CN102174455B - 生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在出发大肠杆菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性和抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌I。在此基础上，进行一系列基因工程操作，构建得到重组大肠杆菌II、重组大肠杆菌III、重组大肠杆菌IV，即得到基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018。将基因工程菌经传代驯化得到基因工程菌菌株XZT124。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株XZT124在厌氧条件下，利用无机盐培养基，发酵94g/L的糖质原料可生产84g/L的丁二酸，适合工业化生产丁二酸。
Description
技术领域
本发明涉及生产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
丁二酸是一种优秀的平台化合物，在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途。丁二酸被美国能源部列为未来12种最有价值的平台化合物之一，其可以衍生出很多下游产品，如1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。丁二酸和1，4-丁二醇聚合得到的PBS(聚丁二酸丁二醇酯)是一种性能优良的生物全降解塑料。丁二酸未来的市场潜力每年将超过270万吨。大约有250种可以用苯为原料生产的化工产品都可以通过丁二酸为原料生产。一旦实现了丁二酸的大规模生产，就可以部分取代石油化工产品苯。
目前丁二酸的生产主要是基于顺酐为原料的石油化工路线。石油价格近年来波动很大，这严重制约了丁二酸生产的可持续性和价格稳定。另一方面，化学合成法工艺复杂且常需高温高压，这大大增加了生产所需的能耗物耗；同时化学合成还会造成严重的环境污染。
传统的工业生物技术产业已经发生或正在发生技术上和结构上的重大调整，已向微生物细胞工厂和高效生物催化为核心的生物炼制技术方向发展，传统的生物工艺逐渐地被高效、低能耗和污染小的绿色新工艺、新技术所取代。开发丁二酸的高效生物合成技术能从根本上解决石油化工路线的弊端：保证丁二酸价格稳定不受制于石油价格波动，降低PBS塑料的制造成本，促进其进一步的推广应用；实现绿色可持续生产、简化生产工艺、节能减排、减少环境污染。另外，丁二酸的生物制造过程中还可以吸收二氧化碳，对实现低碳经济具有很好的促进作用。
目前丁二酸发酵菌种主要有两大类。第一类是天然产丁二酸菌，主要有产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)、产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产丁二酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)。另一类是通过代谢工程改造的工程菌，主要是大肠杆菌。
天然产丁二酸菌在糖发酵过程中能够积累高浓度的丁二酸。产丁二酸能力最强的天然菌是放线杆菌。美国Michigan Biotechnology Institute的Guttler等人分离得到的产丁二酸放线杆菌130Z菌株，利用98.3g/L的葡萄糖发酵84小时可生产66.4g/L的丁二酸。Gutttler等人在此基础上，筛选出对单氟乙酸有很好抗性的突变菌，降低了副产物乙酸和甲酸的含量，进一步提高了丁二酸在发酵产物中的比例。在最适条件下，该突变菌株的丁二酸产量可以达到80～110g/L，发酵时间48h，糖转化率达0.9g/g(Guettler et al.，1996，US Patent 5573931)。
产丁二酸厌氧螺菌(ATCC 29305)是从小猎犬的口腔中分离得到的一种革兰氏阴性严格厌氧菌，以葡萄糖乳糖为碳源发酵主产物为丁二酸和乙酸，同时生成少量的甲酸、乙醇和乳酸。在最优条件下(pH6.2，高浓度CO2)，丁二酸的产量可以达到35g/L。Glassner等人以ATCC29035为出发菌株，筛选出对单氟乙酸有很好抗性的突变菌ATCC 53488。在最优发酵条件下丁二酸的产量可以超过50g/L，糖转化率达0.9g/g(Glassner and Datta，1992，US Patent5143834)。
天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸，但其自有很多缺陷。发酵过程中，糖酸转化率最多只有0.9g/g(理论最高值为1.12g/g)，有相当一部分碳源流入到其他有机酸的合成。另外， 天然产丁二酸菌发酵过程中需要丰富培养基，提高了生产成本和下游分离纯化成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁二酸，但由于其生理遗传背景都很清晰，易于改造，因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌种，将其改造成高产丁二酸的工程菌。
美国能源部Argonne国家实验室最早开始了改造大肠杆菌生产丁二酸的工作。通过敲除丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶，构建了菌株NZN111。该菌株不能以葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。在此基础上筛选出能够重新利用葡萄糖为碳源发酵生长的突变菌株AFP111。Vemuri等人通过在AFP111中高表达Rhizobium etli丙酮酸羧化酶基因，进一步提高了丁二酸的产量。在两步法培养(即先有氧培养，然后无氧发酵产酸)条件下，丁二酸的最终浓度可达到99.2g/L，糖酸转化率为1.1g/g(Vemuri et al.，2002，J Ind MicrobiolBiotechnol，28：325-332)。
美国Rice大学San研究组在改造大肠杆菌生产丁二酸方面做了大量的研究。通过敲除adhE、ldhA、ack-pta、iclR基因，构建出的工程菌SBS550MG在厌氧条件下可以生产40g/L的丁二酸，糖酸转化率达到1.06g/g(San et al.，2005，PCT/US2005/033408)。
上述的两个研究组改造大肠杆菌生产丁二酸的工作，虽然构建出的工程菌能生产高浓度的丁二酸，但仍有一些缺陷。发酵过程采用的是两步发酵，即先采用好氧过程将细胞培养生产起来，再转变为厌氧过程进行发酵。这种工艺操作复杂，而且好氧工艺会很大程度上提高设备的建设和运行成本，因此在工业化大规模生产时可行性不高。另一方面，这些工程菌都需要使用丰富培养基，这将极大地提高发酵的原料成本。
发明内容
本发明的一个目的是提供大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZT124。
本发明所提供的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZT124，其保藏号为CGMCC No.4512。
本发明的另一个目的是提供一种基因工程菌的构建方法。
本发明所提供的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
在出发大肠杆菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性和抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(phosphoenolpyruvate：sugar phosphotransferase)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌I。
所述方法还包括以下步骤：
在所述重组大肠杆菌I中提高半乳糖MFS转运蛋白(galactose MFS transporter)的活性和提高二羧酸Dcu转运蛋白(dicarboxylate Dcu transporter)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌II。
所述方法还包括以下步骤：
在所述重组大肠杆菌II中抑制丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌III。
所述方法还包括以下步骤：
在所述重组大肠杆菌III中提高苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的活性和提高丙酮酸脱氢酶的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌IV。
所述提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性是向出发大肠杆菌中导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶编码基因；所述导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶编码基因的方法包括如下步骤：向 所述出发大肠杆菌中导入序列表中序列3所示DNA，得到中间重组大肠杆菌i；所述序列表中序列3所示DNA与所述出发大肠杆菌中的乙醇脱氢酶编码基因发生同源重组；
