TWI577800B - 高溫生產乳酸之有糞腸球菌及其用途 - Google Patents

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Description

高溫生產乳酸之有糞腸球菌及其用途
本發明係關於一種新穎之乳酸生產菌株及其用途，尤其係關於一種高溫發酵高效生產高純度L型乳酸之有糞腸球菌及其用途。
聚乳酸(polylactic acid，簡稱PLA)是一種極具潛力的生質塑料之原料，具有生物可分解和無毒等環保特性；可由澱粉或木質纖維等生物材料製得，其應用範圍包含食品包裝、醫用材料及紡織纖維。聚乳酸是以乳酸為單體聚合而成，而乳酸是一種光學異構物，可分為左旋乳酸(又名L型乳酸)與右旋乳酸(又名D型乳酸)。聚乳酸必須由高純度的D型與L型乳酸依照比例調配，才得以製造出具備特定物理與熱化學特性的聚乳酸。市面上最常使用的聚乳酸為L型乳酸聚合之聚左旋乳酸(PLLA)，因為左旋乳酸的光學純度影響聚合結晶性，即光學純度越高結晶性越高，故光學純度是影響產品應用範圍的要件之一。
乳酸可由化學合成或微生物發酵兩種方式取得。化學合成方法是以強酸水解石化產品乙腈(acetonitrile)，所得之乳酸包含L型和D型兩種光學異構物，無法使用於食品和藥品產業，亦不適合用於聚乳酸的合成。微生物發酵方法是利用微生物如乳酸桿菌(Lactobacillus)、鍵球菌(Streptococcus)等將糖質轉換為乳酸，其產物選擇性佳，具有高光學純度 (>99%)，可應用至各種產業，優於化學合成方式。因此，目前全球90%以上乳酸皆以微生物發酵方法生產。
工業上，將纖維或澱粉轉換為乳酸之製程包含酵素水解與其後之乳酸發酵二個步驟。在酵素水解步驟中，水解酵素最適作用溫度為50℃-80℃，然而傳統常用之乳酸生產菌的最適發酵溫度為35-37℃。當採用分步水解與發酵程序(separate hydrolysis and fermentation；SHF)進行以纖維或澱粉為原料之乳酸生產，其製程上需待酵素水解完畢，將發酵槽溫度從50℃降溫至35-37℃，菌株才得以進行發酵。此控溫過程往往需要以大量冷卻水去降低發酵槽體溫度，菌株方能存活並進行乳酸發酵，此舉不僅增加製程上的生產成本，低溫發酵也易增加雜菌汙染而導致敗槽現象。
使用一般野生之乳酸生產菌株於分步水解與發酵程序會遭遇如下難題。其一，一般野生乳酸生產菌株多為L型和D型乳酸混合菌株，需透過基因改良方式，阻斷D型乳酸去氫酶(d-ldh)基因，使菌株可產出高純度L型乳酸。此外，現今多以突變菌株基因之方式得到突變菌株以提升菌株對於高溫之耐受度，然而此過程耗時長，且在後續菌株培養的過程中，易出現菌株之基因修復現象，導致原突變菌株之基因不穩定性，進而喪失高溫耐受性。其二，將發酵槽體控溫於野生型乳酸生產菌株可耐受之溫度範圍35-40℃，將導致高能耗、生產成本增加和因高溫而影響乳酸轉化效率等問題。因此，尋找一種具有耐高溫、高光學純度和高乳酸生產效率特性之新穎菌株，用於乳酸之量產，實有迫切需要。
本發明係提供一種高溫生產乳酸之有糞腸球菌SI菌株(Enterococcus faecalis SI)，係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710。
本發明亦提供一種有糞腸球菌用於高溫發酵高效生產高純度L型乳酸之用途，其中該有糞腸球菌SI菌株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710。
在本發明之一實施例中，該有糞腸球菌SI菌株係高溫發酵一發酵糖原料，該發酵糖原料係包含糖質、澱粉或木質纖維素所產出之糖類，且其中該高溫發酵之溫度範圍係40-50℃，該高溫發酵之操作pH值範圍係pH 6-8，該高純度L型乳酸係為99.9%以上光學純度之L型乳酸。
在本發明之一較佳實施例中，該高溫發酵之溫度係42℃，該生產乳酸之效率係至少1.56g L-1h-1。
本發明另提供一種高溫發酵生產高純度L型乳酸之組成物，包含有糞腸球菌SI菌株(Enterococcus faecalis SI)，其中該有糞腸球菌SI菌株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710，其中，該高純度L型乳酸係為99.9%以上光學純度之L型乳酸，且該高溫發酵之溫度範圍係40-50℃。
本發明之新穎菌株具有高溫發酵、生產高光學純度L型乳酸和高生產效率之特性，將其運用於L型乳酸之量產，可改進製程之分步水解與發酵程序，令製程成本降低、減少能耗、避免雜菌生長，並增加操作上的便利性。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，以下所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，所做些許更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明之專利範圍中。
