Arch. Biol. Technol., 46:121, 2003; Ojokoh et al., Afr. J. Biotechnol., 4:1281, 2005). 이러한 효모 추출액의 우수성으로 인하여 효모 추출액은 식품 산업에서도 첨가물로 널리 사용되고 있다. 일반적으로 효모 추출액은 맥주 및 제빵 제조에 사용되는 효모의 일종인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 인위적으로 배양한 후 자가분해 공정을 통하여 제조된다. 하지만 상기의 공정을 통하여 제조된 효모 추출액은 가격이 매우 비싸므로 현재 산업적인 규모에서의 바이오 연료물질 및 화학물질 생산을 위한 미생물 배양배지의 영양성분으로 사용하기에는 부적합한 것이 사실이다. 실질적으로 효모 추출액 2 g/L를 영양성분으로 첨가하여 젖산을 생산할 경우, 효모 추출액 비용이 전체 젖산 생산 비용의 32%를 차지하는 것으로 보고되고 있다(Mulligan et al., Biotechnol. Bioeng., 38:1173, 1991).
미생물 배양에 의한 바이오 연료물질 및 화학물질 생산에 관한 연구는 가격이 저렴한 탄소원 및 배양배지 개발, 발효공정 개발, 분리 및 정제공정 개발, 우수한 균주 개발 등으로 나눌 수 있다. 현재 산업적인 규모의 미생물 배양을 통한 바이오 연료물질 및 화학물질 생산은 주로 옥수수 추출액, 효모 추출액, 펩톤 등의 영양성분이 첨가된 복합 배양배지가 널리 사용되고 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 옥수수 추출액은 가격이 저렴한 반면 미생물 성장을 저해하여 생산하고자 하는 목적 물질의 생산성을 보장할 수 없다. 이에 반하여 효모 추출액과 펩톤은 영양성분으로서는 우수하지만 가격이 비싸 경제성을 보장할 수 없다. 따라서 산업적인 규모에서의 바이오 연료물질 및 화학물질 생산을 위해서는 생산성을 보장하면서 동시에 경제성을 보장할 수 있는 우수한 영양성분을 포함하는 배양배지의 개발이 절실히 요구된다.
미생물 발효 공정에서 발생하는 부산물을 재활용하기 위한 연구가 일부 진행되어 왔으며, 실제 알코올 발효공정에서 발생하는 발효되지 않은 고형의 잔류 탄수화물들을 슬러지 탱크에서 다시 가수분해하여 탄소원으로 동일 에탄올 발효조에 재공급하여 사용하는 공정이 개발되었다(미국특허 4,578,353). 또한, 2 개의 알코올 발효조를 연결하여 각각의 발효조에서 부산물로 발생하는 유기산 및 가스를 선택적으로 분리하여 재사용하는 공정이 보고되었다(PCT 특허 WO 2008/115080). 하지만 상기의 공정들은 부산물로 발생하는 물질 중 일부만을 선택적으로 재사용하는 방법이었다.
획기적인 비용 절감의 효과가 있고 환경친화적이며, 통상적인 미생물 배양배지의 살균과정에 소모되는 막대한 에너지 비용을 절감할 수 있는 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따른 바이오 연료의 제조방법은 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계, 상기 배양배지에 제1 미생물을 접종하는 단계 및 상기 제1 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 바이오 화학물질의 제조방법은 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계, 상기 배양배지에 제2 미생물을 접종하는 단계 및 상기 제2 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조방법에 따르면, 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 미생물 배양을 위한 배양배지로 사용하기 때문에, 저렴하면서 환경친화적으로 바이오 연료 및 바이오 화학물질을 제조할 수 있다.
또한, 알코올 생산 공정에서 발생하는 발효 폐기물을 미생물 배양배지로 사용함으로써, 통상적인 미생물 배양배지에 첨가되는 각종 화학물질 및 영양성분의 첨가량을 줄이거나 첨가하지 않을 수 있다. 또한 통상적으로 사용되는 포도당, 수크로오스, 글리세롤과 같은 탄소원의 첨가량을 줄일 수 있다. 이와 더불어 알코올 증류과정에서 미생물이 살균되기 때문에 통상적인 미생물 배양배지의 살균과정에 소모되는 막대한 에너지 비용을 절감할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조방법에 따르면, 제조에 소요되는 원료 및 에너지 비용을 획기적으로 줄일 수 있다. 또한 알코올 발효공정에서 발생하는 폐기물을 재활용함으로써 환경보호 및 자원절감이라는 효과를 동시에 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 연료 및 바이오 화학물질 제조방법의 과정을 도시한 도면이다.
