CN113174343B - 一种利用木质纤维素生产乳酸的微生物菌群及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用木质纤维素发酵生产乳酸的微生物混合菌群及发酵方法，该微生物混合菌群以屎肠球菌为主，其有效活菌数占微生物混合菌群中有效活菌数的95％以上，另含5％以下的乳酸菌属菌株作为共生菌。相对于单菌发酵，该微生物菌群具有嗜热、耐毒、能同时利用五碳糖和六碳糖、发酵性能稳定、生物安全性高等特点。该微生物混合菌群利用酸预处理后木质纤维素为底物在高温下高效地发酵生产乳酸，同时具有酸预处理后无需脱毒、生产过程无需灭菌、生产成本低等优势。以酸预处理后玉米秸秆为底物的同步糖化发酵中，乳酸的浓度可达71.04g/L、转化率为0.49g/g秸秆。

Description

一种利用木质纤维素生产乳酸的微生物菌群及发酵方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种以木质纤维素为底物，经微生物菌群发酵生产乳酸的方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid)作为一种重要C3平台产品，广泛用于医药、纺织、食品、农业、牧业、材料、化工、化妆品等领域。由乳酸聚合而成的聚乳酸(PLA)作为最有潜力的可生物降解高分子材料，有望代替聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等不可降解塑料，解决“白色污染”问题，是一种极具潜力的生物环保材料，近些年所受到的关注日益增加。

乳酸的生产方法包括微生物发酵法、化学合成法及酶法。其中，微生物发酵法生产乳酸通过菌种和培养条件的不同可以得到光学纯度高的L-乳酸或D-乳酸或者两异构体以一定比例混合的消旋体，以满足乳酸单体聚合成聚乳酸的需求。微生物发酵法生产乳酸因其原料可再生、生产成本低、乳酸光学纯度高、绿色环保等优点脱颖而出。一代乳酸生产主要是以糖类或淀粉类为原料，随着乳酸需求量的日益增长，一代乳酸生产出现成本过高、粮食短缺、土地利用不合理等问题；因此二代乳酸-以木质纤维素为原料生产乳酸，应运而生。研究主要包括玉米秸秆(Zhao K et al.,Bioresource Technology,2013,135:481-489；Ouyang J et al.,Bioresource Technology,2013,135:475-480)；高梁秸秆(Zhang YX etal.,American Institute of Chemical Engineers,2016,32:271-278)；小麦秸秆(RonaldH W Maas et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78:751-758)、甘蔗渣(Edwin C.van der Pol et al.,Biotechnology for Biofuels,2016,9:248)、苹果渣(Gullon B et al.,Bioresource Technology,2008,99:308-319)、玉米芯(Bai ZZ etal.,Bioresource Technology,2016,207:346-352)等木质纤维素为原料发酵生产乳酸，以木质纤维素生产乳酸不仅可以降低乳酸生产成本，实现可再生资源有效利用，也能解决农业废弃物的处理和污染等问题。

我国玉米秸秆年产约3.5亿吨，这些玉米秸秆一部分用作饲料，一部分焚烧，未得到充分利用，且对环境造成严重污染，因此高效率低成本地将玉米秸秆变废为宝是目前学者关注的热点。目前大多数木质纤维素在经过预处理后，都需要经过水洗、生物脱毒等流程以去除水解液中的毒性物质，如有机酸、糠醛、香草醛等。水洗脱毒产生了大量的废水，废水处理成本较高，增加了生物基化学品的生产成本；生物脱毒一般处理周期较长，不利于大规模生产需求。木质纤维素水解液若不经过脱毒处理，采用纯种培养很难将其直接利用，抑制物对细胞生长毒性作用导致微生物生长缓慢，甚至不生长，降低了原料的利用率、乳酸最终浓度及生产强度。与纯培养技术相比，微生物菌群具有以下的优势：(1)复杂基质的利用率高：廉价、复杂的基质，如木质纤维素、乳清、糖蜜、粗甘油、马铃薯加工废水、玉米浸泡液等都可以成为发酵原材料用于生产乳酸。(2)操作的安全性、稳定性和简易性：微生物菌群具有很高的生物多样性，可以在不灭菌的条件下操作，抗噬菌体感染能力和生物安全性得以提升。(3)较强的鲁棒性：混菌体系细胞间作用关系动态平衡，对环境波动具有更强适应性和鲁棒性。