第一圖係為100L發酵槽中有糞腸球菌SI菌株進行乳酸發酵之發酵液組成濃度變化圖。
第二圖係為9,000L發酵槽中有糞腸球菌SI菌株進行乳酸發酵之發酵液組成濃度變化圖。
定義
本發明說明書中所稱「有糞腸球菌SI菌株」，係為寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710之菌株，亦簡稱為「SI菌株」。
菌株分離培養及鑑定
本發明之新穎菌株來源係篩選自台北市信義區果菜市場之家庭廚餘，於250mL錐形瓶中，以20mL MRS培養基(10g半消化蛋白，10g牛肉萃取物，5g酵母萃取物，20g葡萄糖，1g聚山梨醇酯80，2g檸檬酸銨，5g醋酸鈉，0.1g硫酸鎂，0.05g硫酸錳，2g磷酸氫二鉀，溶於1L去離子水)於37℃進行培養。培養液經2日培養，取培養液塗佈至MRS培養盤中，經37℃培養24小時，挑選單一菌落接種至MRS培養基。經高效液相層析儀(High-performance liquid chromatography)分析該培養基中之發酵產物，得知該菌株為一乳酸生產菌株。此乳酸生產菌株經16s rRNA基因第17至1501號位置(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列比對，確認與有糞腸球菌(Enterococcus faecalis)之序列相似度達100.0%，命名為有糞腸球菌SI，寄 存編號為BCRC 910710。
以下，將以本發明所分離出的有糞腸球菌SI菌株(Enterococcus faecalis SI)進行乳酸發酵試驗，以評估發酵最適條件、產出乳酸之光學純度、產量(yield)及生產效率(productivity)。各實施例中之乳酸發酵均為低氧發酵，在無通氣情況下進行。
發酵液之特性分析
發酵液之組成與濃度分析，係利用高效液相層析儀，配合Coregel-87H3(Transgenomics,Co.)管柱。以流速0.8mL/min之4mM硫酸沖提液於45℃進行發酵液樣品分離，並以折射率偵測器(refractive index detector)偵測沖提流出液中待測化合物之訊號，紀錄分離出的每種化合物的發生時間及訊號強度；其中，乳酸之UV光吸收波長為254nm。對照待測物之已知濃度標準溶液的校正曲線，可計算待測物之濃度。
發酵液之光學純度分析，係利用高效液相層析儀，配合Astec® CLC-D Chiral column(Sigma-Aldrich,Co.)管柱。移動相為10mM CuSO4，以二極體陣列偵檢器(diode array detector)偵測沖提流出液中待測化合物之訊號，紀錄分離出的每種化合物的發生時間及訊號強度；其中，乳酸之UV光吸收波長為254nm。經計算發酵液中L型乳酸及D型乳酸之濃度，可得L型乳酸的光學純度，計算公式如下：L型乳酸/(L型乳酸+D型乳酸)×100%
實施例1 有糞腸球菌SI菌株之乳酸發酵溫度試驗
在MRS培養基中添加葡萄糖至110g/L以評估溫度對於SI菌株乳酸發酵的影響。該發酵於5L發酵槽中以3L體積、250rpm轉速進行，種菌接種量為10%(約0.28g乾菌重/L)，發酵pH值為7。
不同溫度下乳酸發酵之結果比較如表1所示，可發酵溫度為37-50℃，產出L型乳酸的光學純度皆達99.9%。其中，發酵溫度為40-45℃時，產率為0.93-0.94gp gs -1，且乳酸生產效率為7.27-8.62gp L-1 h-1，以42℃時可得乳酸最高生產效率為8.62gp L-1h-1。
實施例2 有糞腸球菌SI菌株之乳酸發酵pH值試驗
使用水解木片所得之葡萄糖液進行pH值對SI菌株乳酸發酵影響的試驗。該木片為核能研究所噸級廠之稀酸蒸氣爆裂前處理木片； 木片水解條件為固液比20%，以15FPU/g纖維水解酵素進行酵素水解。該發酵於5L發酵槽中以3L體積、250rpm轉速進行，種菌接種量為10%(約0.28g乾菌重/L)，發酵溫度為37℃。
不同pH值的乳酸發酵之結果比較如表2所示，可操作pH值為6-8，產出L型乳酸的光學純度皆達99.9%。其中，發酵pH值為7和8時產率最高，可達0.92gp gs -1，且pH 7時可得乳酸最高生產效率為1.04gp L-1 h-1。
實施例3 100L發酵槽以有糞腸球菌SI菌株進行乳酸發酵之組成濃度變化