도 2는 클로스트리디움 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum ATCC 824) 균주에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다.
도 3은 클로스트리디움 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum ATCC 824) 균주에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다.
도 4는 클로스트리움 베이어링키(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052) 균주에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다.
도 5는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601)균주에 의한 에탄올 생산량을 비교한 그래프이다.
도 6은 클로스트리움 타이로부틸리컴(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755) 균주에 의한 부틸릭산 생산량을 비교한 그래프이다.
도 7 은 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus NCFM)에 의한 젖산 생산량을 비교한 그래프이다.
도 8은 액티노바실러스 숙시노제네스 ATCC 55618(Actinobacillus succinogenes ATCC 55618) 균주에 의한 숙신산 생산량을 비교한 그래프이다.
도 9는 E. coli 균주에 의한 3-하이드록시프로파이오닉산 생산량을 비교한 그래프이다.
미생물 발효 공정에서 발생하는 부산물을 재활용하기 위한 연구가 진행되어 왔으나, 부산물로 발생하는 물질 중 일부를 선택적으로 재사용하는 방법에 관한 것이었고, 알코올 생산 공정에서 발생하는 발효 폐기물 자체를 미생물 배양배지로 사용한 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조 방법에 대하여는 지금까지 시도된 바 없었다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 연료의 제조방법은 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계, 상기 배양배지에 제1 미생물을 접종하는 단계 및 상기 제1 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 화학물질의 제조방법은 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계, 상기 배양배지에 제2 미생물을 접종하는 단계 및 상기 제2 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 연료 및 바이오 화학물질 제조방법의 과정을 도시한 도면이다. 도 1을 참조하면, 에탄올 발효기에서 미생물 발효를 통해 발효액을 수득한다. 다양한 미생물들이 에탄올 생산능력을 보유하고 있는 것으로 알려져 있으나, 현재 산업적으로 주로 사용 되는 미생물은 효모의 일종인 사카로마이세스 세레비지에이다. 에탄올 발효에는 다양한 탄소원을 사용할 수 있다. 바이오매스 전처리 공정을 통하여 생산한 탄소원을 포함하는 배양배지에 에탄올을 생성할 수 있는 미생물을 접종한 후 회분식, 유가식 또는 연속식에 의해 발효 공정을 수행한다.
수득한 발효액을 증류탑으로 보내 증류탑에서 에탄올을 증류함으로써 에탄올을 에탄올 저장조에 회수한다. 발효배지의 온도를 80 내지90℃로 상승시킴으로써 약 95% 이상의 순도를 가지는 에탄올을 증류하여 일차적으로 회수한다. 보다 높은 순도의 에탄올을 생산하기 위해서는 별도의 탈수공정이 필요하다. 일반적인 에탄올 발효공정에서는 이산화탄소 가스가 부산물로 발생하며 이는 포집/압축하여 음료용 혹은 공업용으로 사용될 수 있다.
에탄올 저장조로 에탄올을 회수하고 난 후에 남은 발효 폐기물이 발생한다. 80 내지 90℃의 고온에서 이루어지는 에탄올 증류공정에서 사멸한 미생물, 가수분해되지 않은 고형의 잔류 탄수화물 및 발효되지 않은 당들이 발효 폐기물로 발생한다. 상기 발효 폐기물은 알코올 생산 공정에서 탄소원을 포함하는 배양배지에 알코올을 생산할 수 있는 미생물을 접종한 후 발효 공정을 통해 알코올을 생산할 때 발생되는 발효 폐기물을 포함한다.
