CN112239738B - 一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供一株大肠杆菌，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME‑N‑5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。本发明的大肠杆菌FMME‑N‑5在厌氧摇瓶水平上发酵52 h，生产琥珀酸产量达56.77 g/L，在发酵罐水平上发酵96h，琥珀酸产量达105.2 g/L；本发明发酵生产琥珀酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

Description

一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
琥珀酸，学名丁二酸，是一种重要的C4平台化合物。作为合成通用化学品的起始原料，琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，琥珀酸被美国能源部列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的首位。
琥珀酸的传统生产方法是化学合成法，主要有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等，但由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。而通过发酵法生产琥珀酸，能够摆脱对不可再生的战略资源石油的依赖，利用可再生资源，固定二氧化碳减轻温室效应，展现出良好的发展前景。目前研究较多的产琥珀酸的菌种有：产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌和大肠杆菌。产琥珀酸放线杆菌通常是从自然界中筛选，进行定向改造，能够耐受高浓度的琥珀酸盐，Guettler M等人利用突变株产琥珀酸放线杆菌FZ53生产琥珀酸产量最高，以葡萄糖为碳源，发酵48h产量可以达到最高产量110g/L，关于产琥珀酸放线杆菌菌种的研究较少，需要进一步的对其生理特性、发酵性能和遗传背景进行研究。产琥珀酸厌氧螺菌可以利用的发酵底物比较广泛，例如葡萄糖、乳糖、甘油等，Samuelov等人的研究结果表明，在最适条件下，产琥珀酸厌氧螺菌琥珀酸的产率可以达到1.2mol/1.0mol葡萄糖，最高产量为65.0g/L，但是该菌株发酵需要严格的厌氧环境，工业化应用中很难实现。大肠杆菌作为模式菌株，遗传背景清晰，易操作，能够采用各种分子生物学的技术对菌种进行改造，所以采用大肠杆菌发酵琥珀酸已经成为一个热点，研究也取得了众多进展，张学礼等人运用基因工程及适应性进化策略构建得到重组大肠杆菌HX024，采用一步厌氧法发酵96h，最终琥珀酸产量达到95.9g/L，得率达到1g/g葡萄糖；本实验室之前选育的菌株FMME-SuAP罐上发酵55h，琥珀酸产量80g/L，但是因不能耐受高浓度产物，延长发酵时间，琥珀酸产量不再增加。
目前大肠杆菌发酵的生产效率较低，发酵液中通常有乳酸、甲酸、乙酸、乙醇等副产物，发酵过程辅因子代谢不平衡、不能耐受高浓度的产物浓度以及底物葡萄糖浓度、高浓度渗透压和葡萄糖吸收利用速度过快导致代谢失衡的问题；因此还需要进一步利用传统选育手段、各种组学分析与分子生物学改造相结合的方法，获得高性能的生产菌株。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株产琥珀酸的大肠杆菌，并应用该菌株发酵生产琥珀酸。
本发明的第一个目的是提供一株产琥珀酸的大肠杆菌，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-N-5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。
本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌在发酵生产琥珀酸中的应用。
进一步地，所述应用是采用所述大肠杆菌在发酵培养基中进行有氧-厌氧两阶段发酵，得到含有琥珀酸的发酵液。
进一步地，所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖30-50g/L，玉米浆15-25g/L，(NH4)2SO4 2-4g/L，K2HPO4 1.2-2.0g/L，KH2PO4 0.5-1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L，NaCl 1-2g/L。
进一步地，所述的有氧-厌氧两阶段发酵是在菌体OD600＝52-60时，将有氧阶段转为厌氧阶段。
进一步地，将有氧阶段转为厌氧阶段是通过通入CO2气体或者添加10-20g/L碳酸氢盐的方式进行。
进一步地，在厌氧阶段，控制葡萄糖浓度为5-15g/L。
进一步地，所述的有氧-厌氧两阶段发酵的接种量，按体积百分比计，为6-12％；发酵温度为35-38℃。
进一步地，所述的有氧-厌氧两阶段发酵的发酵时间为50-96h。
进一步地，在厌氧阶段，添加pH中和剂，所述pH中和剂为Na2CO3、K2CO3、NaOH、KOH、CaCO3、碱式碳酸镁一种或几种混合。
进一步地，在有氧-厌氧两阶段发酵48h后，添加渗透压保护剂，所述渗透压保护剂为脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甜菜碱中的一种或几种混合。
本发明的有益效果：
本发明的大肠杆菌FMME-N-5在厌氧摇瓶水平上发酵52h，生产琥珀酸产量达56.77g/L，在发酵罐水平上发酵96h，琥珀酸产量达105.2g/L，之前选育菌株FMME-SuAP菌株罐上发酵55h，琥珀酸产量80g/L，但是因不能耐受高浓度产物，延长发酵时间，琥珀酸产量不再增加；而本发明诱变选育菌株FMME-N-5对产物丁二酸钠的耐受性提高，最终琥珀酸产量提高至105.2g/L；本发明发酵生产琥珀酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。