木质纤维素转化生产乳酸通常可采用先糖化再发酵，或同步糖化发酵两种模式。相对于分步糖化发酵，同步糖化发酵具有工艺流程短、投资费用低、可解除底物抑制、产物转化率高等优势；但同步糖化要求菌体具有耐高温特性，才可实现与纤维素酶的最适作用温度相匹配。目前纤维素酶最适作用温度一般为50℃，常规温度同步发酵，降低了纤维素酶的活性，从而需要增加纤维素酶的用量，增加了生产成本。另外高温条件利于木质纤维素等原料的糖化，可实现更好更快的传质。同时，耐高温微生物能够耐受大型反应器所造成的温度分布不均和波动，利于菌种发酵性能的提升。在生产成本方面，高温发酵能够明显降低冷却成本，特别是在高温季节和热带地区。同时，高温发酵显著降低了染菌的风险。

基于微生物菌群和高温发酵的优势，目前未见微生物菌群高温转化玉米秸秆的报道，因此开发一种耐复杂基质、耐高温、可同时降解六碳糖和五碳糖、且发酵性能稳定的微生物菌群，高效转化玉米秸秆生产乳酸是本发明的主要目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温，耐复杂基质，能同时利用五/六碳糖，发酵性能稳定，产物单一的可转化玉米秸秆水解液为乳酸的微生物菌群以及利用该微生物菌群制备乳酸的方法。

本发明的微生物菌群分离自牛瘤胃新鲜内含物，经自适应进化策略筛选得到，该微生物菌群包括屎肠球菌菌株和副干酪乳杆菌菌株，其发酵性能稳定、复杂底物耐受性强，可高效转化酸解后未脱毒的玉米秸秆为乳酸，发酵过程不灭菌，克服单菌发酵玉米秸秆需脱毒、耐受性低，转化率低等问题。

本发明提供一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)DUT50，已于2020年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.21578，分类命名为屎肠球菌Enterococcusfaecium。

本发明的技术方案如下：

一种利用木质纤维素发酵生产乳酸的微生物混合菌群，所述的微生物混合菌群以屎肠球菌为优势菌，所述屎肠球菌的有效活菌数占微生物混合菌群中有效活菌数的95％以上。

进一步地，所述的微生物混合菌群还含有与屎肠球菌共生的乳酸菌属菌株，所述乳酸菌属菌株的有效活菌数占所述的微生物混合菌群中有效活菌数的5％以下。

进一步地，所述乳酸菌属菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

进一步地，所述屎肠球菌为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，保藏号为CGMCCNo.21578。

进一步地，所述微生物混合菌群发酵生产乳酸时的发酵温度为37-50℃。

在本发明中，所述的微生物混合菌群由作为优势菌的屎肠球菌和作为共生菌的副干酪乳杆菌组成，其中所述屎肠球菌以及副干酪乳杆菌均可以采用已知屎肠球菌和已知副干酪乳杆菌。本发明的微生物混合菌群能够在高温下以酸处理的木质纤维素为底物高效地发酵生产乳酸。优选地，在微生物混合菌群中所述屎肠球菌采用保藏号为CGMCC No.21578的屎肠球菌(Enterococcus faecium)，能够更好地保持微生物混合菌群在高温下的发酵性能。

本发明的另一方面，提供一种乳酸的发酵方法，该发酵方法包括将上述的微生物混合菌群接入到以酸预处理后的木质纤维素为底物的发酵培养基中进行同步糖化发酵生产乳酸，同步糖化发酵温度为45-50℃。其中，发酵培养基用碱性试剂将pH值调整为5～6。