상기 발효 폐기물은 농업 혹은 임업 작물 재배를 위한 퇴비로 사용하기 위하여 경작지에 직접 살포하거나 가축용 사료로 이용될 수 있다. 다만, 발효 폐기물을 경작지에 직접 살포할 경우 토양 및 수질 오염의 위험이 있으며, 가축용 사료로 사용하기 위해서는 발효 폐기물을 다시 고온에서 수분을 제거하여 농축된 잔류 고체물질들을 회수하여야 하기 때문에 수분제거를 위한 막대한 에너지 비용이 소모된다. 증류공정 후 발생하는 발효 폐기물에는 미생물 배양배지에 필요한 영양성분이 충분히 존재하므로 이를 배양배지로 직접 이용한다면 배양배지에 첨가해야 하는 영양성분의 비용을 획기적으로 절감할 수 있다. 발효 폐기물에 존재하는 잔류 당들을 탄소원으로 이용할 수 있으므로 미생물 배양에 필요한 탄소원 비용 역시 절감할 수 있다. 또한 고온의 증류과정에서 미생물이 살균되기 때문에 상기의 발효 폐기물을 배양배지로 직접 이용한다면, 고온에서의 배양배지 살균과정이 필요 없기 때문에 배양배지 살균과정에 소모되는 막대한 에너지 비용을 절감할 수 있다.
상기 발효 폐기물을 고체/액체 분리장치로 보내 고체성분을 분리한 액체 발효 폐기물만을 바이오 연료 및 바이오 화학물질 발효기로 보내거나, 고체/액체 분리장치로 보내지 않고 고체 및 액체성분을 모두 포함하는 발효 폐기물을 그대로 바이오 연료 및 바이오 화학물질 발효기로 보내어, 본 발명의 바이오 연료 및 바이오 화학물질의 제조에 있어서의 배양배지로 준비한다. 선택적으로, 물, 탄소원 및 영양성분 등을 바이오 연료 및 바이오 화학물질 발효기에 추가로 가할 수 있다. 탄소원으로는 포도당 또는 미생물 배양에 사용 가능한 모든 탄소원을 사용할 수 있다. 영양성분으로는 배양배지에 첨가되어 미생물 성장을 촉진할 수 있는 모든 물질을 포함한다.
상기 배양배지에 바이오 연료 및 바이오 화학물질을 생성할 수 있는 미생물을 접종한다. 바이오 연료를 생성할 수 있는 제1 미생물 및 바이오 화학물질을 생성할 수 있는 제2미생물에는 효모, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균, 바실러스(Bacillus), 아나에로믹소박터(Anaeromyxobacter), 알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 써머스(Thermus), 써머토가(Thermotoga), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 스트렙토미세스(Streptomycetaceae), 악티노미세스(Actinomycetaceae), 코리네박테리움(Colinebacterium), 자이모모나스(Zymomonas), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아나에로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 및 만하이미아(Mannheimia) 등을 포함하며, 이들의 야생형 균주, 돌연변이 균주 및 재조합 균주를 포함한다.
상기 미생물이 접종된 배양배지를 회분식, 유가식 및 연속식 등의 방법으로 배양한다. 미생물 배양을 통하여 바이오 연료 및 바이오 화학물질을 생성된 후에는, 생성된 바이오 연료 및 바이오 화학물질을 분리 및 정제함으로써 회수한다. 바이오 연료는 바이오 연료 그 자체로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 바이오 연료에 첨가되는 첨가제로 사용될 수 있고, 바이오 연료에는 바이오 가스, 알코올, 알칸계 화합물 및 알켄계 화합물 등이 포함된다. 바이오 가스에는 메탄 및 수소가 포함된다. 알코올에는 에탄올, 부탄올 및 프로판올이 포함된다. 바이오 화학물질은 화학물질 제조과정에 있어서의 원료물질 혹은 원료물질에 첨가되는 첨가제로 사용 가능한 물질로서, 미생물 배양을 통하여 생산 가능한 아미노산, 유기산, 효소 및 생분해성 고분자 등이 포함된다. 아미노산에는 메티오닌 및 트레오닌이 포함된다. 유기산에는 젖산, 부틸릭산, 숙신산 및 하이드록시프로피온산 등이 포함된다. 생분해성 고분자에는 바이오 폴리에스터가 포함된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
발효 폐기물 회수 및 성분분석
산업적인 규모로 에탄올을 생산하는 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 발효 폐기물을 직접 수득하였다. (주)창해에탄올은 에탄올 생산 균주인 사카로마이세스 세레비지에 균주를 배양하여 약 100 g/L의 에탄올을 생산한 후, 상기 발효 배양액을 80 내지 90℃에서 일차로 증류함으로써 95% 이상의 순도를 가지는 상업용 에탄올을 수득하여 판매하고 있다. 상기 상업용 에탄올 생산공장에서 에탄올 증류 후 발생된, 고체성분을 함유하는 발효 폐기물 자체를 회수하여 하기의 실시예에서 사용하였다.
