CN116515659A - 一种乳酸片球菌菌株及其在l-乳酸生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乳酸片球菌菌株及其在L‑乳酸生产中的应用。本发明提供一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Cath137，其保藏编号为CCTCC M20211363。本发明还提出上述乳酸片球菌在L‑乳酸生产中的应用。本发明还在于提出一种发酵乳酸的生产方法，所述方法包括利用乳酸片球菌Cath137制备种子液，和/或发酵生产L‑乳酸。本发明所使用的乳酸片球菌菌株具有良好的耐受木质纤维素预处理产生的抑制物的性能，在木质纤维素水解液中能够生长并生产乳酸，达到较高的乳酸产量和得率，具有良好的应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐毒性的乳酸片球菌，以及利用耐毒性乳酸片球菌发酵生 产乳酸的方法，本发明属于生物技术和微生物技术领域。
技术背景
乳酸是一种重要的工业化学品，它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织 业。聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的生物可降解性生物基材料，再全球 禁塑的背景下，越来越受到关注，且每年的消费量都在不断增加。近年来，以 光学纯L-乳酸为前体生产生物可降解塑料聚乳酸，使得光学纯L-乳酸的需求大 大提升。目前，乳酸生产主要包括两种路径：化学合成和微生物发酵。化学合 成主要是通过强酸水解乳腈产生，乳腈是由乙醛和剧毒物质氢氰酸合成得到 的，化学合成的缺点在于成本昂贵，其生产的乳酸是D/L混合型乳酸；而微生 物发酵的有点在于可生产光学纯乳酸、低的生产温度以及低能耗，使得微生物 发酵成为主要的乳酸生产方式。
现有的报道中用于生产L-乳酸的菌有：乳酸菌Lactobacillus rhamnosus、Lactococcus lactis，米根霉Rhizopus oryza，芽孢杆菌Bacillus subtilis，大肠杆菌Escherichia coli，酿酒酵母，谷氨酸棒状杆菌。世界上90％的商用L-乳酸都是 由玉米淀粉类原料进行发酵而得到的。而玉米淀粉原料的成本约占总发酵成本 的70％。因此，亟需找到一种廉价的原料替代淀粉类原料进行L-乳酸生产。木 质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源，利用廉价、含 量丰富的木质纤维素原料将会大大减少L-乳酸的生产成本。
使用木质纤维素原料如农林废弃物进行生物基化学品的生产过程主要包 括：原料收集、预处理、脱毒、糖化、发酵及分离纯化等。由于木质纤维素生 物炼制与淀粉基生物化学品的生产相比，能耗、水耗及废水排放更高，且发酵 指标偏低，不利于实现木质纤维素替代淀粉基进行生物基化学品的工业化生 产。木质纤维素的预处理过程会产生多种抑制物，例如糠醛、羟甲基糠醛等， 抑制物的存在不仅会抑制纤维素酶的活性，还会抑制发酵微生物的生长和代谢 从而降低发酵指标。目前可以利用生物脱毒菌株(如宛氏拟青霉Paecilomyces variotii Bainier)的降解作用减少木质纤维素原料预处理产生的抑制物，但是微 生物利用脱毒后的木质纤维素水解液发酵过程中，还是会受到残存的抑制物的 影响。在这种情况下，如果利用木质纤维素原料进行乳酸的生产，就需要菌株 在存在抑制物的水解液中生长和发酵。因此，获得可以在存在抑制物水解液中 可以生长和发酵的菌株，就显得很有必要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Cath137，其保藏编号为CCTCC M 20211363。
本发明的第二个目的在于提出上述乳酸片球菌在L-乳酸生产中的应用。
本发明的第三个目的在于提出一种L-乳酸的生产方法，所述方法包括利用 乳酸片球菌Cath137制备种子液，和/或，发酵生产L-乳酸。
本发明具有以下优点：
1.本发明所使用的乳酸片球菌菌株具有良好的耐受木质纤维素预处理产生 的抑制物的性能，在木质纤维素水解液中能够生长并生产乳酸；
2.本发明提供的乳酸片球菌对木质纤维素水解液体系具有良好的适应能 力，在复杂体系中可以达到较高的乳酸产量和得率，具有良好应用前景和经济 效益。