所述抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的活性是使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶编码基因的功能丧失；所述使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶编码基因的功能丧失的方法包括如下步骤：向所述中间重组大肠杆菌i中导入序列表中序列4所示DNA，得到重组大肠杆菌I；所述序列表中序列4所示DNA与所述中间重组大肠杆菌i中的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I编码基因发生同源重组；
所述提高半乳糖MFS转运蛋白的活性是在重组大肠杆菌I的半乳糖MFS转运蛋白编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列；所述在半乳糖MFS转运蛋白编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列的方法包括如下步骤：向所述重组大肠杆菌I中导入序列表中序列5所示DNA，得到中间重组大肠杆菌ii；所述序列表中序列5所示DNA与所述重组大肠杆菌I中的半乳糖MFS转运蛋白编码基因的启动子发生同源重组；
所述提高二羧酸Dcu转运蛋白的活性是在中间重组大肠杆菌ii的二羧酸Dcu转运蛋白编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列；所述在二羧酸Dcu转运蛋白编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列的方法包括如下步骤：向所述中间重组大肠杆菌ii中导入序列表中序列6所示DNA，得到重组大肠杆菌II；所述序列表中序列6所示DNA与所述中间重组大肠杆菌ii中的二羧酸Dcu转运蛋白编码基因的启动子发生同源重组；
所述抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性是使所述丙酮酸甲酸裂解酶编码基因的功能丧失；所述使所述丙酮酸甲酸裂解酶编码基因的功能丧失的方法包括如下步骤：向所述重组大肠杆菌II中导入序列表中序列7所示DNA，得到中间重组大肠杆菌iii；所述序列表中序列7所示DNA与所述重组大肠杆菌II中的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因发生同源重组；
所述抑制乳酸脱氢酶的活性是使所述乳酸脱氢酶编码基因的功能丧失；所述使所述乳酸脱氢酶编码基因的功能丧失的方法包括如下步骤：向所述中间重组大肠杆菌iii中导入序列表中序列8所示DNA，得到中间重组大肠杆菌iv；所述序列表中序列8所示DNA与所述中间重组大肠杆菌iii中的乳酸脱氢酶编码基因发生同源重组；
所述抑制磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶的活性是使所述乙酰转移酶和乙酸激酶编码基因的功能丧失；所述使所述乙酰转移酶和乙酸激酶编码基因的功能丧失的方法包括如下步骤：向所述中间重组大肠杆菌iv中导入序列表中序列9所示DNA，得到重组大肠杆菌III；所述序列表中序列9所示DNA与所述中间重组大肠杆菌iv中的磷酸乙酰转移酶编码基因和乙酸激酶编码基因发生同源重组；
所述提高苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的活性是在重组大肠杆菌III的苹果酸合成酶编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列；所述在苹果酸合成酶编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列的方法包括如下步骤：向所述重组大肠杆菌III中导入序列表中序列10所示DNA，得到中间重组大肠杆菌v；所述序列表中序列10所示DNA与所述重组大肠杆菌III中的苹果酸合成酶编码基因的启动子发生同源重组；
所述提高丙酮酸脱氢酶的活性是在中间重组大肠杆菌v的丙酮酸脱氢酶编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列；所述在丙酮酸脱氢酶编码基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的启动子序列的方法包括如下步骤：向所述中间重组大肠杆菌 v中导入序列表中序列11所示DNA，得到重组大肠杆菌IV；所述序列表中序列11所示DNA与所述中间重组大肠杆菌v中的丙酮酸脱氢酶E1编码基因的启动子发生同源重组；
所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶编码基因为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I编码基因；
所述二羧酸Dcu转运蛋白为二羧酸Dcu转运蛋白C；
所述出发大肠杆菌为大肠杆菌K-12MG1655。
由所述方法构建得到的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。
所述大肠埃希氏菌XZT124或所述重组大肠杆菌在生产丁二酸中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的又一个目的是提供一种生产丁二酸的方法。
本发明所提供的生产丁二酸的方法，包括以下步骤：发酵所述大肠埃希氏菌XZT124或所述重组大肠杆菌，得到丁二酸。
所述发酵的温度为25℃-39℃或25℃或37℃或39℃；
所述发酵的体系的pH值为6.0-8.0或6.0或7.0或8.0；
所述发酵的时间为48小时-96小时或48小时或72小时或96小时；
所述发酵的接种量的体积百分比为0.01％-10％或0.01％或0.3％或10％；
所述发酵的培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖、碳酸盐、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O，ZnCl2、Na2MoO4·2H2O和MnCl2·4H2O2；水；
以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L、碳酸盐1g/L-20g/L或1g/L或7.9g/L或8.4g/L或10g/L或20g/L、NH4H2PO40.5g/L-5g/L或0.5g/L或1g/L或5g/L、(NH4)2HPO41g/L-10g/L或1g/L或3g/L或10g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L和CaCl2·2H2O 0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 0.2μg/L-5μg/L或0.2μg/L或1.5μg/L或5μg/L、CoCl2·6H2O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、CuCl2·2H2O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、ZnCl20.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、Na2MoO4·2H2O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L和MnCl2·4H2O20.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.2μg/L或5μg/L；
所述碳酸盐为KHCO3、NaHCO3或NH4HCO3。
本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株XZT124在厌氧条件下，利用无机盐培养基，发酵94g/L的糖质原料可生产84g/L的丁二酸，适合工业化生产丁二酸。
附图说明
图1为含有不同盐离子的培养基对HX018菌株生产丁二酸的影响。
图2为连续传代培养工程菌HX018不同发酵时间的OD550值和丁二酸浓度。
图3为大肠杆菌基因工程菌XZT124不同发酵时间的OD550值、丁二酸浓度和葡萄糖浓度。
图4为丁二酸标准品和基因工程菌发酵液的HPLC分析图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、大肠杆菌基因工程菌HX004的构建
大肠杆菌基因工程菌HX004的构建分为以下两个步骤：
(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因的整合
采用基因全合成的方法获得序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，其包括一个人工启动子片段、一个非翻译区片段、一个密码子经过优化的产丁二酸厌氧螺菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段和一个转录终止区片段。基因整合采用两次同源重组的方法，共有以下六步：