발효 폐기물을 4℃, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액에 존재하는 에탄올, 아세트산, 포도당 농도를 기체크로마토그래피(GC)와 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 또한 하기 실시예에서 미생물 배양을 통하여 생산한 에탄올, 부탄올, 부틸릭산, 젖산의 농도 역시 기체크로마토그래피(GC)와 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 이와 함께 고체성분에 존재하는 전분은 5% HCl 100 mL을 시료 50 mL에 첨가하여 95 ℃ 에서 2.5시간 동안 산 당화시킨 후 냉각하였다. 상기의 산 당화액을 28% NaOH로 중화한 후 이를 HPLC로 분석하여 총당량을 측정하였다. 단백질 농도의 경우 Sigma-Aldrich에서 구입한 Total Protein Kit (Cat. No.TP0200)를 사용하여 분석하였다.
(주)창해에탄올 공장에서 회수한 발효 폐기물을 상기 분석 방법을 통하여 분석한 특성을 표 1에　나타내었다.
성분 농도
에탄올 0.0 g/L
아세트산 2.1 g/L
단백질 2.0 mg/mL
액상에서의 당 4.0 g/L
전체 당 6.8 g/L
발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 이용한 바이오 연료 생산
(1) 클로스트리디움 아세토부틸리컴 균주를 이용한 바이오 부탄올 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물을 배양배지로 사용하되, 고체 성분을 제거한 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지 및 고체 성분을 제거하지 않은 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지로 하여 부탄올 생산을 위한 배양배지로 각각 사용하였다. 클로스트리디움 아세토부틸리컴 ATCC 824 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824) 균주를 6.6 리터 생물 반응기에서 회분식 배양하였다. 발효 폐기물의 부탄올 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 일반적으로 클로스트리디움 균주 배양에 사용되는 클로스트리디움 배양배지를 대조(Control)배지로 사용하였다. 또한, 클로스트리디움 배양배지와 발효 폐기물을 50:50 부피비로 혼합 제조한 배양배지를 부탄올 생산을 위한 배양배지로 사용하였다.
*클로스트리디움 아세토부틸리컴 ATCC 824 균주 배양은 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 2.0 리터에서 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지, 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지, 클로스트리디움 배양배지, 클로스트리디움 배양배지와 발효 폐기물을 50:50부피비율로 혼합하여 제조한 배양배지를 각각 포함하는 생물 반응기에 200 mL 배양액을 접종하여 수행하였으며, 배양조건은 포도당 초기농도 40 g/L, 초기pH 6.0, 배양온도 37 ℃ 및 교반속도 150 rpm으로 하였다. 또한 배양 중 혐기상태를 유지하기 위하여 질소가스를 50 mL/min의 유속으로 연속 공급하였으며, 배양 중 pH는 28% (w/v) 암모니아 용액을 사용하여 5.0 이상으로 조정하였다.
클로스트리디움 아세토부틸리컴 ATCC 824 균주는 발효 폐기물을 배양배지로 사용한 경우, 클로스트리디움 배양배지를 사용한 경우, 그리고 클로스트리디움 배양배지와 발효 폐기물을 50:50의 부피비로 혼합하여 제조한 배양배지를 사용한 경우 모두 70 시간 배양 후에 배양배지에 첨가된 포도당 40 g/L 를 완전히 소모하였다.
도 2는 클로스트리디움 아세토부틸리컴 ATCC 824 에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다. 도 2를 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물로서 고체 성분을 제거한 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지(A)와 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물로서 고체 성분을 제거하지 않은 발효 폐기물 자체를 포함하는 배양배지(B)에서의 클로스트리디움 아세토부틸리컴 균주에 의한 부탄올 생산량은 9.2 ± 1.7 g/L이었고, 대조배지로 사용한 클로스트리디움 배양배지(C) 에서는 5.5 ± 0.6 g/L 의 부탄올이 생성되었다.