具体实施方式
如前所述，本发明的第一方面在于提供一株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Cath137。
本申请的发明人在腐烂的木头中，通过分离纯化获得一株可以生产L-乳酸 的菌株，产酸的菌株参照《常见细菌系统鉴定手册》，并对菌株进行菌体特征、 生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落颜色为乳白 色，表面光滑，圆形凸起；并使用16S rDNA序列在GenBank数据库中比对， 鉴定该菌株为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。以上述分离纯化得到的乳 酸片球菌为出发菌株，通过使用物理及化学诱变方法，再通过存在抑制物培养 基中耐受条件下筛选获得上述菌株，命名为乳酸片球菌Cath137。所述乳酸片 球菌可以在抑制物存在下高效生产高浓度的L-乳酸。
如前所述的，本发明的第二个目的在于提出上述乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)Cath137在L-乳酸生产中的应用。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比。
如前所述的，本发明的第三个目的在于提出一种L-乳酸(简称乳酸)的生 产方法。
于一些实施方式中，控制发酵过程中的pH为4.5～6.5，进一步为5.0～6.5， 进一步为5.2～6.2。例如控制pH为5.5。
于一些实施方式中，发酵乳酸过程中使用pH中和剂对pH值进行调控，使 用的pH中和剂包括但不限于氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钙 中的一种或几种。
于一些实施方式中，发酵培养基的种子液的接种量为5％～20％，例如10％， 所述百分比为体积百分比。优选地，所述种子液稀释10倍后的菌体光密度OD600 为0.3～0.7，优选为0.3～0.6，优选为0.4～0.6，例如为0.55、0.42。
于一些实施方式中，发酵温度为37℃～43℃，例如40℃。
作为本发明的一优选实施方式，所述乳酸片球菌Cath137发酵生产L-乳酸 过程包括：
向发酵培养基中接种乳酸片球菌Cath137，发酵培养基的种子液的接种量 为5％～20％(v/v)，在37℃～43℃、pH为4.5～6.5的条件下发酵生产L-乳酸。
于一些实施方式中，用于发酵生产L-乳酸的发酵培养基中葡萄糖的含量为 4％～12％，优选为5％～8％。
于一些实施方式中，除葡萄糖外，发酵培养基中还含有供发酵菌株生长、 繁殖或合成L-赖氨酸的其他成分，例如酵母粉，和/或，蛋白胨，和/或，柠檬 酸氢二铵，和/或，七水硫酸镁，和/或，四水合硫酸锰，和/或，磷酸氢二钾， 和/或，乙酸钠。
于一实施方式中，发酵培养基中的葡萄糖可以来源于农林废弃物水解处理获 得的水解液。
于一实施方式中，发酵培养基含有农林废弃物水解处理获得的水解液。用于 提供发酵用的葡萄糖。
所述农林废弃物包括秸秆(优选包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆)、稻 草、稻壳、蔗渣、木材、木屑中的至少一种。农林废弃物中含有大量的木质纤维 素。
所述的水解液可以经过或不经过脱毒处理。
于一实施方式中，所述的水解液中含有质量百分比计1.5％～12％的葡萄 糖。所述水解液可以是经过浓缩或稀释处理后的，也可以是未经过浓缩或稀释 处理的。
于一优选实施方式中，通过向农林废弃物的水解液中添加氮源(如玉米 浆、玉米干酒糟)、营养盐(如蛋白胨，酵母粉，柠檬酸氢二铵，乙酸钠，磷酸 氢二钾，七水硫酸镁，四水硫酸锰)制备得到所述发酵培养基。
于一实施方式中，发酵培养基中含有0.5％～3％的玉米浆或者0.5％～7％的玉米干酒糟。作为氮源。
于一实施方式中，发酵培养基中含有以下含量的营养盐：0.5％～2％的蛋白 胨，和/或，0.2％～1％的酵母粉，和/或，0.01％～0.5％的柠檬酸氢二铵，和/或， 0.1％～0.7％的乙酸钠，和/或，0.05％～0.25％的磷酸氢二钾，和/或， 0.01％～0.15％的七水硫酸镁，和/或，0.01％～0.1％的四水硫酸锰。