进一步地，所述的酸预处理后的木质纤维素不进行脱毒处理。即，在本发明中，将木质纤维素利用酸预处理后的水解液，可以不进行脱毒处理而直接加入到发酵培养基中进行同步糖化发酵生产乳酸。

进一步地，在发酵过程中发酵培养基和发酵设备不灭菌。

进一步地，所述木质纤维素来自作物秸秆。所述作物秸秆中纤维素含量为30-50％(w/w)，半纤维素含量为20-30％(w/w)，木质素含量为15-30％(w/w)。所述作物秸秆优选为玉米秸秆。

进一步地，所述的发酵培养基的组成为：10-35％(w/v)玉米秸秆，10-25g/L玉米浆干粉，预糖化时间为0-12h。具体地，将玉米秸秆用酸预处理得玉米秸秆酸解液，该玉米秸秆酸解液直接或再进行预糖化处理后，作为发酵培养基的组成成分，来配制发酵培养基。其中，预糖化处理的方法可以采用本领域中常规使用的木质纤维素的预糖化处理方法。

本发明相对于现在技术有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种发酵制备乳酸的微生物混合菌群，其发酵稳定性好，高温耐受性强，可耐受50℃高温，可高效转化酸解后未脱毒处理的秸秆，能同时利用五/六碳糖，产物单一。

(2)本发明以酸预处理后的秸秆(木质纤维素)为原料，高温同步糖化发酵生产乳酸，解决了酶解温度与发酵温度不协调的缺点，利用本发明的微生物混合菌群可使酶在最适作用温度条件下发酵生产乳酸，提高了酶的利用率，实现同步糖化转化生产乳酸，提高了生产乳酸的效率。

(3)本发明以酸解后未脱毒的秸秆(木质纤维素)为底物发酵制备乳酸，减少废水排放，缩减乳酸生产工艺步骤，降低乳酸生产成本。

(4)本发明的微生物混合菌群可同步利用秸秆水解液中的五碳糖和六碳糖，提高了秸秆的利用率。

(5)本发明的微生物混合菌群在发酵过程中发酵培养基和发酵设备都无需灭菌，降低了生产成本。

附图说明

图1表示毒性抑制物含量和玉米秸秆固液比对微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸的影响。

图2表示玉米浆干粉浓度对微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸的影响，其中，玉米浆干粉浓度分别为A)10g/L；B)15g/L；C)20g/L；D)25g/L。

图3表示预糖化时间对微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸的影响，其中，预糖化时间分别为A)0h；B)2h；C)4h；D)6h。

图4表示微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸结果，其中，玉米秸秆固液比20％(w/v)，玉米浆干粉浓度20g/L，预糖化时间4h。

图5表示屎肠球菌高温同步糖化发酵生产乳酸的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。

1、下述实施例使用的培养基：

(1)富集培养基：玉米浆干粉16g，C₆H₅O₇(NH₄)₃ 2g，CH₃COONa 2g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，加玉米秸秆酸解滤液至总体积为1L，补加葡萄糖和木糖分别至40g和20g。

(2)种子培养基：同富集培养基

(3)同步糖化发酵培养基(g/L)：玉米秸秆10-35％(w/v)，玉米浆干粉10-25，C₆H₅O₇(NH₄)₃ 2，CH₃COONa 5，K₂HPO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.58，MnSO₄·H₂O 0.25。

2、种子培养：

采用100mL西林瓶，装液量20mL，装入种子培养基后用丁基胶塞封顶。实验过程中使用一次性无菌针管接种及取样，接种量5％(v/v)，培养温度50℃，摇床转速200r/min，培养时间10-48h。

3、玉米秸秆酸预处理

玉米秸秆组成(w/w)：31.18％纤维素、26.95％半纤维素、16.43％木质素和25.44％其他物质。酸预处理过程如下：玉米秸秆经过粉碎机粉碎后与1％硫酸(v/v)以1:10(w/v)比例混合均匀置于灭菌锅中，121℃下酸解2h，得到玉米秸秆酸解液。

