TWI572714B - 耐受木質纖維水解液之高旋光 l-乳酸生產菌株 - Google Patents

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耐受木質纖維水解液之高旋光L-乳酸生產菌株
本發明係關於一株具耐受木質纖維水解液之副乾酪乳酸桿菌，尤其係關於一株經基因改造後具有生產高純度L型(左旋)乳酸之副乾酪乳酸桿菌。
聚乳酸(PLA)係由乳酸為單體聚合而成，具有生物可分解之特性，為極具潛力的生質塑料的原料之一。而乳酸為一種光學異構物，其係可分為左旋(L,Levo)與右旋(D,Dextro)。聚乳酸必須經由高純度的D型與L型乳酸進行比例調配，得以製造出不同物理與熱化學特性的聚乳酸。而一般乳酸可由微生物醱酵糖質而得，而醱酵而得的乳酸之旋光性則取決於該微生物中乳酸去氫酶種類之活性。
另一方面，為了降低乳酸生產成本，並減少可食用碳水化合物如玉米、澱粉質的使用，而使用木質纖維料源例如稻稈、蔗渣、木片等料源，便成了一項具潛力的替代糖質來源。然而，纖維料源在稀酸蒸氣爆裂前處理過程中，會產生多種抑制物如呋喃甲醛(furfural)、羥甲基糠醛(5-HMF)及醋酸(acetic acid)等物質，該等物質會影響菌株生長能力，甚至死亡。為了避免纖維抑制物 影響菌株之醱酵能力，製程上多數會進行去毒化之動作，但此一去毒化之動作即會增加乳酸製程上的生產成本。
有鑒於此，本發明之目的即為提供一株耐受木質纖維水解液之高旋光L-乳酸生產菌株，係先篩選一株具有纖維水解液耐受性的乳酸生產菌株，同時利用基因工程技術，將該菌株D型乳酸去氫酶(d-ldh)基因失活，以提升該菌株所生產之乳酸中之L型乳酸旋光度至100%。
為了克服木質纖維料源在前處理過程產生之抑制物所造成菌株醱酵抑制現象，現今技術常以演化突變之方式如：利用突變劑或照射高能量之光線，並以木質纖維水解液培養菌株，藉此得到突變菌株以提升菌株對於纖維抑制物之耐受度。然而，此一篩選過程耗時較長，且在後續的菌株培養過程中，易造成菌株之基因修復現象，而導致原突變菌株之基因不穩定性，進而喪失纖維抑制物耐受性之特性。
故本發明以篩選原生優勢菌種，具耐高濃度木質纖維抑制物及高乳酸產率之性質，以進行纖維乳酸之生產，才能改善此問題。
本發明之目的即針對上述問題，提供一株耐受木質纖維水解液抑制物之高旋光L-乳酸生產菌株-副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7BL)，該副乾酪乳酸桿菌寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910698，該副乾酪乳酸桿菌對於纖維水解液中的抑制物耐受性高，且代謝葡萄糖生產高旋光L-乳酸。
如上所述之副乾酪乳酸桿菌，其中該木質纖維水解液係以木質纖維為原料，經稀酸水解、蒸氣爆裂前處理與由酵素水解後所得之未去毒化水解液。
如上所述之副乾酪乳酸桿菌，其中該木質纖維水解液至少含有呋喃甲醛(furfural)、羥甲基糠醛(5-HMF)及醋酸(acetic acid)等三種抑制物。
如上所述之經基因改造副乾酪乳酸桿菌，其醱酵所得之乳酸中L-型乳酸旋光性比例為100%。
藉由本發明所提供之副乾酪乳酸桿菌，於高營養源醱酵測試結果，其乳酸生產效率最高可達6.89g/L/h，此時乳酸濃度為99.2g/L。此外，本發明亦利用批次饋料方式(Fed-batch)，可生產215.2g/L之乳酸，顯示該菌株具有高產量、高效率之特性。
同時，經分開酵素水解與醱酵製程(Separate hydrolysis and fermentation，SHF)測試，本發明之經基因改造副乾酪乳酸桿菌可於不去毒化狀態下，醱酵木片與稻稈等木質纖維水解液，乳酸產率分別可達2.25g/L/h與5.27g/L/h。
藉由如上所述之經基因改造副乾酪乳酸桿菌及其醱酵製程，係可進行耐高濃度木質纖維抑制物之醱酵及進行高旋光性L-型乳酸之醱酵生產，係可減少製程成本上的支出與增加操作上的便利性。
第1圖係為本發明之菌種16S rDNA序列鑑定結果。
第2A圖係為本發明基因改造菌株之基因重組載體設計圖。
第2B圖係為本發明中重組菌株與對照組菌株之d-ldh基因PCR結果電泳圖。
第3圖係為本發明之7BL菌株之醱酵葡萄糖生產乳酸之曲線圖。
第4圖係為本發明之7BL菌株以批次饋料醱酵葡萄糖，生產高濃度乳酸之曲線圖。
第5圖係為本發明之7BL菌株於稻稈水解液中醱酵生產乳酸之曲線圖。
第6圖係為本發明之7BL菌株於木片水解液中醱酵生產乳酸之曲線圖。
第7圖係為本發明之7BL菌株於木片水解液中，以分批饋料方式醱酵生產乳酸之曲線圖。
