CN102286415A

CN102286415A - 琥珀酸高产菌株及其应用

Info

Publication number: CN102286415A
Application number: CN 201110264353
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 刘娇; 郑平; 孙村民
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2011-09-07
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-09-07
Also published as: CN102286415B

Abstract

本发明涉及一种琥珀酸高产菌株及其应用，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poxB和pepc基因的活性；再对基因敲除的菌株进行紫外诱变，用以葡萄糖为唯一碳源的培养基进行筛选，从而获得的能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源、厌氧发酵生产琥珀酸的工程菌株。本发明以产琥珀酸大肠杆菌为出发菌株，通过理性设计获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基中厌氧发酵，只产生琥珀酸而没有其它副产物的工程菌。再通过非理性的紫外诱变和生长筛选相结合的代谢进化，获得产琥珀酸的突变株。本发明的菌株在琥珀酸发酵中基本没有其它杂酸产生，可明显降低琥珀酸的生产成本。

Description

琥珀酸高产菌株及其应用

技术领域

本发明属于工业菌筛选及应用技术领域，具体涉及琥珀酸高产菌株的筛选及其应用，即利用基因工程方法，同时结合代谢工程改造和传统诱变技术获得高产菌株，并将筛选到的大肠杆菌用于琥珀酸的发酵生产。

背景技术

琥珀酸又称丁二酸，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料等行业，也可以作为C4平台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMD)、2-吡咯烷酮等，还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸(PBS)和聚酰胺(过程工程学报(2007)4，840-846)。目前琥珀酸的市场需求量高达2.7×10⁷t/a(Appl Microbiol Biotechnol2007，76，727-740)。传统上，琥珀酸是使用化学法合成；但因为石油价格的持续上涨，微生物发酵法生产琥珀酸的研究越来越引起人们的兴趣。目前的生物法生产的琥珀酸成本在0.55-1.1$/Kg，完全可以与化学路线竞争。因此很多大公司都积极投入研发力量，进行生物法琥珀酸的生产和应用开发，如日本的Mitsubishi Chemical和荷兰的帝斯曼DSM等。

在众多的琥珀酸生产菌中，目前研究最多的是Actinobacillus succinogenes，Mannheimia succiniciproducens，Anaerobiospirillum succiniciproducens和大肠杆菌(Appl Microbiol Biotechnol 2007，76，727-740)。大肠杆菌(Escherichia coli)是兼性厌氧菌，在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要的发酵产物有乳酸、乙酸、乙醇、甲酸、琥珀酸等，但琥珀酸的产量很低，但是大肠杆菌由于遗传背景清楚，遗传操作工具丰富，很多研究组对其进行代谢工程改造用于生产琥珀酸。

目前在工程菌上已开展了一些工作，包括通过降低乳酸脱氢酶活性来减少副产物乳酸的生成(JP11-206385A)，使用乙酰磷酸转移酶(pta)和乳酸脱氢酶(ldh)缺陷的大肠杆菌生产琥珀酸(WO 99/06532)。在大肠杆菌突变株AFP111(ptsG，pflAB，ldhA)中过量表达外源丙酮酸羧化酶(pyc)，在复合培养基中好氧厌氧两步法生产琥珀酸，产量达99.2g/L，生产速率为1.30g/L/h，副产物乙酸为9.7g/L，乙醇为4.7g/L。(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology(2002)28，325-332)。大肠杆菌突变株SBS550MG(adhE，ldhA，iclR，ack-pta)和SBS990MG(adhE，ldhA，ack-pta)过量表达外源丙酮酸羧化酶，在复合培养基中好氧生长的菌体离心重悬至OD值为10，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率分别达到1.6和1.5mol/mol，乙酸副产物分别为0.13和0.26mol/mol，甲酸副产物分别为0.08和0.09mol/mol。SBS550MG过表达外源pyc，在LB培养基中补充葡萄糖，接种量OD值为17，厌氧发酵约95小时，琥珀酸产量约为40g/L，甲酸副产物约 2.5g/L(CN1202930A)。大肠杆菌突变株KJ32(ldhA，ackA，adhE，focA，pflB，mgsA)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵120小时，琥珀酸产量733mM，主要有乙酸副产物250mM；KJ73(ldhA，ackA，adhE，focA，pflB，mgsA，poxB)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵96h，琥珀酸产量668mM，主要有乙酸副产物183mM(US20100184171)。因此，已有的工程菌都存在大量的副产物，副产物的存在，不仅降低了碳的有效转化效率，并且大幅增加分离提取工艺的复杂度、废水废液量，造成琥珀酸整体生产成本居高不下，妨碍生物法琥珀酸的工业化进程。因此，如何筛选出既能保持琥珀酸产量，又能有效减少副产物的发酵菌株就成为目前研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供琥珀酸高产菌株及其应用，即通过理性设计与非理性诱变相结合获得能够有效减少副产物的琥珀酸生产菌，并利用该菌株生产琥珀酸，以弥补现有技术的不足。

