CN103602623B - 高产l-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产l-丙氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸的方法。所述菌株为XZ-A26菌株，保藏号为CGMCC No.4036，其具有发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。本发明还涉及该菌株的构建方法及该菌株在制备L-丙氨酸中的应用。本发明通过代谢工程的方法，构建出能发酵生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌CGMCC No.4036，利用该菌株发酵生产L-丙氨酸的产量高达115g/L，适合工业化生产L-丙氨酸。

Description

高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸的方法

本中请是2011年8月17日递交的、名称为“一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用”的中国发明专利申请No.201110235159.8的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株，属大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株于2010年7月26日保藏在位于“北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所”的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.4036。本发明还涉及该菌株的构建方法及该菌株在制备L-丙氨酸中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质量等。L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。

目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。目前国内L-丙氨酸生产厂家均是使用酶催化技术。

微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点：首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。

其次，用微生物发酵法技术代替酶催化技术。酶催化技术需要对菌株进行高密度培养，分泌出生产L-丙氨酸所需的天冬氨酸脱羧酶。该过程对氧气的需求量很大；另外，由于天冬氨酸脱羧酶基因是克隆在质粒上进行高表达的，因此在菌株培养过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传复制。这些因素导致酶催化生产工艺复杂。微生物发酵法生产工艺简单，只需在起始阶段往发酵罐中投加葡萄糖和无机盐，并接入少量的菌种。另外，微生物发酵法和酶催化技术相比，其最终发酵液中杂质少很多，这既可以节约L-丙氨酸的分离提取成本，也可以节约废水处理的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过生物发酵法生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌XZ-A26，该菌株保藏号为CGMCCNo.4036，其具有将糖类原料发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌(如附图1)。

本发明的另一个目的是提供上述菌株的构建方法，其包括下述步骤：

(1)L-丙氨酸脱氢酶基因的整合：将大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶基因ldhA扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A01；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A01的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A02；将质粒pXZ-A02的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A01；将扩增的L-丙氨酸脱氢酶基因连接至质粒pXZ-A01的DNA片段，得到质粒pXZ-A03；然后将质粒pXZ-A03的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A01，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A02；

(2)依次敲除上述所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；

丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除：将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A04；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A05；将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03；将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06；然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A04；

乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除：按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，分别以所得菌株XZ-A04、XZ-A06、XZ-A08和XZ-A10为起始原料，进行乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除，分别得到菌株XZ-A06、XZ-A08、XZ-A10和XZ-A12；

(3)在发酵罐中连续传代培养步骤(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。

对大肠杆菌ATCC8739的代谢网络进行系统分析，设计出高效合成L-丙氨酸的策略。为了使细胞能够积累L-丙氨酸，需要进行三个方面的改造(如附图1)：首先，需要引入L-丙氨酸脱氢酶基因。L-丙氨酸脱氢酶能够将丙酮酸转化为L-丙氨酸，同时消耗一个NADH。其次，需要敲除丙酮酸竞争途径基因。由于丙酮酸在大肠杆菌中是一个关键的中间代谢节点，因此需要将丙酮酸天然代谢途径失活，从而使代谢流全部转入L-丙氨酸的合成。这些竞争途径包括乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因。第三，需要敲除L-丙氨酸降解途径基因。L-丙氨酸在大肠杆菌中能够被丙氨酸消旋酶转化为D-丙氨酸，这会大大降低L-丙氨酸的手性纯度。因此需要敲除丙氨酸消旋酶，避免D-丙氨酸的积累。

L-丙氨酸工程菌株的构建：

根据上述的设计方案，在大肠杆菌ATCC8739的染色体上进行基因的敲除和整合。

首先，将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，得到大肠杆菌XZ-A02。本发明所用到的序列如核苷酸序列表。

通过PCR扩增的方法，从嗜热脂肪地芽孢杆菌的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列1和2)。为了使L-丙氨酸脱氢酶基因能够在工程菌中高效、稳定地表达，将其整合至大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处。基因整合采用两步同源重组的方法(如附图2)。第一步，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，扩增产物包含乳酸脱氢酶编码基因及其上下游各500个碱基，并将其克隆到pEASY-T1克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到质粒pXZ-A01。第二步，以pXZ-A01质粒DNA为模板，使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5和6)扩增出一段DNA片段，扩增产物包含pEASY-T1载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A02。第四步，以pXZ-A02质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA片段I，用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗性的菌落。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A01。第五步，将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA片段II，用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒转化至XZ-A01，然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01，将其转移至含有10％蔗糖的LB液体培养基，培养24小时后在含有6％蔗糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A02。本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒及构建如下表1。