玉米秸秆酸解滤液制备：酸预处理后得到的玉米秸秆酸解液冷却至室温进行抽滤。收集酸解滤液加入KOH调至pH 5.5，配制富集培养基，用于菌群的富集培养。富集培养时玉米秸秆酸解滤液的主要成分如下：4.72g/L葡萄糖，16.53g/L木糖，1.53g/L阿拉伯糖，1.74g/L乙酸，1.49g/L糠醛，1.82g/L 5-羟甲基糠醛，1.92g/L香草醛。

4、同步糖化发酵

预糖化：酸预处理玉米秸秆后所得到的玉米秸秆酸解液，用氨水调节pH值为5.5，加入纤维素酶(诺维信，

CTec2，酶载量35FPU/g-玉米秸秆)，在50℃、200r/min下酶解0-12h。

同步糖化发酵：预糖化后，将菌种以接种量5％(v/v)接种至发酵培养基中，在50℃、200r/min下发酵，发酵过程中用2M NaOH控制pH值为5.5。

5、微生物菌群DUT50的种子培养，可以按照以下两种方法进行。方法1：微生物菌群DUT50以菌液的状态保存，菌液(微生物菌群DUT50菌液)中按照有效活菌数的含有量，包括95％以上的屎肠球菌(Enterococcus faecium)和5％以下的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。取适量该菌液直接用于种子培养。该方法适用于微生物菌群的短期保存与使用。在下述实施例中，微生物菌群DUT50的种子培养是采用该方法来进行的。

方法2：将分离得到的菌落S1(屎肠球菌)和菌落S3(副干酪乳杆菌)，各自在20％甘油中-80℃低温保存。使用时，将保存的菌涂抹于平板中培养，挑取菌落，分别在种子培养基中培养，分别得到各自的种子培养液，并按照一定的比例混合，用于混合菌群的发酵培养。两种种子培养液按照有效活菌数的含有量在混合后的种子培养液中的占比为：95％以上的屎肠球菌(Enterococcus faecium)和5％以下的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。该方法适用于微生物菌群的长期保存和使用。

实施例1耐高温、高效利用未脱毒的酸解后木质纤维素生产乳酸的微生物菌群DUT50的筛选、进化及鉴定

牛瘤胃取自大连某活畜屠宰场，用镊子取新鲜的牛瘤胃内含物1g置于盛有1.5mL生理盐水的离心管中，涡旋振荡器振荡3min，使用一次性注射器吸取生理盐水，按5％(v/v)接种量将其接入装有20mL富集培养基的100mL西林瓶中，在42℃、200r/min下培养至底物消耗过半获得一级培养物；将一级培养物按照2％接种量转接至新鲜富集培养基中，培养至底物消耗过半获得二级培养物，将二级培养物按照2％接种量转接至新鲜富集培养基中，以此方式连续传代至第5代，第6代-第10代提高培养温度至45℃，第11代-第15代提高培养温度至47℃，第16代到20代提高培养温度至50℃。该微生物菌群在传代的后期，菌体的生长、底物的消耗以及乳酸的产量趋于稳定。通过温度的自适应进化策略，最终得到耐50℃、耐毒、乳酸生产能力和菌群结构稳定的微生物菌群。以该菌群为原液，用无菌生理盐水进行梯度稀释(10^-2～10^-6)，在稀释至10^-2时得到可消耗玉米秸秆酸解液的含最少菌种种类的微生物菌群DUT50，经16S rRNA基因测序及多样性分析，微生物菌群DUT50含有95.48％肠球菌属菌株和4.52％乳酸菌属菌株，其中百分比(％)表示各菌属的有效活菌数占总有效活菌数的百分比。

经涂平板从微生物菌群DUT50中分离得到单菌落S1和S2，经染色镜检，均为革兰氏阳性球菌，序列经克隆测序及比对后，确定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，菌株S1已于2020年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.21578，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium。经涂平板从微生物菌群DUT50中还分离得到单菌落S3，序列经克隆测序及比对后，确定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，为已知菌种。本发明中可以采用由商业渠道购买得到的菌种，如副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei，ATCC11578)。