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655(公众可从天津工业生物技术研究所获得，记载过大肠杆菌K-12MG1655的非专利文献是Blattner et al.，1997，The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12 Science，277：1453-1462.)基因组DNA为模板，使用引物adhE-up/adhE-down，扩增大肠杆菌K-12MG1655的乙醇脱氢酶基因(adhE)。引物序列为：
adhE-up：CATGCTAATGTAGCCACCAAA，
adhE-down：TTGCACCACCATCCAGATAA。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)0.5ul、蒸馏水33.5ul，总体积为50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增产物包含乙醇脱氢酶基因及其上下游各400个左右碱基，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为：1ul PCR扩增产物、1ul pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50ul Transl-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了乙醇脱氢酶基因及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ020。
第二步，以pXZ020质粒DNA为模板，使用引物adhE-1/adhE-2扩增出一段DNA片段，引物序列为：
adhE-1：TCCGGCTAAAGCTGAGAAAA，
adhE-2：GTGCGTTAAGTTCAGCGACA。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)0.5ul、蒸馏水33.5ul，总体积为50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。PCR扩增产物包含pEASY-Blunt载体和乙醇脱氢酶编码基因上下游的400个左右碱基。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。pBM001质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)经过PacI 酶切(购自NewEngland Biolabs公司)，Klenow酶(购自NewEngland Biolabs公司)补平粘末端，琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(2901bp)。连接体系为10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的Km-sacB DNA片段，2ul 10XT4 ligation buffer(NEB公司)，1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul。室温连接2小时，取5ul加入50ul Transl-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了Km-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ021。
第四步，以pXZ021质粒DNA为模板，使用引物adhE-up/adhE-down扩增出DNA片段I，扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)1ul、蒸馏水33.5ul，总体积为50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟40秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。DNA片段I包含乙醇脱氢酶编码基因上游400个左右碱基、Km-sacB DNA片段、乙醇脱氢酶编码基因下游400个左右碱基。将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒(公众可从天津工业生物技术研究所获得，记载过pKD46质粒的非专利文献是Datsenko，KA.，and B.L.Wanner.2000.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA 97：6640-6645.)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌K-12MG1655，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌K-12MG1655。电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌K-12MG1655的电转化感受态细胞；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，37℃孵育2小时，去除pKD46质粒。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物adhE-up/adhE-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3700bp左右的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为HX001。
第五步，将序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段连接至第二步的PCR扩增产物。序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段由博尚生物技术有限公司合成。以合成的DNA片段为模板，使用引物pck-1/pck-2扩增出pck基因片段，引物序列为：
pck-1：TTAATTAACTAGT TTATCTCTGGCGGTG TTGAC，
pck-2：TTAATTAAAGAAACGCAAAAAGGCCATC。
连接体系为10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的pck基因片段，2ul 10XT4ligation buffer(NEB公司)，1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul。室温连接2小时，取5ul加入50ul Transl-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果在上述第二步的 PCR扩增产物上连接了序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ022PCK。
第六步，以pXZ022PCK质粒DNA为模板，使用引物adhE-up/adhE-down扩增出DNA片段II，DNA片段II的核苷酸序列如序列表中序列3所示。DNA片段II包含乙醇脱氢酶编码基因上游400个左右碱基、序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段和乙醇脱氢酶编码基因下游400个左右碱基。DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至HX001，然后将DNA片段II电转至带有pKD46质粒的HX001，电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的HX001的电转化感受态细胞；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，37℃孵育4小时，去除pKD46质粒。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物adhE-up/adhE-down进行验证，正确的菌落扩增产物为2860bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为HX002。
(2)敲除HX002的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因
基因敲除的方法和上述步骤(1)的基因整合类似，也采用两步同源重组的方法。
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物ptsI-up/ptsI-down，扩增大肠杆菌K-12MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因ptsI。引物序列为：
ptsI-up：CGCATTATGTTCCCGATGAT，
ptsI-down：GCCTTTCAGTTCAACGGTGT。