為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：本發明之菌株來源係篩選自水果醱酵液，經MRS培養基(後述表2)搭配酸性指示劑，篩選產酸之優勢菌落。並由高效液相層析儀(High-performance liquid chromatography)分析其醱酵樣品之數據，分析乳酸產量與旋光性。本發明之菌種鑑定結果如圖1中16S rDNA序列比對與下表1之生理生化分析所示。根據16S rDNA序列比對，本發明所篩選之菌株與Lactobacillus casei,Lactobacillus paracasei subsp.paracasei,Lactobacillus paracasei subsp.tolerans及Lactobacillus zeae相似性高達99%以上；經生理生化分析，本發明所篩選之菌株與資料庫中之Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC12248最為接近，但其中D-sorbitol、Methy-D-glucopyranoside與D-sacchrose等三項皆不同於 BCRC12248，顯示該菌株為一新穎菌株，遂命名本發明所篩選之菌株為Lactobaciilus paracasei subsp.paracasei 7B(副乾酪乳酸桿菌)。該副乾酪乳酸桿菌菌種之菌液與50%甘油以1：1之混合比例，製備成凍管並保存於-80℃冰箱中。
醱酵樣品之數據分析，係利用高效液相層析儀之Coregel-87H3(Transgenomics,Co.)管柱，搭配流速0.8mL min-1之4mM H2SO4沖提液於45℃進行樣品分離，以折射率偵測器(refractive index detector)偵測沖提流出液中待測化 合物之訊號，紀錄分離出每種化合物的發生時間。另外乳酸之旋光性係利用chiral管柱(Supelco Astec CLC-D)，搭配1.0mL min-1之10mM CuSO4沖提液於25℃進行分析。
依據如下表2培養基配方於250ml搖瓶中配製種菌培養基，在121℃下高壓滅菌20分鐘後，自凍管取出體積為培養基的千分之一Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7B菌株，接種於培養基內並於溫度37℃、轉速150rpm下培養24小時，以得到醱酵實驗的種菌液(OD600=10.0)。
實施例1：
請參見下表3所示，本發明之菌株與其他乳酸菌於木片纖維水解液中醱酵之結果。本試驗於1-L醱酵槽進行，醱酵總體積為0.8L，加入640ml經由稀酸蒸氣爆裂前處理及酵素水解後之木片水解液，並添加1% yeast extract作為補充氮源，再加入160ml各種乳酸菌之種菌液進行醱酵48小時，並以氨水控制pH值在6.0。結果顯示Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7B可在此水解液中 生長良好，且乳酸產量較其他乳酸菌佳，顯示該菌種較適合用於纖維乳酸的生產。
實施例2：
經旋光性分析，Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7B所產生之乳酸約為95%為L-型。為達成生產100% L-型乳酸，本發明依據圖2A來建構基因重組載體，進行D型乳酸去氫酶(d-ldh)基因失活菌株之建構，流程簡述如下：首先分別利用引子對dDN-F/R與dDC-F/R(參見下表4)，並以菌株7B基因體為模 板進行聚合酶鏈鎖反應(PCR,polymerase chain reaction)反應，將d-ldh基因上、下游片段放大，PCR反應條件為94℃ 5分鐘，94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分鐘反應25個循環，最後再於72℃進行10分鐘，獲得之片段分別為dD-N與dD-C，接著分別以限制酵素BamHI/EcoRI與EcoRI/ClaI，接到pBTE載體上(此載體為大腸桿菌複製型載體，但無法在乳酸菌複製)，最後再將氯黴素(chloramphenicol)抗性基因利用EcoRI切位置入dD-N與dD-C片段中間，所完成之載體為pBTEC-dD。後續將此pBTEC-dD載體以電穿孔基因轉殖法(electroporation)送進菌株7B進行同源重組，重組示意圖如圖2A所示，並於氯黴素抗生素培養基中篩選。挑選重組菌株，利用DldhA-F/R引子對以PCR方式進行確認，該引子對應於d-ldh基因之上下游，如圖2A所示。PCR結果如圖2B之電泳圖所示，重組菌株之d-ldh基因被氯黴素抗性基因阻斷而延長，因此PCR結果較原生菌株7B多出了1.0kbp左右。接著經由醱酵與HPLC分析，該重組菌株所生產之乳酸偵測不到任何D-型乳酸，顯示該基因突變成功，將此菌株命名為Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7BL，並將菌液與50%甘油以1：1之混合比例，製備成凍管並保存於-80℃冰箱中。本實驗所用的引子如表4所示。