于一实施方式中，发酵培养基中含有下述质量百分比的组分：葡萄糖 4％～12％，酵母粉0.2％～1％，蛋白胨0.5％～2％，柠檬酸氢二铵0.01％～0.5％， 七水硫酸镁0.01％～0.15％，四水合硫酸锰0.01％～0.1％，磷酸氢二钾 0.05％～0.25％，乙酸钠0.1％～0.7％。
于一优选实施方式中，发酵培养基含有农林废弃物水解处理获得的水解 液，0.5％～7％的玉米浆或者0.5％～7％的玉米干酒糟，且含有以下营养盐： 0.5％～2％的蛋白胨，0.2％～1％的酵母粉，0.01％～0.5％的柠檬酸氢二铵， 0.1％～0.7％的乙酸钠，0.05％～0.25％的磷酸氢二钾，0.01％～0.15％的七水硫酸 镁，0.01％～0.1％的四水硫酸锰。
上述培养基在使用前均进行灭菌处理。
如前所述，发酵培养基中的葡萄糖可以来源于农林废弃物水解处理获得的 水解液。利用纤维素酶将农林废弃物水解处理为含有葡萄糖的水解液。
于一些实施方式中，在水解处理前，可以将所述农林废弃物进行预处理。 所述预处理例如为干法稀酸预处理。
于一些实施方式中，在水解处理前、水解处理的同时、或水解处理后进行脱 毒处理。
例如，在水解处理前，将所述农林废弃物进行脱毒处理。
例如，在水解处理后，将所述水解液进行脱毒处理。
通过脱毒处理去除对发酵L-乳酸有影响的毒性抑制物，例如糠醛、羟甲基 糠醛等。
于一些实施方式中，可以通过能够代谢毒性抑制物的菌株对所述农林废弃 物或所述的水解液进行脱毒处理，从而降低所述毒性抑制物的含量。
于一些实施方式中，可以通过化学吸附法进行脱毒，从而降低水解液中毒 性抑制物的含量。
于一实施方式中，所述的水解液中含有以质量百分比计0.4％～12％的葡萄 糖，进一步如4％～7％的葡萄糖。
在一些具体的实施方式中，所述经过脱毒的秸秆处理液含有糠醛，含量为 0～4g/L，进一步为0.05～4g/L。
在一些具体的实施方式中，所述经过脱毒的秸秆处理液含有羟甲基糠醛， 含量为0.02～5g/L。
下面结合实施例解释本发明，实施例仅用于说明本发明。除非特别说明， 本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应 理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权力要求 书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下， 对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保 护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
预备例1秸秆水解液的制备
将玉米秸秆和稀硫酸溶液以(1～5):1的固液比(g/g)加入到反应容器中， 硫酸用量为2.5～5g H2SO4/100g玉米秸秆干重，在168～200℃加热2.5～15min，然 后调节pH值为4.7～5.3，加入纤维素酶在48～52℃酶解12～18h，获得秸秆水解 液；向秸秆水解液中接种脱毒菌株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii Bainier)，在 33～38℃进行脱毒处理以降低抑制物含量，然后离心，收集上清液，获得脱毒的 秸秆水解液。
参照上述操作条件，分别制备得到抑制物含量不同的秸秆水解液，组成见表 1。
表1
实施例1耐毒性乳酸片球菌的筛选、分离与鉴定
自腐木中取得样品后，通过分离纯化获得一株可以生产L-乳酸的菌株，产酸 的菌株参照《常见细菌系统鉴定手册》，并对菌株进行菌体特征、生理生化特性 等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落颜色为乳白色，表面光滑，圆 形凸起；用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取该菌株的DNA，以其DNA为模 版，使用细菌通用引物27F和1492R，并使用16S rDNA进行PCR扩增，进行 测序后获得菌株16S rDNA序列,将菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中 比对，鉴定该菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