表1：本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒

随后，在XZ-A02中依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因，使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够利用丙酮酸和消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似，也采用两步同源重组的方法。区别在于第五步，若要进行基因敲除，将第二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二步同源重组。在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A04。所用引物为pflB-up/pflB-down(序列7和8)、pflB-1/pflB-2(序列9和10)。在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06。所用引物为adhE-up/adhE-down(序列11和12)、adhE-1/adhE-2(序列13和14)。在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08。所用引物为ackA-up/pta-down(序列15和16)、ackA-1/pta-2(序列17和18)。在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10。所用引物为frdB-up/frdC-down(序列19和20)、frdB-1/frdC-2(序列21和22)。在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除，避免L-丙氨酸被转化为D-丙氨酸，得到菌株XZ-A12。所用引物为dadX-up/dadX-down(序列23和24)、dadX-1/dadX-2(序列25和26)。

L-丙氨酸工程菌株的优化：

L-丙氨酸工程菌XZ-A12的生长和L-丙氨酸生产相耦联(如附图3)。采用代谢进化的方法，在发酵罐中连续传代培养L-丙氨酸工程菌，逐步提高工程菌的生长速度、L-丙氨酸的生产速率和产量。经过300代优化，构建出高产L-丙氨酸的工程菌XZ-A26。

本发明还有一个目的是应用大肠杆菌XZ-A26菌株(该菌株保藏号为CGMCC No.4036菌株)发酵生产L-丙氨酸，其采用厌氧培养条件，培养温度为30-42℃，控制pH在6.5-7.5，在培养基中培养保藏号为CGMCCNo.4036的XZ-A26菌株，分离提取L-丙氨酸。

种子培养基和发酵培养基组成为：糖类原料20-150g/L，氮源1-5g/L，NaH2PO4 1-5g/L，Na2HPO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.3-1g/L，CaCl2 2H2O 0.05-0.1g/L，微量无机盐1-5ml/L，

所述糖类原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖，及木薯、玉米、甜菜、木质纤维素的水解物和糖浆中的一种或多种；

氮源为无机含氮化合物，包括氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种；微量无机盐包括可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或多种。

本发明通过代谢工程的方法，构建出能发酵生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌XZ-A26菌株，其属大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株于2010年7月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，其保藏号为CGMCC No.4036。利用该XZ-A26菌株发酵生产L-丙氨酸的产量高达115g/L，适合工业化生产L-丙氨酸。

附图说明

图1为L-丙氨酸工程菌合成代谢途径；

图2为菌株XZ-A26基因构建方案流程图；

图3为L-丙氨酸工程菌和L-丙氨酸生产的耦联关系图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步的说明，燕不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1

(XZ-A26菌株的构建)

(1)通过PCR扩增的方法，从嗜热脂肪地芽孢杆菌(来源于合肥百迈生物技术有限公司)的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列1/序列2)。扩增体系为：StratagenePfuUltra10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

基因整合采用两次同源重组的方法(如附图2)。第一步，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含乳酸脱氢酶编码基因及其上下游各500个碱基，并将其克隆到pEASY-T1克隆载体(来源于北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为：1ul PCR扩增产物、1ul pEASY-T1克隆载体、3ul蒸馏水，总体积为5ul。轻轻混合、室温反应5分钟后加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200转，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。选取一个正确的质粒，命名为pXZ-A01。第二步，以pXZ-A01质粒DNA为模板，使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5/序列6)扩增出一段DNA片段，扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含pEASY-T1载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。pBM001质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)经过SmaI和SfoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。连接体系为10ng的第二步PCR扩增产物，30ng Km-sacB DNA片段，2ul10XT4 ligationbuffer(NEB公司)，1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive endunits/ml)，补充蒸馏水至20ul。室温连接2小时，取5ul加入50ulTrans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200转，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。选取一个正确的质粒，命名为pXZ-A02。第四步，以pXZ-A02质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增出DNA片段I，扩增体系为：Stratagene PfuUltra10Xbuffer5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸4分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因上游500个碱基、Km-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。电转条件为：首先准备带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，37℃孵育2小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A01。第五步，将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增出DNA片段II。DNA片段II包含乳酸脱氢酶编码基因上游500个碱基、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-A01，然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01，电转条件为：首先准备带有pKD46的XZ-A01的电转化感受态细胞；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，37℃孵育2小时。将其转移至含有10％蔗糖的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A02。