도 3은 클로스트리디움 아세토부틸리컴 ATCC 824 에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다. 도 3을 참조하면, 클로스트리디움 배양배지와 발효 폐기물을 50:50 부피비로 혼합 제조한 배양배지(A)의 경우 7.4 ± 0.7 g/L의 부탄올을 생성하여, 대조배지로 사용된 클로스트리디움 배양배지(B)와 비교할 때(5.5 ± 0.6 g/L) 부탄올 생산량이 우수함을 확인할 수 있다.
상기의 결과로부터, 발효 폐기물이 기존의 부탄올 생산에 널리 사용되는 클로스트리디움 배양배지와 비교하여 67% 이상 부탄올 생산이 향상됨을 확인할 수 있다.
(2) 클로스트리디움 베이어링키 균주를 이용한 바이오 부탄올 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물에서 고체 성분을 제거한 발효 폐기물을 배양배지로 하여, 클로스트리움 베이어링키 NCIMB 8052 (Clostridium beijerinckii NCIMB 8052) 균주를 6.6 리터 생물 반응기에서 회분식 배양하였다. 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 부탄올 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 일반적으로 클로스트리디움 균주 배양에 사용되는 클로스트리디움 배양배지를 대조배지로 사용하였다.
클로스트리움 베이어링키 NCIMB 8052 균주 배양은 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 2.0 리터에서 고체 성분을 제거한 발효 폐기물만을 함유하는 배양배지와 클로스트리디움 배양배지를 각각 함유한 생물 반응기에 200 mL 배양액을 접종하여 수행하였으며, 배양조건은 포도당 초기농도 60 g/L, 초기pH 6.0, 배양온도 37℃ 및 교반속도 150 rpm으로 하였다. 또한 배양 중 혐기상태를 유지하기 위하여 질소가스를 50 mL/min의 유속으로 연속 공급하였으며, 배양 중 pH는 28% (w/v) 암모니아 용액을 사용하여 5.0 이상으로 조정하였다. 24시간 배양 후, 고체 성분을 제거한 발효 폐기물을 함유한 배양배지를 사용한 경우의 포도당 소모량은 20 g/L이었고, 클로스트리디움 배양배지를 사용한 경우의 포도당 소모량은 30 g/L이었다.
도 4는 클로스트리움 베이어링키 NCIMB 8052 균주에 의한 부탄올 생산량을 비교한 그래프이다. 도 4를 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물 중 고체 성분을 제거한 발효 폐기물을 함유한 배양배지를 사용한 경우(A) 부탄올 생산량은9.2 ± 0.7 g/L 이고, 클로스트리디움 배양배지(B)를 사용한 경우에는 부탄올 생산량이9.8 ± 1.0 g/L 이었다.
(3) 바이오 에탄올 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물을 배양배지로 사용하였는데, 고체 성분을 제거한 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지 및 고체 성분을 제거하지 않은 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지로 하여 에탄올 생산을 위한 배양배지로 각각 사용하고, 사카로마이세스 세레비지에 ATCC 2601 (Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601) 균주를 250 mL 플라스크에서 배양하였다. 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 에탄올 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 일반적으로 에탄올 발효에 배양배지로 사용되는 Yeast Mold 배지(YM Broth, Difco, Cat. No. 271120)를 대조배지로 사용하였다. Yeast Mold 배지의 조성은 표 2에 나타내었다.
성분 함량(g/L)
효모 추출물(Yeast extract) 2.1
맥아 추출물(Malt extract) 2.0
펩톤(Peptone) 4.0
덱스트로스(Dextrose) 6.8
사카로마이세스 세레비지에 ATCC 2601 균주 배양은 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 100 mL에서 고체성분을 제거한 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지, 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물만을 포함하는 배양배지, YM 배지를 각각 함유하는 플라스크에 3 mL 배양액을 접종하여 수행하였으며, 탄소원으로서 포도당의 초기농도를 40 g/L 로 조정하였다. 또한 초기 배양배지의 pH는 5 로 조절하였다. 배양은 온도조절이 가능한 교반형 인큐베이터(Shaking incubator)에서 실시하였으며, 배양온도는 30℃, 교반속도는 200 rpm으로 조절하였다.