扩增体系与步骤(1)中第一步相同。扩增产物为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因ptsI，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与步骤(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因ptsI，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ008。
第二步，以pXZ008质粒DNA为模板，用引物ptsI-1/ptsI-2进行PCR扩增，得到pXZ008质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
ptsI-1：CGGCCCAATTTACTGCTTAG，
ptsI-2：ATCCCCAGCAACAGAAGTGT。
扩增体系和扩增条件与步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。连接方法与步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ009。
第四步，以pXZ009质粒DNA为模板，用引物ptsI-up/ptsI-down进行PCR扩增，得到pXZ009质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与步骤(1)的第四步相同。将pXZ009质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ009的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX002，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX003。
第五步，将第二步得到的pXZ008质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，自连得到的质 粒用于第二次同源重组。具体步骤如下：将第二步的PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(EasyPure PCR Purification Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃反应30分钟；加入1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5ul连接产物加入50ul Transl-T1感受态细胞中，冰浴20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒pXZ010。
第六步，以pXZ010质粒DNA为模板，用引物ptsI-up/ptsI-down进行PCR扩增，得到pXZ010质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。扩增体系和扩增条件与步骤(1)的第四步相同。将pXZ010质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ010质粒的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX003，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物ptsI-up/ptsI-down进行验证，正确的菌落扩增产物为727bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为HX004，得到菌株HX004。
实施例2、大肠杆菌基因工程菌HX008的构建
大肠杆菌基因工程菌HX008的构建包括以下两个步骤：
(1)在菌株HX004的半乳糖MFS转运蛋白基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的人工强启动子AP1
启动子替换的方法和基因整合类似，也采用两次同源重组的方法。
第一步，以大肠杆菌K-12 MG1655基因组DNA为模板，用引物galP-P-up/galP-P-down进行PCR扩增，扩增得到半乳糖MFS转运蛋白基因起始密码子上下游各300个左右核苷酸的DNA片段。引物序列为：
galP-P-up：ATCTGCTGCACCCGATCTAC，
galP-P-down：GAACCGGCAACAAACAAAAT。
扩增体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。并将该PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1步骤(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了半乳糖MFS转运蛋白基因起始密码子上下游各300个左右核苷酸的DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ011。
第二步，以pXZ011质粒DNA为模板，用引物galP-P-1/galP-P-2进行PCR扩增，得到pXZ011质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
galP-P-1：ATGCCTGACGCTAAAAAACAGGG；
galP-P-2：GATTAAACGCTGTTATCTGCAA。
扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ012。
第四步，以pXZ012质粒DNA为模板，用引物galP-P-up/galP-P-down进行PCR扩增， 得到pXZ012质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第四步相同。将pXZ012质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ012的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX004，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX005。
第五步，将序列表中序列2所示的DNA片段连接至第二步得到的pXZ011质粒的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ013AP1。
第六步，以pXZ013AP1质粒DNA为模板，用引物galP-P-up/galP-P-down进行PCR扩增，得到pXZ013AP1质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第四步相同。将pXZ013AP1质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ013AP1的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX005，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物galP-P-up/galP-P-down进行验证，正确的菌落扩增产物为1051bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX006，得到菌株HX006。
(2)在HX006的二羧酸Dcu转运蛋白C基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的人工强启动子AP1
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物dcuC-P-up/dcuC-P-down进行PCR扩增，扩增得到二羧酸Dcu转运蛋白C基因起始密码子上下游各400个左右核苷酸的DNA片段。引物序列为：
dcuC-P-up：TGACAAAATGCAATCAAGGAA，
dcuC-P-down：GAGACATCAGACAGGCGACA。
扩增体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。并将该PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1步骤(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了二羧酸Dcu转运蛋白C基因起始密码子上下游各400个左右核苷酸的DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ065。
第二步，以pXZ065质粒DNA为模板，用引物dcuC-P-1/dcuC-P-2进行PCR扩增，得到pXZ065质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
dcuC-P-1：ATGCTGACATTCATTGAGCTCCTTA，
dcuC-P-2：AATTTTTCCTGTCTCCAGGCCCCAA。
扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ066。