实施例2毒性抑制物和玉米秸秆固液比对微生物菌群DUT50高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸的影响

将实施例1中获得的微生物菌群DUT50经种子培养后，按5％的体积比接种至1L全自动发酵罐中进行同步糖化发酵(装液量500mL)，发酵培养基和发酵设备都不灭菌，待木糖完全消耗后，结束发酵。考察了毒性抑制物含量和固液比对DUT50同步糖化玉米秸秆生产乳酸的影响，发酵结果如图1所示。水解液中毒性抑制物含量随着玉米秸秆固液比的增加而增加，当料液比为10％(w/v)时，毒性抑制物乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛的浓度分别为1.75g/L、1.49g/L、1.82g/L、1.93g/L；当料液比为20％(w/v)时，上述毒性抑制物的浓度分别为2.88g/L、2.20g/L、2.46g/L、2.20g/L；当料液比为35％(w/v)时，毒性抑制物的浓度分别为4.43g/L、2.97g/L、2.98g/L、2.28g/L。

当玉米秸秆固液比(w/v)为10％、15％和20％时，乳酸最终浓度分别为43.73g/L、53.69g/L和64.64g/L；转化率分别为0.50g/g秸秆、0.46g/g秸秆和0.44g/g秸秆。当进料量超过20％(w/v)后，一方面随着毒性抑制物浓度的增加，微生物菌群的生长受到了抑制；另一方面，玉米秸秆进料量的增加，酸预处理后木糖浓度增加，菌体代谢木糖速率慢导致最终生产强度低，且固液比增加会导致发酵培养基流动性差。基于上述原因，最终确定最优的玉米秸秆固液比为20％(w/v)。上述实验结果亦表明微生物菌群DUT50对酸解后未脱毒的玉米秸秆水解液有良好的耐受性，可高效同步糖化发酵生产乳酸，节省了生产及投资成本。

实施例3玉米浆干粉浓度对微生物菌群DUT50高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸的影响

将实施例1中获得的微生物菌群DUT50经种子培养基培养后，按5％的体积比接种至1L全自动发酵罐中进行玉米秸秆同步糖化发酵(装液量500mL)，玉米秸秆固液比为20％(w/v)，预糖化12h，发酵培养基和发酵设备都不灭菌。考察不同玉米浆干粉的浓度(10g/L、15g/L、20g/L、25g/L)对微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸的影响，发酵结果如图2所示，其中图2A～2D的玉米浆干粉的浓度分别为10g/L、15g/L、20g/L、25g/L。该菌群可以利用简易廉价的玉米浆干粉培养基(CSLP培养基)发酵生产乳酸，随着玉米浆干粉浓度的增加，葡萄糖和木糖的利用速率增加，发酵时间缩短，乳酸最终浓度增加，但当玉米浆干粉浓度超过20g/L时，乳酸浓度及转化率保持稳定，相应的乳酸最终浓度最高，为66.11g/L。

实施例4预糖化时间对微生物菌群DUT50高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸的影响

将实施例1中获得的微生物菌群DUT50经种子培养基培养后，按5％的体积比接种至1L全自动发酵罐中进行玉米秸秆同步糖化发酵(装液量500mL)，玉米秸秆固液比为20％(w/v)，玉米浆干粉的浓度为20g/L，发酵培养基和发酵设备都不灭菌。考察不同的预糖化时间(0h、2h、4h、6h)对微生物菌群DUT50高温同步糖化发酵生产乳酸的影响，发酵结果如图3所示，其中图3A～3D的预糖化时间分别为0h、2h、4h、6h。当预糖化时间为4h时，葡萄糖浓度在同步糖化72h后达到最高值，为37.82g/L，表明微生物菌群DUT50消耗葡萄糖速率低于秸秆酶解释放速率。预糖化时间为0h、2h、4h和6h，同步糖化发酵最高葡萄糖浓度分别为30.87g/L、37.50g/L、37.82g/L和36.15g/L，葡萄糖全部耗尽分别需要108h、144h、144h和108h，此时乳酸的浓度分别为45.54g/L、44.81g/L、46.17g/L和44.62g/L，最终乳酸的浓度分别为65.51g/L、64.46g/L、71.04g/L和68.05g/L。