以上述分离纯化得到的乳酸片球菌为出发菌株，然后通过使用紫外线、亚硝 基胍、5-氟尿嘧啶、ARTP等多次单独诱变及复合诱变后，以含有抑制物的秸秆 水解液中进行抑制生长代谢的压力筛选发酵，同时以提高L-乳酸转化率为目标 进行筛选，获得在含抑制物水解液中生长代谢且L-乳酸转化率较高的菌株，将该 菌株命名为Cath137，并保存于甘油管中。
实施例中涉及的菌株的具体保藏信息
菌株：乳酸片球菌Cath137(Pediococcus acidilactici Cath137)
保藏日期：2021年11月4日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)
保藏编号：CCTCC M 20211363
实施例2乳酸片球菌Cath137传代的稳定性
种子培养基：葡萄糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，柠檬酸氢二铵 0.2％，七水硫酸镁0.05％，四水合硫酸锰0.03％，磷酸氢二钾0.1％，乙酸钠 0.5％。
发酵培养基：葡萄糖8％，酵母粉0.7％，蛋白胨1.2％，柠檬酸氢二铵0.2％， 七水硫酸镁0.06％，四水合硫酸锰0.03％，磷酸氢二钾0.1％，乙酸钠0.5％。
所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)Cath137经过传代实验验证，经 过六次传代后菌落形态及生产转化L-乳酸的能力均未出现明显变化。菌落形态: 菌落颜色为乳白色，表面光滑，圆形凸起,边缘整齐，传代稳定性良好。
使用乳酸片球菌Cath137发酵生产L-乳酸，具体的方法如下：将前述获得 的第一代和第七代菌株进行摇瓶发酵生产L-乳酸的性能验证。取一支乳酸片球 菌Cath137甘油管(第一代和第七代各一支)分别在MRS培养基上划线，在 40℃下培养33～36h至平板上长出单克隆，第一代和第七代分别挑取单克隆接入 种子培养基中，在40℃条件下培养13h，然后以10％(v/v)的接种量接入另一 新鲜的种子培养基中，在40℃条件下培养5h，测得种子液的OD600达到了0.5 (稀释10倍测定)。将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，在40℃条件下 发酵，发酵过程中控制pH值为5.5，发酵结束后，测定第一代和第七代菌株的 L-乳酸的产量分别为50.5g/L和50.8g/L。
可以看出，乳酸片球菌Cath137的可以将葡萄糖转化为L-乳酸，且传代稳定 性良好。
实施例3乳酸片球菌Cath137利用未脱毒的秸秆水解液进行发酵
种子培养基：葡萄糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，柠檬酸氢二铵0.2％， 七水硫酸镁0.05％，四水合硫酸锰0.03％，磷酸氢二钾0.1％，乙酸钠0.5％。
取1支实施例1获得的乳酸片球菌Cath137甘油管种子接入种子培养基中, 接种量10％(v/v)，40℃培养12h活化后，得到一级种子液，将一级种子液接入 另一新鲜的种子培养基中，接种量10％(v/v)，在40℃条件下培养6h左右，测 得种子液的OD600达到了0.42(水稀释10倍)，得到成熟的种子液。
在秸秆水解液0中添加3％的玉米浆，1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.2％柠檬 酸氢二铵，0.5％乙酸钠，0.2％磷酸氢二钾，0.05％七水硫酸镁，0.025％四水硫酸 锰，得到发酵培养基。将乳酸片球菌Cath137和出发菌株分别在发酵培养基种进 行发酵对比，按照10％接种量接入Cath137种子液，发酵温度为42℃，pH控制 在5.5，转速为150rpm。发酵结果见表2。
表2
可见，对于未作脱毒处理的秸秆水解液，对照组菌株的生长受到抑制，即使 再延长时间也无法再发酵生产L-乳酸。Cath137菌株具有良好的耐毒性抑制物的 性能和发酵效果。
实施例4乳酸片球菌Cath137利用脱毒的秸秆水解液进行发酵
种子培养基：葡萄糖2％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，柠檬酸氢二铵0.2％， 七水硫酸镁0.05％，四水合硫酸锰0.03％，磷酸氢二钾0.1％，乙酸钠0.5％。