사카로마이세스 세레비지에 ATCC 2601 균주는 발효 폐기물을 배양배지로 사용한 경우와 YM배지를 사용한 경우 모두 24시간 배양 후 배양배지에 첨가된 40 g/L 의 포도당을 완전히 소모하였다.
도 5는 사카로마이세스 세레비지에 ATCC 2601 균주에 의한 에탄올 생산량을 비교한 그래프이다. 도 5를 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물로서 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(A) 및 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(B)에서의 에탄올 생산량은 20.5 ± 0.3 g/L와 23.5 ± 1.3 g/L이었다. 한편, 에탄올 생산에 일반적으로 사용되는 YM 배지(C)에서의 에탄올 생산량은 17.7 ± 0.7 g/L이었다. 이로부터, 종래 에탄올 생산에 사용되는 YM 배지와 비교하여 본 발명의 제조방법에 따른 배양배지를 사용하는 경우 에탄올 생산이 15% 이상 향상됨을 확인할 수 있었다.
발효 폐기물을 함유하는 배양배지를 이용한 바이오 화학물질 생산
(1) 부틸릭산의 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물의 고체성분을 제거하고 배양배지로 사용하여 클로스트리디움 타이로부틸리컴 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755) 균주를 6.6 리터 생물 반응기에서 회분식 배양하였다. 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 부틸릭산 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 일반적으로 클로스트리디움 균주 배양에 사용되는 클로스트리디움 배양배지를 대조배지로 사용하였다.
클로스트리디움 타이로부틸리컴 ATCC 25755 균주 배양은, (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 2.0 리터에서 고체성분을 제거한 발효 폐기물 포함하는 배양배지와, 클로스트리디움 배양배지를 각각 포함하는 생물 반응기에 200 mL 배양액을 접종하여 수행하였으며, 배양조건은 포도당 초기농도 40 g/L, 배양온도 37℃ 및 교반속도 150 rpm으로 하였다. 또한 배양 중 혐기상태를 유지하기 위하여 질소가스를 50 mL/min의 유속으로 연속 공급하였으며, 배양 중 pH는 28% (w/v) 암모니아 용액을 사용하여 6.0으로 조정하였다.
클로스트리디움 타이로부틸리컴 ATCC 25755 균주는 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 함유한 배양배지 및 클로스트리디움 배양배지를 사용한 경우 모두 22 시간 배양 후에 배양배지에 첨가된 포도당을 완전히 소모하였다.
도 6은 클로스트리움 타이로부틸리컴 ATCC 25755 균주에 의한 부틸릭산 생산량을 비교한 그래프이다. 도 6을 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물로서 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(A)에서는 부틸릭산의 생산량이 19.0 ± 0.5 g/L이었고, 클로스트리디움 배양배지(B)에서는 부틸릭산의 생산량이 14.5 ± 0.2 g/L이었다. 이로부터, 발효 폐기물이 종래 부틸릭산 생산에 일반적으로 사용되는 클로스트리디움 배양배지와 비교하였을 때 부틸릭산 생산량이 31% 이상 향상되었음을 확인할 수 있다.
(2)　젖산 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 로부터 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지 및 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 사용하여 락토바실러스 파라카제이 paracasei엑시도필러스 NCFM (Lactobacillus acidophilus NCFM) 균주를 2.5 L 생물반응기에서 1.5 L의 조업량으로 회분식 배양을 하였으며, 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 젖산 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 일반적으로 락토바실러스 배양에 사용되는 MRS 배지(MRS Broth, Difco, Cat. No. 288130)를 대조배지로 사용하였다. MRS 배지의 조성은 표 3에 나타내었다.
성분 함량(g/L)
Pepteose Peptone No.3 10.0
Beef Extract 10.0
Yeast Extract 5.0
Dextrose 20.0
Polysorbate 80 1.0
Ammonium Citrate 2.0
Sodium Acetate 5.0
Magnesium Sulfate 0.1
Manganese Sulfate 0.05
Dipotassium Phosphate 2.0
젖산 생산 배양은 1.5 L의 조업량에 락토바실러스 엑시도필러스 배양액 60 mL을 접종하여 수행하였으며, 초기 포도당 농도는 50 g/L로 조절하여 배양온도 37℃, 교반 속도 200rpm에서 배양하였다. 또한 젖산 생산을 위하여 pH를 10 M NaOH를 이용하여 6.5로 조정하였다. 락토바실러스 엑시도필러스를 비롯한 젖산 생산 균주는 대부분 통성 혐기성균이므로 별도의 혐기 조건을 맞추지 않았다.
