CN102286387A - 一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用，属于发酵工程领域。本发明通过游离表达的方式，将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)过量表达于丙酮酸生产菌T.glabrata的尿嘧啶(Ura)缺陷型T.glabrataΔura3中，获得了重组菌株T.glabrata FMME045。所述菌株用于发酵生产富马酸，发酵60h后，发酵液中富马酸产量比出发菌株增加了6倍，达到35mg/L，这为采用微生物发酵法生产富马酸提供了一条新的途径，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。通过在丙酮酸生产菌T.glabrata的尿嘧啶(Ura)缺陷型T. glabrataΔura3的胞质当中构建一条异源富马酸生产途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了富马酸的积累，属于发酵工程领域。
背景技术
富马酸(Fumaric Acid)又名延胡索酸(Fumarate)或反丁烯二(Trans-Butenedioic Acid)，被认为是以葡萄糖为原料通过生物化学转化的方法来获得的十大构架物质之一。它是生物体TCA循环的重要中间代谢产物，同时也是一种重要的有机化工原料和精细化工产品。由于具有无毒、低腐蚀性等特点，因此被广泛应用于食品、医药、化工、涂料、树脂、增塑剂等领域。
目前，随着石油资源的日渐枯竭，人们对富马酸的需求也日益增加。在国内外，生产富马酸的方法主要有以下三个方面：(1)马来酸酐异构法；(2)以可溶性淀粉和液体石蜡为发酵培养基的主要碳源，皱褶假丝酵母为菌种，发酵生产富马酸；(3)以葡萄糖为主要碳源，少根根霉为菌种，发酵生产富马酸。
虽然发酵法生产富马酸有诸多的优点，但是目前生产富马酸多采用米根霉(Rhizopusoryzae)发酵法，该方法存在一定的缺陷，如菌丝体呈现絮状增加了发酵液的粘度，造成溶氧困难等。T.glabrataΔura3具有强大的丙酮酸生产能力，这为生产下游代谢产物提供了一个广阔的平台。鉴于以上两点，本研究将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)过量表达于丙酮酸生产菌T.glabrataΔura3中，在其胞质当中采用还原TCA的代谢途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了富马酸的积累。
发明内容
本发明的目的是提供一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。利用分子生物学手段，在多重营养缺陷型的丙酮酸生产菌一光滑球拟酵母当中，过量表达来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)，达到积累富马酸的目的。
本发明的技术方案为：
1)从米根霉(Rhizopus oryzae)的基因组当中，调取苹果酸脱氢酶基因(RoMDH，1014bp)
2)利用PCR技术，扩增RoMDH
3)将扩增得到的RoMDH连接pMD18 T-vector
4)将步骤3)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子
5)提取含RoMDH基因的质粒，并对两质粒双酶切、回收、纯化后，再连接已构建完成的游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1
6)将步骤5)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子
7)提取质粒，酶切验证
8)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布Ura缺陷平板
9)验证所述工程菌
10)摇瓶发酵，验证富马酸的生产情况
附图说明
图1：pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH质粒图谱
图2：表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH导入T.glabrataΔura3的菌落PCR验证
M：10kb marker
1：质粒pY26
2：质粒pY26 GPD-RoMDH
3：出发菌株T.glabrataΔura3
4-5：重组菌株T.glabrata FMME045
具体实施方式
实施例1产富马酸的光滑球拟酵母工程菌的构建
1)构建游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH
将已经连入pMD18 T-vector的RoMDH基因，经限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切、回收、纯化，连接已构建完成的游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1(16℃过夜)，进一步构建游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH。
2)将步骤1)连接产物转化
将连接产物转化到JM109感受态细胞中后，涂布带有氨苄抗性的LB平板，经37℃过夜培养。
3)提取质粒酶切验证
挑取转化子提取质粒酶切验证，发现均为阳性克隆，表明游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH已构建成功。
4)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布Ura缺陷平板，长出菌落后传代3次以上。
5)验证所述工程菌
挑取适量转化子接种于选择培养基，培养24h后，提取质粒酶切验证，得到所需重组菌株T.glabrata FMME045。
实施例2利用光滑球拟酵母工程菌生产富马酸
从甘油管中移取200μL光滑球拟酵母工程菌接入种子培养基(20mL/200mL锥形瓶)，于30℃、200r/min条件下摇瓶培养24h后，以10％接种量(v/v)接入发酵培养基。摇瓶发酵：500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为60h。采用高效液相色谱(HPLC)测得：富马酸的产量为35mg/L，是出发菌株的6倍。
Claims (4)
1.一株产富马酸的光滑球拟酵母工程菌，其特征在于将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)和富马酸酶基因(RoFUM1)过量表达于丙酮酸生产菌T.glabrata的尿嘧啶(Ura)缺陷型T.glabrataΔura3中，在其胞质当中构建了一条异源富马酸生产途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了富马酸的积累。
2.权利要求1所述产富马酸工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH的构建；
2)将步骤1)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子；
3)提取质粒pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH，酶切验证；
4)将构建好的游离表达载体pY26 TEF-RoFUM1-GPD-RoMDH采用电转化的方法导入受体菌T.glabrataΔura3中，涂布Ura缺陷平板；
5)验证所述工程菌；
6)摇瓶发酵，采用HPLC测定富马酸的产量。
3.权利要求1所述产富马酸工程菌，在发酵生产富马酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其发酵生产工艺：
1)种子培养：从甘油管中移取200μL光滑球拟酵母工程菌接入种子培养基(20mL/200mL锥形瓶)，于30℃、200r/min条件下摇瓶培养24h；
2)摇瓶发酵：以10％接种量(v/v)接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为60h。
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