发酵培养基组分如下：秸秆水解液1添加氮源、营养盐(蛋白胨，酵母粉， 柠檬酸氢二铵，乙酸钠，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，四水硫酸锰)后得到。发酵 培养基中含有3％的玉米浆，1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.2％柠檬酸氢二铵，0.5％ 乙酸钠，0.2％磷酸氢二钾，0.05％七水硫酸镁，0.025％四水硫酸锰。
取1支实施例1获得的乳酸片球菌Cath137甘油管种子接入种子培养基中, 接种量10％(v/v)，40℃培养12h活化后，得到一级种子液，将一级种子液接入 另一新鲜的种子培养基中，接种量10％(v/v)，在40℃条件下培养6h左右，测 得种子液的OD600达到了0.42(水稀释10倍)，得到成熟的种子液。
将5mL成熟的种子液接种至装有50mL发酵培养基的摇瓶中。发酵过程中 控制pH为5.6，发酵液中葡萄糖含量几乎为0时，发酵结束。以出发菌株为对 照菌株。发酵结果见表3。
表3
实施例5乳酸片球菌Cath137利用脱毒的秸秆水解液进行发酵
与实施例4的区别仅仅在于：发酵培养基组分如下：秸秆水解液2添加氮 源、营养盐(蛋白胨，酵母粉，柠檬酸氢二铵，乙酸钠，磷酸氢二钾，七水硫酸 镁，四水硫酸锰)后得到。发酵培养基中含有3％的玉米浆，1％蛋白胨，0.5％酵 母粉，0.2％柠檬酸氢二铵，0.5％乙酸钠，0.2％磷酸氢二钾，0.05％七水硫酸镁， 0.025％四水硫酸锰。
以出发菌株为对照菌株。发酵结果见表4。
表4
Claims (10)
1.一种乳酸片球菌菌株，其特征在于，所述菌株为乳酸片球菌Cath137，菌株的保藏编号为：CCTCC M 20211363。
2.一种如权利要求1所述的乳酸片球菌在L-乳酸生产中的应用。
3.一种L-乳酸的生产方法，所述方法包括：通过利用如权利要求1所述的乳酸片球菌Cath137制备种子液，和/或，发酵生产L-乳酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，用于发酵生产L-乳酸的发酵培养基中葡萄糖的含量为4％～12％，优选为5％～8％。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养基中的葡萄糖来源于农林废弃物水解处理获得的水解液；
进一步地，所述农林废弃物包括但不限于秸秆、稻草、稻壳、蔗渣、木材、木屑中的至少一种，所述秸秆优选包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
利用纤维素酶将农林废弃物水解处理为含有葡萄糖的水解液；和/或，
在水解处理前，将所述农林废弃物进行预处理；和/或，
在水解处理前、水解处理的同时、或水解处理后进行脱毒处理。
7.如权利要求3或4或5所述的方法，发酵过程中控制pH为4.5～6.5，进一步为5.0～6.5，进一步为5.2～6.2。
8.如权利要求3或4或5所述的方法，发酵培养基的种子液的接种量为5％～20％，所述百分比为体积百分比，优选地，所述种子液稀释10倍后的菌体光密度OD600为0.3～0.7，优选为0.4～0.6；和/或，
发酵温度为37℃～43℃。
9.如权利要求3或4或5所述的方法，除葡萄糖外，发酵培养基中还含有供发酵菌株生长、繁殖或合成L-赖氨酸的其他成分，例如酵母粉，和/或，蛋白胨，和/或，柠檬酸氢二铵，和/或，七水硫酸镁，和/或，四水合硫酸锰，和/或，磷酸氢二钾，和/或，乙酸钠；
优选地，发酵培养基中含有下述质量百分比的组分：葡萄糖4％～12％，酵母粉0.2％～1％，蛋白胨0.5％～2％，柠檬酸氢二铵0.01％～0.5％，七水硫酸镁0.01％～0.15％，四水合硫酸锰0.01％～0.1％，磷酸氢二钾0.05％～0.25％，乙酸钠0.1％～0.7％。
10.如权利要求3或4或5所述的方法，发酵培养基含有农林废弃物水解处理获得的水解液，0.5％～7％的玉米浆或者0.5％～7％的玉米干酒糟，且含有以下营养盐：0.5％～2％的蛋白胨，0.2％～1％的酵母粉，0.01％～0.5％的柠檬酸氢二铵，0.1％～0.7％的乙酸钠，0.05％～0.25％的磷酸氢二钾，0.01％～0.15％的七水硫酸镁，0.01％～0.1％的四水硫酸锰。
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