(2)依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因，使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够利用丙酮酸和消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似，也采用两步同源重组的方法(如附图2)。区别在于第五步，若要进行基因敲除，将第二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二步同源重组。具体步骤如下：第二步PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(EasyPure PCR Purification Kit，来源于北京全式金生物技术有限公司)；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃反应30分钟；加入1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，室温反应2小时；取5ul加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司)，冰浴20分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，200转，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。

在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除(操作步骤同上)：将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上，得质粒pXZ-A04；将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ-A05；将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03；将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06；然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A04；其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A05的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A06的DNA扩增引物为：pflB-up/pf1B-down(序列7/序列8)，质粒pXZ-A04的DNA扩增引物为：pflB-1/pflB-2(序列9/序列10)。

在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A06，其中，所用乙醇脱氢酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A08的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A09的DNA扩增引物为：adhE-up/adhE-down(序列11/序列12)，质粒pXZ-A07的DNA扩增引物为：adhE-1/adhE-2(序列13/序列14)。

在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A08。乙酸激酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A11的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A12的DNA扩增引物为：ackA-up/pta-down(序列15/序列16)，质粒pXZ-A10的DNA扩增引物为：ackA-1/pta-2(序列17/序列18)。

在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，得到菌株XZ-A10。富马酸还原酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A14的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A15的DNA扩增引物为：frdB-up/frdC-down(序列19/序列20)，质粒pXZ-A13的DNA扩增引物为：frdB-1/frdC-2(序列21/序列22)。

在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除，方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除，避免L-丙氨酸被转化为D-丙氨酸，得到菌株XZ-A12。丙氨酸消旋酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A17的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A18的DNA扩增引物为：dadX-up/dadX-down(序列23/序列24)，质粒pXZ-A16的DNA扩增引物为：dadX-1/dadX-2(序列25/序列26)。

(3)发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml，121℃灭菌15min，冷却后接入XZ-A12，接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5。在发酵罐中连续传代培养工程菌，每24h将发酵罐中的菌液按1∶1000的比例转接到一个新的发酵罐中。经过300代转接，得到菌株XZ-A26。

实施例2

(以XZ-A12菌株生产L-丙氨酸)

种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，氯化铵5g/L，NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A12，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培养基接种。

3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5，发酵时间为48h。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H糖分析柱。

结果：发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L-丙氨酸为6g/L，乳酸、乙酸、乙醇以及丁二酸含量均低于0.1g/L。

实施例3

(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)

种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A26，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培养基接种。

3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5，发酵时间为48h。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H糖分析柱。

结果：发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L-丙氨酸为95g/L，乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。

实施例4

(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)

种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L，NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O2 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A26，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min，培养18h，用于发酵培养基接种。

3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5，发酵时间为48h。HPLC分析发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量：L-丙氨酸为115g/L，乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸含量均低于0.1g/L。

Claims (13)

1.基因工程菌株CGMCC No.4036在制备L-丙氨酸中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：制备L-丙氨酸的方法为生物发酵法。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物发酵法采用厌氧培养条件，培养温度为30-42℃，控制pH在6.5-7.5，在培养基中培养保藏号为CGMCC No.4036的基因工程菌株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：培养温度为30℃，控制pH在6.5。

5.根据权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于：所述培养基中糖类原料选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木质纤维素及其水解物和糖浆中的一种或多种；氮源为无机含氮化合物；微量无机盐选自可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述无机含氮化合物选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种。

7.根据权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于：所述培养基组成为：糖类原料20-150g/L，氮源1-5g/L，NaH₂PO₄ 1-5g/L，Na₂HPO₄1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3-1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.05-0.1g/L，微量无机盐1-5ml/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述糖类原料选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜和木质纤维素中的一种或多种；所述氮源为无机含氮化合物；所述微量无机盐选自可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述无机含氮化合物选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述培养基组成为：葡萄糖100g/L，氯化铵4g/L，NaH₂PO₄ 5g/L，Na₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH6.5。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述微量无机盐组成为：FeCl₃·6H₂O 1.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.1mg，CuCl₂·2H₂O 0.1mg，ZnCl₂ 0.1mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg，MnCl₂·4H₂O 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L，NaH₂PO₄ 5g/L，Na₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述微量无机盐组成为：FeCl₃·6H₂O 1.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.1mg，CuCl₂·2H₂O 0.1mg，ZnCl₂ 0.1mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg，MnCl₂·4H₂O 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。