24시간 배양 후 락토바실러스 엑시도필러스 NCFM 균주는 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(A), 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(B) 및 MRS 배지(C)에서 초기 포도당을 완전히 소모하였다.
도 7은 락토바실러스 엑시도필러스 NCFM 균주에 의한 젖산 생산량을 비교한 그래프이다. 도 7을 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물로서 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(A)에서의 젖산 생산량은 48.2 ± 0.4 g/L이었고, 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(B)에서의 젖산 생산량은 41.2 ± 0.9 g/L이었으며, MRS 배지(C)에서의 젖산 생산량은 47.2 ± 0.5 g/L이었다.
도 7을 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 젖산 발효 배지로 사용할 경우 고체성분의 제거 유무와 상관 없이 젖산 생산 배지로 대체가 가능함을 확인할 수 있다. 특히 젖산을 생산하는 락토바실러스 엑시도필러스 균주 배양의 경우, 발효 폐기물로부터 고체성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 포함하는 배양배지 조건에서 젖산 생산량이 더 우수하였다.
(3) 숙신산 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 로부터 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 사용하여 액티노바실러스 숙시노제네스 ATCC 55618 (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618) 균주를 500 mL 플라스크에서 배양함으로써 숙신산 생산을 시도하였다. 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 숙신산 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여 표 4의 배지를 대조배지로 사용하였다.
성분 함량(g/L)
Yeast Extract 5.0
NaHCO3 10.0
NaH2PO4?H2O 8.5
K2HPO4 15.5
Glucose 18.0
액티노바실러스 숙시노제네스 ATCC 55618균주 배양은 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물에서 고체성분을 제거하고 표 4의 대조배지 중 Yeast Extract 성분을 제외한 성분을 첨가하여 수행하였다. 200 mL배지를 각각 포함하는 플라스크에 10 mL Tube 배양액을 접종하여 48 시간 동안 39 ℃ 에서 플라스크 배양을 수행한 후 2L배양액이 포함되어 있는 6.5L발효기에 접종하였다. 탄소원으로 18 g/L 의 포도당을 배양배지에 첨가하였다. 또한 발효기의 pH는 28 % 암모니아수를 이용하여7.0으로 조절하였다. 발효 중99.999 % CO2 를 0.05 vvm으로 지속적으로 퍼지(Purge)하였으며, 배양온도는 39 ℃ 로 유지하였다.
40시간 배양 후 액티노바실러스 숙시노제네스 ATCC 55618균주는 첨가된 18 g/L의 포도당을 완전히 소모하였다.
도 8은 액티노바실러스 숙시노제네스 ATCC 55618균주에 의한 숙신산 생산량을 비교한 그래프이다. 도 8을 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지(A)에서의 숙신산 생산량은 10.7 ± 0.8 g/L 이었다. 한편, 대조 배지(B)에서의 숙신산 생산량은 10.1 ± 0.8 g/L 이었다. 이로부터, 숙신산 생산에 사용되는 대조 배지와 비교하여 본 발명의 제조방법에 따른 배양배지를 사용하는 경우 숙신산 생산이 동등 이상임을 확인할 수 있었다.
(4) 3- 하이드록시프로파이오닉산 (3- Hydroxypropionic Acid ) 생산
(주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물 로부터 고체성분을 제거한 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 사용하여, 3-하이드록시프로피온산 생산을 위하여 개발된 재조합 E. coli BL21_pCDFDuet_dhaB_gdrAB_EcoRI_AflII#15__pQE80L_Kp_aldH_BamHI_HindIII#2 균주를 250 mL 플라스크에서 50 mL 배양함으로써 3-하이드록시프로파이오닉산 생산을 시도하였다. 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물의 미생물 배양을 통한 3-하이드록시프로파이오닉산 생산을 위한 배양배지로서의 특성을 파악하기 위하여, 3-하이드록시프로파이오닉산 생산을 위하여 제조된 M9 Salt에 표 5의 성분을 추가한 배지를 대조배지로 사용하였다. 탄소원으로는 50mM 글리세롤을 사용하여 배양하였다.