為驗證SI菌株於高溫下量產高光學純度L型乳酸之能力，以實施例1、2所得之最佳發酵條件42℃和pH 7進行乳酸發酵規模放大之試驗。使用發酵槽為100L量產型中型發酵槽，發酵原料為核能研究所噸級廠之稀酸蒸氣爆裂前處理木片經纖維水解酵素水解所得葡萄糖液。該木片水解條件為固液比20%，以15FPU/g纖維水解酵素進行水解。將濃度10%之SI菌株接種至100L發酵槽中進行70rpm震盪發酵，並監測發酵液之組 成濃度變化。
乳酸發酵結果如第一圖所示，經發酵54小時，乳酸濃度達65.40gp L-1，L型乳酸光學純度達99.9%，產率達1.04gp gs -1，乳酸最大生產效率達1.35gp L-1 h-1。
實施例4 9,000L發酵槽以有糞腸球菌SI菌株進行乳酸發酵之組成濃度變化
為驗證SI菌株於高溫下量產高光學純度L型乳酸之能力，以實施例1、2所得之最佳發酵條件42℃和pH 7進行乳酸發酵規模放大之試驗。使用發酵槽為9,000L量產型大型發酵槽，發酵原料為核能研究所噸級廠之稀酸蒸氣爆裂前處理木片經纖維水解酵素水解所得葡萄糖。該木片水解條件為固液比20%，以15FPU/g纖維水解酵素進行水解。將濃度10%之SI菌株接種至9,000L發酵槽中進行30rpm震盪發酵，並監測發酵液之組成濃度變化。
乳酸發酵結果如第二圖所示，經發酵80小時，乳酸濃度達91.51gp L-1，L型乳酸光學純度達99.9%，產率達0.97gp gs -1，乳酸最大生產效率達1.56gp L-1 h-1。
由上述實施例可知，本發明之SI菌株具有高溫發酵、生產光學純度99.9%以上L型乳酸之特性，且在42℃下，該菌株於9,000L發酵槽中表現出高乳酸生產效率1.56gp L-1 h-1。
綜合而言，本發明充分利用新穎之SI菌株之高溫發酵、生產高光學純度L型乳酸之特性於乳酸量產，尤其將其應用至不同糖類來源之乳酸發酵，如將纖維或澱粉轉換為乳酸，可達到降低傳統分步水解與發酵程序之製程成本、減少能耗、避免雜菌生長及增加操作上的便利性等優點。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
財團法人食品工業發展研究所，104年10月16日，BCRC 910710。
<110> 行政院原子能委員會核能研究所
<120> 高溫生產乳酸之有糞腸球菌及其用途/Enterococcus faecalis and uses of lactic acid production at high temperatures
<130>
<160> 1
<210> 1
<211> 1485
<212> DNA
<213> 有糞腸球菌SI菌株
<400> 1

Claims (11)

  1. 一種高溫生產乳酸之有糞腸球菌株(Enterococcus faecalis)，係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710。
  2. 一種有糞腸球菌用於高溫發酵高效生產高純度L型乳酸之用途，其中該有糞腸球菌株寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該有糞腸球菌株係高溫發酵一發酵糖原料，該發酵糖原料係包含糖質、澱粉或木質纖維素所產出之糖類。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該高溫發酵之溫度範圍係40-50℃。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該高溫發酵之溫度係42℃。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該高溫發酵之操作pH範圍係pH 6-8。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該高效生產乳酸之效率係至少1.56g L-1 h-1。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該高純度L型乳酸係為99.9%以上光學純度之L型乳酸。
  9. 一種高溫發酵生產高純度L型乳酸之組成物，包含有糞腸球菌株(Enterococcus faecalis)，其中該有糞腸球菌株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910710。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之組成物，其中該高純度L型乳酸係為99.9% 以上光學純度之L型乳酸。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之組成物，其中該高溫發酵之溫度範圍係40-50℃。
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