本发明的方法首先通过基因敲除的手段获得adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB、pepc功能缺失的产琥珀酸的大肠杆菌，然后再对基因敲除的大肠杆菌进行非理性诱变获得产琥珀酸量更高、副产物更少的菌株，并将筛选出的菌株用于发酵生产琥珀酸。

本发明的一个方面是通过理性设计来构建一种生产琥珀酸的大肠杆菌，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poXB、pepc基因的活性。

上述的大肠杆菌为SLEcS14大肠埃希氏菌菌株(Escherichia coli)，已于2011年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC No.5107

本发明的另一方面是对去除或降低adhE、ackA、pta、foca、pflB、iclR、ldhA，poXB、pepc基因活性的产琥珀酸的大肠杆菌进行紫外诱变，再用以葡萄糖为唯一碳源的培养基筛选，获得能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵高产琥珀酸的工程菌株。

上述获得的工程菌株SLEcS15大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2011年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院，其保藏编号为：CGMCC No.5108。

对SLEcS15再次诱变筛选获得了生长速度更快的工程菌株SLEcS16大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其保藏编号为：CGMCC No.5109。

本发明所构建筛选的菌株用于琥珀酸的生产。

本发明的又一个目的是提供一种发酵方法，即通过厌氧发酵或两阶段发酵来提高琥珀酸的产量，减少副产物的量。

本发明以产琥珀酸的大肠杆菌为出发菌株，通过理性设计敲除乳酸、甲酸、乙酸、乙醇的产生途径、乙醛酸途径的阻遏调控基因，并敲除没有能量优势的大肠杆菌主要C4回补酶pep等9个基因，包括有adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB、pepc基因，从而获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基中厌氧发酵，只产生琥珀酸而没有其它副产物的工程菌。再通过非理性的紫外诱变和生长筛选相结合的代谢进化，获得产琥珀酸的SLEcS16突变株。该突变株在以葡萄糖为碳源的全合成培养基中只有非常少量的乙酸和乳酸产生，没有乙醇和甲酸产生，琥珀酸比副产物为56∶1。本发明利用理性设计与非理性进化相结合获得优良的产琥珀酸突变株，并且可用全合成培养基，几乎没有通常琥珀酸发酵中的其它杂酸产生，对于琥珀酸生产的下游的分离提取有显著帮助，可明显降低琥珀酸的生产成本。

附图说明

图1：大肠杆菌产琥珀酸体系的设计和构建示意图，其中列出了9个基因在代谢途径中所处的位置。

具体实施方式

本发明首先通过代谢途径分析，确定来敲除乳酸、甲酸、乙酸、乙醇代谢途径和乙醛酸途径的阻遏调控基因，并敲除没有能量优势的大肠杆菌主要C4回补酶pep等9个基因，包括adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB、pepc，从而获得理论上以葡萄糖为唯一碳源，在基本培养基上厌氧发酵时只产生琥珀酸，而没有其它副产物的工程菌。

9个基因敲除的突变体构建是通过pDS132自杀质粒的无痕敲除系统(Plasmid(2004)51，246-255)获得，通过特定引物扩增目标敲除基因的两个旁侧同源臂，通过SacI和XbaI克隆至pDS132质粒，再发生两次同源重组以敲除目标基因。pDS132具有氯霉素抗性、sacB反向筛选标记用于筛选发生两次重组的转化菌株。

通过基因组和代谢途径分析，理性敲除以上9个基因获得的突变菌株只能在丰富培养基中通过好养厌氧两阶段发酵产琥珀酸，但具有以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵产生琥珀酸的潜力，所以通过传统紫外诱变和在厌氧瓶中以葡萄糖为唯一碳源基本培养基筛选相结合的菌株进化模式，对敲除以上9个基因获得的突变菌株再次诱变筛选，从而获得能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源厌氧发酵高产琥珀酸的工程菌株。

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1：理性设计获得用于琥珀酸生产的工程菌株

采用pDS132无痕敲除系统依次敲除大肠杆菌MG1655中的以下9个基因：adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB、pepc。