生物材料保藏
大肠杆菌(Escherichia coli)FMME-N-5，所述大肠杆菌已于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1为诱变后筛选大肠杆菌突变株的平板形态；
图2为大肠杆菌FMME-N-5在厌氧摇瓶发酵过程琥珀酸的产量变化曲线；
图3为大肠杆菌FMME-N-5在发酵罐水平发酵过程琥珀酸产量变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
种子培养基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉浸取物：3，NaCl 5，pH＝7.0。
诱变筛选培养基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 1、KH2PO4 1.16、K2HPO4 0.5、MgSO4·7H2O 0.3、NaHCO3 16、溴甲酚紫0.05、琼脂20、葡萄糖100、琥珀酸钠70、pH＝6.8-7.0；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖35，玉米浆20，(NH4)2SO4 3，K2HPO4 1.4，KH2PO4 0.6，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2，pH＝6.8-7.0
菌体浓度的测定：
取适量发酵液用2mol/L的盐酸中和后，菌体密度以分光光度计600nm波长下检测的吸光值来表示。
葡萄糖的测定：
发酵液预处理：取发酵液12000r/min离心5min取上清。稀释至适宜倍数，用M-100生物传感分析仪检测发酵液葡萄糖浓度。
有机酸的测定：
高效液相色谱法：发酵液预处理：取发酵液12000r/min离心5min取上清。稀释适宜倍数后，利用高效液相色谱仪(HPLC)检测琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸的产量。仪器为Waterse2695反相高效液相色谱仪，色谱柱采用Bio-Rad HPX 87H；流动相为5mmoL/L H2SO4；流速设定为0.6mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长为210nm，柱温为35℃。
实施例1：
(1)常压室温等离子体(ARTP)诱变
A、制备菌悬液
取前期筛选得到的FMME-SuAP菌株(在CN109251941A中公开)200μL接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，38℃，200rpm培养8.5h至对数中后期，将菌液4℃，6000rpm，离心5min，弃去培养基，菌体用生理盐水溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，将菌悬液OD600调至0.6。
B、ARTP诱变处理
取制备好的菌悬液10μL均匀涂抹至已灭菌冷却的小铁片上，并置入ARTP育种机，诱变功率100W，高纯氦气通气量10SLM，处理距离2mm，分别处理0、15、30、45s。
C、后培养
将处理后的小铁片取出，放入装有990μL种子培养基的1.5mL离心管中，用涡旋振荡仪振荡菌体至少100s，使其彻底悬浮于种子培养基中，而后转入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，38℃，200rpm后培养8.5h。
D、筛选
将后培养菌液分别稀释至10-6和10-7浓度，取100μL涂布于筛选固体培养基(含有120g/L丁二酸钠+10g/L葡萄糖)。以ARTP诱变处理0s为对照组。将涂布好的平板置于38℃恒温培养箱中培养1-2天。从平板上挑取单菌落，进行摇瓶发酵验证，并挑选琥珀酸生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证，筛选出琥珀酸生产能力最优的一株菌。
(3)60Coγ射线辐照处理
A、制备菌悬液
取上述经ARTP筛选得到的菌株200μL接入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，38℃，200rpm培养8.5h至对数中后期，将菌液4℃，6000rpm，离心5min，弃去培养基，菌体用生理盐水洗涤3次，再用生理盐水重悬，将菌悬液OD600调至1.0。
B、60Coγ射线辐照处理
将制备好的菌悬液分置于五支试管中，每管10mL，直接进行γ射线处理，辐照剂量分别为0、0.2、0.4和0.6kGy。
C、筛选
将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10-6和10-7浓度，取100μL涂布于筛选固体培养基(120g/L丁二酸钠+10g/L葡萄糖)。以辐照剂量0kGy为对照组。将涂布好的平板置于38℃恒温培养箱中培养1-2天。从筛选平板上挑取单菌落，进行摇瓶发酵验证，并挑选琥珀酸生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证52h；筛选FMME-N-5菌株的琥珀酸生产能力最优，已于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。
实施例2：摇瓶水平FMME-SuAP发酵生产琥珀酸
(1)种子培养：挑取FMME-SuAP单菌落至装液量25mL/50mL的种子培养基中，38℃、200rpm培养8.5h得到一级种子液；取一级种子液200μl接种至50mL/500mL的种子培养基中；38℃、200rpm培养7.5h得到二级种子液。