第四步，以pXZ066质粒DNA为模板，用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow进行PCR扩增，得到pXZ066质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第四步相同。将pXZ066质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ066质粒的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX006，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX007。
第五步，将序列表中序列2所示的DNA片段连接至第二步得到的pXZ065质粒的DNA 扩增片段上，得到质粒pXZ067AP1。
第六步，以pXZ067AP1质粒DNA为模板，用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow进行PCR扩增，得到pXZ067AP1质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。扩增体系和扩增条件与实施例1步骤(1)的第四步相同。将pXZ067AP1质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ067AP1的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX007，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow进行验证，正确的菌落扩增产物为1147bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX008，得到菌株HX008。
实施例3、大肠杆菌基因工程菌HX014的构建
大肠杆菌基因工程菌HX014的构建包括以下三个步骤：
(1)在菌株HX008中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物pflB-up/pflB-down，扩增大肠杆菌K-12MG1655的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB。引物序列为：
pflB-up：TGTCCGAGCTTAATGAAAAGTT；
pflB-down：CGAGTAATAACGTCCTGCTGCT。
扩增体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。扩增产物为丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ014。
第二步，以pXZ014质粒DNA为模板，用引物pflB-1/pflB-2进行PCR扩增，得到pXZ014质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
pflB-1：AAACGGGTAACACCCCAGAC；
pflB-2：CGGAGTGTAAACGTCGAACA。
扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1中步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ015。
第四步，以pXZ015质粒DNA为模板，用引物pflB-up/pflB-down进行PCR扩增，得到pXZ015质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ015质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ015的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX008，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX009。
第五步，将第二步得到的pXZ014质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组。具体方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同，得到质粒pXZ016。
第六步，以pXZ016质粒DNA为模板，用引物pflB-up/pflB-down进行PCR扩增，得到pXZ016质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ016质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ016质粒的DNA扩增片段电 转至带有pKD46质粒的菌株HX009，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物pflB-up/pflB-down进行验证，正确的菌落扩增产物为879bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX010，得到菌株HX010。
(2)在菌株HX010中敲除乳酸脱氢酶基因ldhA
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物ldhA-up/ldhA-down，扩增大肠杆菌K-12MG1655的乳酸脱氢酶基因ldhA。引物序列为：
ldhA-up：GATAACGGAGATCGGGAATG；
ldhA-down：CTTTGGCTGTCAGTTCACCA。
扩增体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。扩增产物为乳酸脱氢酶基因ldhA，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了乳酸脱氢酶基因ldhA，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ001。
第二步，以pXZ001质粒DNA为模板，用引物ldhA-1/ldhA-2进行PCR扩增，得到pXZ001质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
ldhA-1：TCTGGAAAAAGGCGAAACCT；
ldhA-2：TTTGTGCTATAAACGGCGAGT。
扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1中步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ002。
第四步，以pXZ002质粒DNA为模板，用引物ldhA-up/ldhA-down进行PCR扩增，得到pXZ002质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ002质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ002的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX010，去除pKD46质粒后，筛选氯霉素抗性的菌落，得到菌株HX011。
第五步，将第二步得到的pXZ001质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组。具体方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同，得到质粒pXZ003。
第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物ldhA-up/ldhA-down进行PCR扩增，得到pXZ003质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ003质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ003质粒的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX011，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物ldhA-up/ldhA-down进行验证，正确的菌落扩增产物为829bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX012，得到菌株HX012。
(3)在菌株HX012中敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物ackA-up/pta-down，扩增大肠杆菌K-12MG1655的磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA。引物序列为：
ackA-up：CGGGACAACGTTCAAAACAT；
pta-down：ATTGCCCATCTTCTTGTTGG。
扩增体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。扩增产物为磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1步骤(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ023。