参照pDS132无痕敲除系统的文献进行操作，每个基因的敲除、筛选的方法和步骤都是一样的。具体操作如下：

对于adhE基因的敲除，首先分别用序列为SEQ ID NO：1的引物1(adhE-1)和序列为SEQ ID NO：2(adhE-2)的引物2；序列为SEQ ID NO：3的引物3(adhE-3)与序列为SEQ ID NO：4的引物4(adhE-4)从大肠杆菌MG1655的基因组DNA中分别扩增两个约为1kb的同源臂，然后通过引物1和引物4，以左右同源臂为模板，通过融合PCR融合获得约为2kb的融合片段，将2kb的融合片段通过SacI和XbaI位点克隆至pDS132质粒；将带有融合片段的pDS132质粒转化MG1655，再通过Cm抗性筛选在一个同源臂上发生同源交换的转化子，转化子用引物1和4的PCR来验证时既有野生型条带又有突变体条带；然后将所得正确的转化子在不含Cm抗生素的LB培养基中过夜培养，利用sacB基因在10％蔗糖无NaCl的LB平板上筛选突变体，最后在通过1和4引物验证为只有突变体条带的突变体，即得adhE基因敲除的菌株。

对于iclR基因的敲除：首先分别用序列为SEQ ID NO：5的引物iclR-1和序列为SEQ ID NO：6的引物iclR-2；序列为SEQ ID NO：7的引物iclR-3与序列为SEQ ID NO：8的引物iclR-4从大肠杆菌MG1655的基因组DNA中分别扩增左右同源臂，然后通过引物iclR-1和引物iclR-4，以左右同源臂为模板，通过融合PCR融合获得融合片段，将融合片段通过限制性内切酶SacI和XbaI位点克隆至pDS132质粒；将带有融合片段的pDS132质粒转化至已敲出了adhE基因的MG1655菌株中，再通过Cm抗性筛选在一个同源臂上发生同源交换的转化子，转化子用引物iclR-1和引物iclR-4的PCR来验证时既有野生型条带又有突变体条带；然后将所得正确的转化子在不含Cm抗生素的LB培养基中过夜培养，利用sacB基因在10％蔗糖无NaCl的LB平板上筛选突变体，最后在通过iclR-1和引物iclR-4验证为只有突变体条带的突变体，即得adhE+iclR基因敲除的菌株。

对于ackA、pta、focA、pflB、ldhA、poxB和pepc基因，按照iclR基因的敲除方法依次敲除，其中由于ackA和pta，及focA和pflB是紧挨着的，所以是同时敲除的，所用到的引物列于表1中，其中标号1和2的引物用于扩增一侧的同源臂，标号3和4的用于扩增另一侧的同源臂。

经过上述的基因敲除操作，最后将大肠杆菌MG1655的9个基因：adhE、 ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA、poxB和pepc的功能完全去除，得到了SLEcS14菌株。SLEcS14菌株在丰富培养基上好养生长良好，可以通过好养生长厌氧发酵产生琥珀酸，并且没有副产物。

SLEcS14菌株在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上好养和厌氧都无法生长，是因为破坏了野生型大肠杆菌C4回补的主要途径，阻断了厌氧条件NADH的主要去路、ATP的主要合成途径以及乙酰辅酶A的来源。

琥珀酸生产如果采用丰富培养基，会增加原料成本和下游分离提取的成本，所以获得能够在基本培养基利用葡萄糖高产琥珀酸并且极少产生副产物的菌种非常必要。

本发明方法所用的起始菌株可以选用任一种产琥珀酸的大肠杆菌，按上述的步骤进行敲除和筛选，从而获得去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poXB、pepc基因活性的产琥珀酸的大肠杆菌。

实施例2：非理性诱变筛选得到高产琥珀酸突变株

通过基因组分析和代谢途径分析，SLEcS14突变株具有自身再突变调整同时提高菌体生长和合成琥珀酸能力的潜力，本发明采用紫外诱变结合培养条件筛选琥珀酸高产菌。

SLEcS14菌株作为诱变的起始菌株，在LB液体培养基(10g/L tryptone，5g/L yeast extract，5g/L NaCl)中37℃培养得到对数中期菌液，将菌液离心后，沉淀用生理盐水洗两次后，再用LB液体培养基调整OD550为0.3，选择致死率在70-80％照射时间为诱变照射时间，然后将诱变后的菌液转入100ml厌氧瓶装有20ml含2％葡萄糖的NBS基本培养基培养，避光，37℃，200rpm培养，检测生长和有机酸产量。将获得的有生长的菌液多次传代，然后不断重复诱变并增加装液量至50ml，80ml，在80ml体系经多次传代后分离纯化获得了SLEcS15菌株。SLEcS15菌株在100ml厌氧瓶装80ml含2％葡萄糖的NBS基本培养基9天生长OD550为0.9左右水平，产琥珀酸约6.6g/L。