(2)摇瓶发酵培养：将二级种子液以10％(v/v)接种至装有50mL/500mL发酵培养基的500mL摇瓶中，温度38℃，转速200r/min条件下，有氧培养12h，转入厌氧瓶进行厌氧发酵40h，共发酵52h。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，玉米浆20，(NH4)2SO4 3，K2HPO4 1.4，KH2PO4 0.6，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2。
采用本实施例的方法应用大肠杆菌FMME-SuAP发酵生产琥珀酸，发酵52h后，琥珀酸摇瓶产量41.7g/L，且随着发酵时间的延长，琥珀酸产量不再提高。
实施例3：摇瓶水平FMME-N-5发酵生产琥珀酸
(1)种子培养：挑取单菌落至装液量25mL/50mL的种子培养基中，38℃、200rpm培养8.5h得到一级种子液；取一级种子液200μl接种至50mL/500mL的种子培养基中；38℃、200rpm培养7.5h得到二级种子液。
(2)摇瓶发酵培养：将二级种子液以10％(v/v)接种至装有50mL/500mL发酵培养基的500mL摇瓶中，温度38℃，转速200r/min条件下，有氧培养12h，转入厌氧瓶进行厌氧发酵40h，共发酵52h。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，玉米浆20，(NH4)2SO4 3，K2HPO4 1.4，KH2PO4 0.6，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2。
采用本实施例的方法应用大肠杆菌发酵生产琥珀酸，发酵52h后，琥珀酸摇瓶产量56.77g/L，较原始菌株FMME-SuAP琥珀酸产量41.7g/L提高36.1％。
实施例4：两阶段发酵FMME-SuAP发酵生产琥珀酸
菌株FMME-SuAP在7.5L发酵罐进行两阶段发酵，发酵55h，琥珀酸产量达到80g/L,但是随着发酵时间的时间的延长，因为菌株FMME-SuAP不能耐受高浓度产物，琥珀酸产量不再增加。
实施例5：两阶段发酵FMME-N-5发酵生产琥珀酸
在7.5L发酵罐中对菌株FMME-N-5的两阶段发酵条件进行优化，具体最优发酵条件为：接种量10％，发酵温度37℃，有氧转厌氧菌体浓度OD600＝55左右，添加10g/L的碳酸氢钠转为厌氧发酵，控制厌氧发酵发酵补料速率维持葡萄糖浓度在10g/L左右，利用碳酸钠控制发酵pH＝6.5，发酵24h，添加渗透压保护剂甜菜碱6g/L，在此条件下，发酵96h，琥珀酸产量为105.2g/L，得率为0.92g/g葡萄糖；且菌株耐受琥珀酸产物抑制的能力增强，适用于工业化生产。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一株产琥珀酸的大肠杆菌，其特征在于，命名为大肠杆菌 (Escherichia coli)FMME-N-5，于2020年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:M 2020454。
2.权利要求1所述的大肠杆菌在发酵生产琥珀酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是采用所述大肠杆菌在发酵培养基中进行有氧-厌氧两阶段发酵，得到含有琥珀酸的发酵液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖30-50g/L，玉米浆15-25 g/L，(NH4)2SO4 2-4 g/L，K2HPO4 1.2-2.0 g/L，KH2PO4 0.5-1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.5 g/L，NaCl 1-2 g/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的有氧-厌氧两阶段发酵是在菌体OD600=52-60时，将有氧阶段转为厌氧阶段。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将有氧阶段转为厌氧阶段是通过通入CO2气体或者添加10-20 g/L碳酸氢盐的方式进行。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在厌氧阶段，控制葡萄糖浓度为5-15 g/L。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的有氧-厌氧两阶段发酵的接种量，按体积百分比计，为6-12%；发酵温度为35-38℃。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的有氧-厌氧两阶段发酵的发酵时间为50-96 h。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在厌氧阶段，添加pH中和剂，所述pH中和剂为Na2CO3、K2CO3、NaOH、KOH、CaCO3、碱式碳酸镁中的一种或几种混合；在有氧-厌氧两阶段发酵48h后，添加渗透压保护剂，所述渗透压保护剂为脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甜菜碱中的一种或几种混合。
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Title
Production of succinic acid by bacterial fermentation;Hyohak Song et al.;《Enzyme and Microbial Technology》;20061231;第352-361页，第357页右栏第二段和第358页左栏第1段 *
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