第二步，以pXZ023质粒DNA为模板，用引物ackA-1/pta-2进行PCR扩增，得到pXZ023质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
ackA-1：AACTACCGCAGTTCAGAACCA；
pta-2：TCTGAACACCGGTAACACCA。
扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1中步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ024。
第四步，以pXZ024质粒DNA为模板，用引物ackA-up/pta-down进行PCR扩增，得到pXZ024质粒的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ024质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ024的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX012，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX013。
第五步，将第二步得到的pXZ023质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组。具体方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同，得到质粒pXZ025。
第六步，以pXZ025质粒DNA为模板，用引物ackA-up/pta-down进行PCR扩增，得到pXZ025质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ025质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ025质粒的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX013，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物ackA-up/pta-down进行验证，正确的菌落扩增产物为808bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX014，得菌株HX014。
实施例4、大肠杆菌基因工程菌HX018的构建
大肠杆菌基因工程菌HX018的构建包括以下两个步骤：
(1)在菌株HX014的苹果酸合成酶基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的人工强启动子AP1
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物aceB-P-up/aceB-P-down进行PCR扩增，扩增得到苹果酸合成酶基因起始密码子上下游各300个左右核苷酸的DNA片段。引物序列为：
aceB-P-up：ATTCTGGCAGAGACGGAAGA；
aceB-P-down：TCGAAATCGGCCATAAAGAC。
扩增体系与实施例1中步骤(1)中第一步相同。并将该PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1中步骤(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了苹果酸合成酶基因起始密码子上下游各300个左右核苷酸的DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ026。
第二步，以pXZ026质粒DNA为模板，用引物aceB-P-1/aceB-P-2进行PCR扩增，得到pXZ026质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
aceB-P-1：TTAATCCAGC GTTGGATTCA；
aceB-P-2：ATGACTGAACAGGCAACAAC。
扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1中步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ027。
第四步，以质粒pXZ027质粒DNA为模板，用引物aceB-P-up/aceB-P-down进行PCR扩增，得到质粒pXZ027的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ027的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ027的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX014，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX015。
第五步，将序列表中序列2所示的DNA片段连接至第二步得到的pXZ026质粒的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ028AP1。
第六步，以pXZ028AP1质粒DNA为模板，用引物aceB-P-up/aceB-P-down进行PCR扩增，得到pXZ028AP1质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列10所示。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ028AP1质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ028AP1的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX015，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物aceB-P-up/aceB-P-down进行验证，正确的菌落扩增产物为1037bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX016，得到菌株HX016。
(2)在菌株HX016的丙酮酸脱氢酶E1基因的起始密码子前加入序列表中序列2所示的人工强启动子AP1
第一步，以大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA为模板，用引物aceE-P-up/aceE-P-down进行PCR扩增，扩增得到丙酮酸脱氢酶E1基因起始密码子上下游各400个左右核苷酸的DNA片段。引物序列为：
aceE-P-up：CAGAATGTCCGCCAGAACTT；
aceE-P-down：GTGCACGGAAGAAGTGGTTA。
扩增体系与实施例1中步骤(1)中第一步相同。并将该PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系与实施例1中步骤(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了丙酮酸脱氢酶E1基因 起始密码子上下游各400个左右核苷酸的DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ017。
第二步，以pXZ017质粒DNA为模板，用引物aceE-P-1/aceE-P-2进行PCR扩增，得到pXZ017质粒的DNA扩增片段，引物序列如下：
aceE-P-1：ATGTCAGAACGTTTCCCAAATG；
aceE-P-2：GGGTTATTCCTTATCTATC。
扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第二步相同。
第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，连接方法与实施例1中步骤(1)的第三步相同，得到质粒pXZ018。
第四步，以pXZ018质粒DNA为模板，用引物aceE-P-up/aceE-P-down进行PCR扩增，得到质粒pXZ018的DNA扩增片段。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ018的DNA扩增片段用于第一次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将质粒pXZ018的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX016，去除pKD46质粒后，筛选卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX017。
第五步，将序列表中序列2所示的DNA片段连接至第二步得到的pXZ017质粒的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ019AP1。