再以SLEcS15菌株作为出发菌株，通过紫外诱变获得了一株突变株SLEcS16，在100ml厌氧瓶装80ml含5％葡萄糖的NBS基本培养基发酵96h，OD550为1.2左右水平，产琥珀酸约8.2g/L。

本发明中的菌株代号如SLEcS14、SLEcS15、16是为了方便描述，但不应理解为对其的限定。

实施例3：SLEcS16突变株厌氧发酵

由于在厌氧瓶中发酵产酸的pH没有很好的控制，影响了菌体生长和琥珀酸产量。在5L发酵罐上装液3L密封发酵，培养基为NBS，温度37℃，200rpm，流加1.2MKOH和2.6MK₂CO₃碱液控制pH7.0。发酵结果如下表，琥珀酸发酵过程在188h结束时，产琥珀酸19.62g/L，几乎没有副产物，只有非常少量的乙酸和乳酸产生，没有乙醇和甲酸产生，琥珀酸比副产物为15.45∶1。

发酵时间(h)	OD₅₅₀	琥珀酸(g/L)	乳酸(g/L)	乙酸(g/L)
					0	0.15	0.12	0.00	0.00
24	0.52	0.56	0.00	0.04
					48	0.82	1.66	0.06	0.09
72	1.27	3.80	0.23	0.16
					96	1.50	6.38	0.33	0.27
120	1.77	9.30	0.32	0.39
					158	2.12	15.62	0.51	0.62
188	2.23	19.62	0.46	0.81

有机酸分析方法如下：采用日本岛津高效液相色谱仪，岛津SPD-20A紫外检测器，BioRad公司Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，流动相2.75mM H2SO4、流速0.6mL/min、柱温50℃。其中用到的标准品如琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸均购自Sigma公司钠盐标准品。而发酵液的处理步骤如下：取1ml发酵液，80℃水浴10min，13000rpm离心10min，去除菌体和发酵液中的蛋白，取上清用流动相进行适当稀释，0.22μm微孔膜过滤后测定发酵液中有机酸生成情况。

葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。

为了获得更好的发酵效果，本发明对发酵的条件进行了改进，从而获得更高的琥珀酸产量，并进一步减少副产物的量。

实施例4：SLEcS16突变株两阶段发酵

SLEcS16：突变株两阶段发酵实验，培养基在原有NBS基础上补加1倍微量元素及6g/l NH₄Cl，起始50g/L的葡萄糖，发酵过程间歇式补加葡萄糖。

好氧生长阶段，通气量1.5vvm、溶氧控制为30％，当菌体生长至对数生长中期时(此时为14.5h，OD550为10.24)，停止通气，按照8.4g/l的量向发酵液中加入NaHCO₃溶液，并用HCl调pH至7.0，封闭进气口和尾气出口；

发酵体系进入厌氧生产阶段。整个厌氧产酸过程温度为37℃，转速为200rpm，自动流加(1M KOH+2.6M K₂CO₃)溶液调节pH在7.0。71h结束发酵，其发酵过程菌体生长及产酸结果如下表所示，最终琥珀酸产量达到39.76g/l，副产物非常少，只有0.32g/L乳酸和0.39g/L乙酸，没有甲酸和乙醇产生，琥珀酸比副产物为56∶1。

从上表可以看出，本发明筛选出的SLEcS16是一株琥珀酸高产菌株，同时显著的降低了其它代谢副产物的量，具有极好的应用前景。

Claims

1.一种生产琥珀酸的大肠杆菌，所述的大肠杆菌被修饰以去除或降低adhE、ackA、pta、focA、pflB、iclR、ldhA，poXB和pepc基因的活性。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌，其保藏编号为：CGMCC No.5107。

3.一种生产琥珀酸的大肠杆菌，其特征在于所述的大肠杆菌是对权利要求1或2所述的大肠杆菌进行紫外诱变，再用以葡萄糖为唯一碳源的培养基进行筛选，从而获得的能够在基本培养基上以葡萄糖为唯一碳源、厌氧发酵生产琥珀酸的工程菌株。

4.如权利要求3所述的大肠杆菌，其保藏编号为：CGMCC No.5108。

5.权利要求4所述的大肠杆菌进行紫外诱变获得的菌株，其保藏编号为：CGMCC No.5109。

6.权利要求5所述的菌株用于生产琥珀酸。

7.如权利要求6所述的生产琥珀酸，其特征在于所述的生产琥珀酸是通过厌氧发酵实现。

8.如权利要求6所述的生产琥珀酸，其特征在于所述的琥珀酸的生产是通过好氧厌氧两阶段发酵来提高琥珀酸的产量。