實施例3：
請參見圖3所示，將本發明之7BL菌株進行乳酸醱酵。本試驗於5-L醱酵槽進行，醱酵總體積為1.5L，將7BL種菌液(OD=10.0)，以10%(v/v)接種於液態培養基中(如表2所示)，調整葡萄糖濃度至大約110g/L，並以氨水控制pH值在6.0。結果顯示乳酸濃度約96.57g/L，乳酸產率高達6.89g/L/h。
實施例4：
請參見圖4所示，將本發明之7BL菌株進行饋料模式以獲取高濃度乳酸。本試驗於5-L醱酵槽進行，初始醱酵體積為1.5L，將7BL種菌液(OD=10.0)，以10%(v/v)接種於液態培養基中(如表2所示)，調整葡萄糖濃度至大約110g/L，待醱酵12小時之後，將500ml且濃度750g/L之葡萄糖溶液添加至醱酵槽。結果顯示乳酸濃度可達215g/L。
請參見圖5所示，將本發明之7BL菌株進行稻稈纖維水解液醱酵測試，該批稻稈水解液抑制物濃度分別為HMF 0.51g/L,furfural 0.78g/L，醋酸4.03g/L。本試驗於5-L醱酵槽進行，醱酵總體積為1.5L，以20%(v/v)接種於稻稈水解液中，並添加1% yeast extract作為補充氮源。結果顯示乳酸產率高達5.27g/L/h。
實施例5：
請參見圖6所示，將本發明之7BL菌株進行木片水解液醱酵測試，該批木片水解液抑制物濃度分別為HMF 1.04g/L,furfural 2.08g/L，醋酸15.91g/L。本試驗於5-L醱酵槽進行，醱酵總體積為1.5L，以20%(v/v)接種於木片水解液中，並添加1% yeast extract作為補充氮源。結果顯示乳酸產率亦可達2.25g/L/h。
實施例6：
實驗設定如同實施例5，本試驗改以兩階段方式將木片水解液饋入醱酵槽。結果如圖7所示，分批饋料可提升乳酸產率至3.23g/L/h。
經由上述實驗結果可知，本發明中所提供之經基因改造副乾酪乳酸桿菌，於高營養源醱酵測試結果，其乳酸生產效率最高可達6.89g/L/h，此時乳酸濃度為99.2g/L。此外，本發明亦利用批次饋料方式(Fed-batch)，可生產215g/L之乳酸，顯示該菌株具有高產量、高效率之特性；同時，經分開酵素水解與醱酵製程(Separate hydrolysis and fermentation，SHF)測試，本發明之經基因改造副乾酪乳酸桿菌可於不去毒化狀態下，醱酵木片與稻稈等木質纖維水解液，乳酸產率分別可達3.23g/L/h與5.27g/L/h。
並藉由本發明中經基因改造副乾酪乳酸桿菌及其醱酵製程，係可進行耐高濃度木質纖維抑制物之醱酵及進行高旋光性L-型乳酸之醱酵生產，以期減少製程成本上的支出與增加操作上的便利性。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊
中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)
2015年9月2日
BCRC 910698

Claims (4)

  1. 一種耐受木質纖維水解液抑制物之高旋光L-乳酸生產菌株-副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei 7BL)，該副乾酪乳酸桿菌7BL寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910698，該副乾酪乳酸桿菌對於木質纖維水解液中的抑制物耐受性高，且代謝葡萄糖生產高旋光L-乳酸。
  2. 如請求項1所述之副乾酪乳酸桿菌，其中該木質纖維水解液係以木質纖維為原料，經稀酸水解、蒸氣爆裂前處理與由酵素水解後所得之未去毒化水解液。
  3. 如請求項2所述之副乾酪乳酸桿菌，其中該木質纖維水解液至少含有呋喃甲醛(furfural)、羥甲基糠醛(5-HMF)及醋酸(acetic acid)等三種抑制物。
  4. 如請求項1所述之副乾酪乳酸桿菌，其醱酵所得之乳酸中L-型乳酸旋光性比例為100%。
TW105104914A 2015-10-16 2016-02-19 耐受木質纖維水解液之高旋光 l-乳酸生產菌株 TWI572714B (zh)

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