第六步，以pXZ019AP1质粒DNA为模板，用引物aceE-P-up/aceE-P-down进行PCR扩增，得到pXZ019AP1质粒的DNA扩增片段，其核苷酸序列如序列表中序列11所示。扩增体系和扩增条件与实施例1中步骤(1)的第四步相同。将pXZ019AP1质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组，方法与实施例1中步骤(1)的第六步相同。将质粒pXZ019AP1的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株HX017，去除pKD46质粒后，筛选在蔗糖中能生长的菌落，筛选方法与实施例1步骤(1)的第六步相同。经过PCR验证(使用引物aceE-P-up/aceE-P-down进行验证，正确的菌落扩增产物为1154bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株HX018，得到菌株HX018。
实施例5、用基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018生产丁二酸
方法I
种子培养基和发酵培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖，KHCO3，NH4H2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO4·7H2O和CaCl22H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O，CoCl2·6H2O，CuCl2·2H2O，ZnCl2，Na2MoO4·2H2O，MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述种子培养基和发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖100g/L，KHCO310g/L，NH4H2PO41g/L，(NH4)2HPO43g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L，CoCl2·6H2O 0.1μg/L，CuCl2·2H2O 0.1μg/L，ZnCl20.1μg/L，Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L，MnCl2·4H2O2 0.2μg/L。
以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生产丁二酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后分别将基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018按照1％(V/V)的接种量接种于种子培养基，在pH值为7.0、37℃和100rpm的条件下培养18小时得到种子液，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min。分别将步骤(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018的种子液按照0.3％(V/V)的接种量接种于发酵培养基，在pH值为7.0(采用K2CO3和KOH控制pH值，发酵过程中的pH值保持在7.0)、37℃和150rpm的条件下培养72小时，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱。丁二酸标准品购自Sigma公司，产品目录号为S3674-100G。
丁二酸标准品的图谱如图4中A所示；丁二酸标准品的保留时间为14.18min。发酵液中的组分的分析图谱如图4中B所示；发酵液中丁二酸的保留时间为14.12min。
结果：大肠杆菌基因工程菌HX004发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为24g/L，丁二酸的产率为0.5g/g，丁二酸生产速率为0.33g/L·h，甲酸浓度为6.5g/L，乳酸浓度为1g/L，乙酸浓度为10.2g/L。
大肠杆菌基因工程菌HX008发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为35g/L，相比HX004提高了46％；丁二酸的产率为0.65g/g，相比HX004提高了30％；丁二酸生产速率为0.48g/L·h，相比HX004提高了46％；甲酸浓度为4.4g/L，相比HX004降低了32％；乳酸浓度为1.2g/L，相比HX004提高了20％；乙酸浓度为9.6g/L，相比HX004降低了6％。
大肠杆菌基因工程菌HX014发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为27g/L，相比HX008降低了23％；丁二酸的产率为0.80g/g，相比HX008提高了23％；丁二酸生产速率为0.38g/L·h，相比HX008降低了23％；乙酸浓度为1g/L，相比HX008降低了90％；未检测到甲酸和乳酸。
大肠杆菌基因工程菌HX018发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为23g/L，相比HX008降低了34％；丁二酸的产率为0.84g/g，相比HX008提高了29％；丁二酸生产速率为0.64g/L·h，相比HX008提高了34％；未检测到甲酸、乳酸和乙酸。
方法II
种子培养基和发酵培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖，KHCO3，NH4H2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO4·7H2O和CaCl22H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O，CoCl2·6H2O，CuCl2·2H2O，ZnCl2，Na2MoO4·2H2O，MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述种子培养基和发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖50g/L，KHCO31g/L，NH4H2PO40.5g/L，(NH4)2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，CaCl2·2H2O 1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 0.2μg/L，CoCl2·6H2O 0.05μg/L，CuCl2·2H2O 0.05μg/L，ZnCl20.05μg/L，Na2MoO4·2H2O 0.05μg/L，MnCl2·4H2O20.05μg/L。
以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生产丁二酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：与方法I相同。
(2)发酵培养：500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min。分别将步骤(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018的种子液按照0.01％(V/V)的接种量接种于发酵培养基，在pH值为6.0(采用K2CO3和KOH控制pH值，发酵过程中的pH保持6.0)、25℃和150rpm的条件下培养48小时，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。
分析方法：与方法I相同。
结果：与方法I无显著差异。
方法III
种子培养基和发酵培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖，KHCO3，NH4H2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO4·7H2O和CaCl22H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O，CoCl2·6H2O，CuCl2·2H2O，ZnCl2，Na2MoO4·2H2O，MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述种子培养基和发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖150g/L，KHCO320g/L，NH4H2PO45g/L，(NH4)2HPO410g/L，MgSO4·7H2O5g/L，CaCl2·2H2O 5g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 5μg/L，CoCl2·6H2O 5μg/L，CuCl2·2H2O 5μg/L，ZnCl2 5μg/L，Na2MoO4·2H2O 5μg/L，MnCl2·4H2O2 5μg/L。
以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生产丁二酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：与方法I相同。