实施例5微生物菌群DUT50高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸

根据实施例2～4实验结果，最终确定微生物菌群DUT50最佳发酵条件为：玉米秸秆固液比为20％(w/v)，玉米浆干粉的浓度为20g/L，预糖化时间为4h。在该最佳发酵条件下，采用微生物菌群DUT50进行发酵，如图4所示，在发酵72h时残余葡萄糖浓度达到最大，为37.82g/L；随着菌群的不断生长代谢，144h后，葡萄糖消耗殆尽，此时木糖和阿拉伯糖的残余浓度分别为19.88g/L和1.19g/L，乳酸的浓度为46.17g/L；当发酵时间延长至312h时，约60％的木糖消耗，此时乳酸的浓度为58.91g/L；发酵522h后，木糖全部消耗殆尽，乳酸的最终浓度、转化率和平均生产强度分别为71.04g/L、0.49g/g秸秆、0.14g/(L.h)。

实施例6屎肠球菌Enterococcus faecium DUT50高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸

将实施例1中获得的屎肠球菌Enterococcus faecium CGMCC No.21578经种子培养基培养后，按5％的体积比接种至1L全自动发酵罐中进行玉米秸秆同步糖化发酵(装液量500mL)。玉米秸秆固液比为20％(w/v)，玉米浆干粉的浓度为20g/L，预糖化时间为4h。结果如图5所示。在发酵48h时残余葡萄糖浓度达到最大，为30.33g/L；168h后，葡萄糖消耗殆尽，此时木糖和阿拉伯糖的残余浓度分别为19.98g/L和1.60g/L，乳酸的浓度为47.89g/L；当发酵时间延长至462h时，约60％的木糖消耗，此时乳酸的浓度为52.61g/L；发酵522h后，仍残留7.01g/L木糖，此时乳酸的浓度、转化率和平均生产强度分别为53.03g/L、0.36g/g秸秆、0.10g/(L.h)。

相对于微生物菌群DUT50同步糖化发酵生产乳酸而言，屎肠球菌单菌发酵结果表明，乳酸的浓度、转化率及生产强度分别下降了25％、27％和29％。该结果表明了微生物菌群DUT50相对于单菌而言，具有更优异地高温同步糖化酸解后木质纤维素发酵生产乳酸的能力。

Claims (6)

1.一种利用木质纤维素发酵生产乳酸的微生物混合菌群，其特征在于，所述的微生物混合菌群由作为优势菌的屎肠球菌和与所述屎肠球菌共生的乳酸菌属菌株组成，所述屎肠球菌的有效活菌数占微生物混合菌群中有效活菌数的95％以上，所述乳酸菌属菌株的有效活菌数占所述的微生物混合菌群中有效活菌数的5％以下；

所述乳酸菌属菌株为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei；

所述屎肠球菌为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏号为CGMCC No.21578；

所述微生物混合菌群利用酸预处理后的木质纤维素为底物发酵生产乳酸，其中，所述酸预处理后的木质纤维素不进行脱毒处理。

2.根据权利要求1所述的微生物混合菌群，其特征在于，所述微生物混合菌群在发酵生产乳酸时的发酵温度为37-50℃。

3.一种乳酸的发酵方法，其特征在于，该发酵方法包括将权利要求1或2所述的微生物混合菌群接入到以酸预处理后的木质纤维素为底物的发酵培养基中进行同步糖化发酵生产乳酸，同步糖化发酵温度为45-50℃。

4.根据权利要求3所述的乳酸的发酵方法，其特征在于，所述的酸预处理后的木质纤维素不进行脱毒处理。

5.根据权利要求3所述的乳酸的发酵方法，其特征在于，在发酵过程中发酵培养基和发酵设备不灭菌。

6.根据权利要求3所述的乳酸的发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为：10-35％(w/v)玉米秸秆，10-25g/L玉米浆干粉，预糖化时间为0-12h。

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