성분 농도
IPTG concentration 0.1 mM
Yeast extract 0.2 g/L
Coenzyme B12 20 μM
Glycerol 50 mM
보다 구체적으로, E. coli 균주 배양은 (주)창해에탄올의 상업용 에탄올 생산공장으로부터 회수한 발효 폐기물의 고체성분을 제거한 액상 5%를 대조배지 중 질소원으로 사용하는 효모 추출액(yeast extract)을 대신하여 첨가한 배양배지와 대조배지에서 각각 수행하였다. 상기에서 기술한 50 mL배지를 각각 포함하는 플라스크에 5 mL Tube 배양액을 접종하여 30 시간 동안 37 ℃ 에서 200 rpm으로 교반하여 배양하였다.
도 9는 E. coli 균주에 의한 3- 하이드록시프로파이오닉산 생산량을 비교한 그래프이다. 도 9을 참조하면, 에탄올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지에서의 3-하이드록시프로파이오닉산 생산량(A)은8.4 ± 0.7 g/L 이었고, 대조 배지에서의 3- 하이드록시프로파이오닉산 생산량(B)은 8.6 ± 0.0 g/L 이었다. 상기의 결과는3- 하이드록시프로파이오닉산 생산에 사용되는 대조배지와 비교하여 본 발명을 통하여 개발된 배양배지가 3- 하이드록시프로파이오닉산 생산에 있어 동등 수준임을 의미한다.
상기와 같이 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 상기 실시예의 기재에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

Claims (17)

  1. 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계;
    상기 배양배지에 제1 미생물을 접종하는 단계;
    상기 제1 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함하는 바이오 연료의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효 폐기물은 고체 성분을 제거한 발효 폐기물 또는 고체 성분을 제거하지 않은 발효 폐기물을 이용한 바이오 연료의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 준비된 배양배지에 상기 제1 미생물을 접종하기 전에 물, 탄소원 및 영양성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 가하는 단계를 포함하는 바이오 연료의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 미생물은 바이오 연료를 생성할 수 있는 미생물을 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 미생물은 효모, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균, 바실러스(Bacillus), 아나에로믹소박터(Anaeromyxobacter), 알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 써머스(Thermus), 써머토가(Thermotoga), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 스트렙토미세스(Streptomycetaceae), 악티노미세스(Actinomycetaceae), 코리네박테리움(Colinebacterium), 자이모모나스(Zymomonas) 및 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아나에로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 및 만하이미아(Mannheimia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 미생물이 접종된 배양배지를 회분식, 유가식 및 연속식으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 방법으로 배양하는 바이오 연료의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 미생물이 접종된 배양배지를 배양한 후 생성된 바이오 연료를 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 연료는 바이오 가스, 알코올, 알칸계 화합물 및 알켄계 화합물로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 바이오 가스는 메탄 및 수소를 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올, 부탄올 및 프로판올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 바이오 연료의 제조방법.
  11. 알코올 생산 공정에서 발생되는 발효 폐기물을 포함하는 배양배지를 준비하는 단계;
    상기 배양배지에 제2 미생물을 접종하는 단계;
    상기 제2 미생물이 접종된 배양배지를 배양하는 단계를 포함하는 바이오 화학물질의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제2 미생물은 바이오 화학물질을 생성할 수 있는 미생물을 포함하는 바이오 화학물질의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제2 미생물은 효모, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균, 바실러스(Bacillus), 아나에로믹소박터(Anaeromyxobacter), 알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 써머스(Thermus), 써머토가(Thermotoga), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 스트렙토미세스(Streptomycetaceae), 악티노미세스(Actinomycetaceae), 코리네박테리움(Colinebacterium), 자이모모나스(Zymomonas) 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아나에로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 및 만하이미아(Mannheimia) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 바이오 화학물질의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 바이오 화학물질은 아미노산, 유기산, 효소 및 생분해성 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 바이오 화학물질의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 아미노산은 메티오닌 및 트레오닌을 포함하는 바이오 화학물질의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 유기산은 젖산, 부틸릭산, 숙신산 및 하이드록시프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 화학물질의 제조방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 바이오 폴리에스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 화학물질의 제조방법.
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