(2)发酵培养：500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min。分别将步骤(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018的种子液按照10％(V/V)的接种量接种于发酵培养基，在pH值为8.0(采用K2CO3和KOH控制pH值，发酵过程中的pH值保持8.0)、39℃和150rpm的条件下培养96小时，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。
分析方法：与方法I相同。
结果：与方法I无显著差异。
实施例6、对比含有不同盐离子的培养基对HX018菌株生产丁二酸的影响
使用三种不同的种子培养基和发酵培养基，第一种种子培养基和发酵培养基所用碳酸盐为KHCO3，KHCO3在种子培养基和发酵培养基中的浓度为10g/L。第二种种子培养基和发酵培养基所用碳酸盐为NaHCO3，NaHCO3在种子培养基和发酵培养基中的浓度为8.4g/L。第三种种子培养基和发酵培养基所用碳酸盐为NH4HCO3，NH4HCO3在种子培养基和发酵培养基中的浓度7.9g/L。此三种种子培养基和发酵培养基的其余组成成分和各组成成分的浓度均与实施例5中的方法I相同。
以HX018菌株生产丁二酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：与实施例5中的方法I相同。
(2)发酵培养：除以下方法外，其余方法均与实施例5中的方法I相同。对于第一种发酵培养基，发酵过程采用K2CO3和KOH控制pH。对于第二种发酵培养基，发酵过程采用Na2CO3和NaOH控制pH。对于第三种发酵培养基，发酵过程采用(NH4)2CO3和NH4OH控制pH。
分析方法：与方法I相同。
结果：大肠杆菌基因工程菌HX018使用第一种钾盐培养基，发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为23g/L，丁二酸的产率为0.84g/g，丁二酸生产速率为0.32g/L·h。基因工程菌HX018使用第二种纳盐培养基，发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为8.7g/L，丁二酸的产率为0.81g/g，丁二酸生产速率为0.12g/L·h。HX018使用第三种铵盐培养基，发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为7.5g/L，丁二酸的产率为0.79g/g，丁二酸生产速率为0.10g/L·h(图1)。从结果可见，种子培养基和发酵培养基所用碳酸盐为KHCO3时，发酵液中丁二酸浓度和丁二酸的产率最高；种子培养基和发酵培养基所用碳酸盐为NH4HCO3时，发酵液中丁二酸浓度和丁二酸的产 率最低。
实施例7、构建大肠杆菌基因工程菌XZT124
500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min，冷却后接入菌株HX018，接种量为0.3％(V/V)，发酵温度为37℃，搅拌转速为150rpm。发酵过程采用(NH4)2CO3和NH4OH控制pH值在7.0。在发酵罐中连续传代培养工程菌，每24h将发酵罐中的菌液按1∶1000的比例转接到一个新的发酵罐中。经过250代传代驯化，得到菌株XZT124(图2)。
发酵培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖，NH4HCO3，NH4H2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO4·7H2O和CaCl22H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O，CoCl2·6H2O，CuCl2·2H2O，ZnCl2，Na2MoO4·2H2O，MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖94g/L，NH4HCO3 7.9g/L，NH4H2PO4 1g/L，(NH4)2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L，CoCl2·6H2O 0.1μg/L，CuCl2·2H2O 0.1μg/L，ZnCl2 0.1μg/L，Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L，MnCl2·4H2O2 0.2μg/L。
该大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZT124已于2010年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4512。
实施例8、用基因工程菌XZT124生产丁二酸
种子培养基和发酵培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖，NH4HCO3，NH4H2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO4·7H2O和CaCl22H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O，CoCl2·6H2O，CuCl2·2H2O，ZnCl2，Na2MoO4·2H2O，MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述种子培养基和发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖94g/L，NH4HCO3 7.9g/L，NH4H2PO4 1g/L，(NH4)2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L，CoCl2·6H2O 0.1μg/L，CuCl2·2H2O 0.1μg/L，ZnCl2 0.1μg/L，Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L，MnCl2·4H2O2 0.2μg/L。
以XZT124菌株生产丁二酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：与实施例5中的方法I相同。
(2)发酵培养：除发酵的时间为96小时以外，其余方法均与与实施例5中的方法I相同。
分析方法：与实施例5中的方法I相同。
结果：大肠杆菌基因工程菌XZT124发酵72h后，发酵液中丁二酸浓度为62g/L，丁二酸的产率为0.87g/g，相比HX004、HX008、HX014和HX018的丁二酸的产率均有所提高；丁二酸的生产速率为0.86g/L·h，相比HX004、HX008、HX014和HX018的丁二酸的生产速率均有所提高；发酵96h后，发酵液中丁二酸浓度为84g/L，残糖含量低于0.5g/L，丁二酸的产率为0.90g/g，丁二酸生产速率为0.88g/L·h(图3)。
Claims (4)
1.大肠埃希氏菌（Escherichia coli）XZT124，其保藏号为CGMCC No.4512。
2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌在生产丁二酸中的应用。
3.一种生产丁二酸的方法，包括以下步骤：发酵权利要求1所述的大肠埃希氏菌，得到丁二酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述发酵的温度为25℃-39℃；
所述发酵的体系的pH值为6.0-8.0；
所述发酵的时间为48小时-96小时；
所述发酵的接种量的体积百分比为0.01%-10%；
所述发酵的培养基由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖、碳酸盐、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O，ZnCl2、Na2MoO4·2H2O和MnCl2·4H2O；
水；
以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L、碳酸盐1g/L-20g/L、NH4H2PO40.5g/L-5g/L、(NH4)2HPO41g/L-10g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L-5g/L和CaCl2·2H2O 0.1g/L-5g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 0.2μg/L-5μg/L、CoCl2·6H2O 0.05μg/L-5μg/L、CuCl2·2H2O 0.05μg/L-5μg/L、ZnCl2 0.05μg/L-5μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05μg/L-5μg/L和MnCl2·4H2O 0.05μg/L-5μg/L；
所述碳酸盐为KHCO3、NaHCO3或NH4HCO3。
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