CN101665813A - 一种l-丙氨酸的微生物发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L－丙氨酸的微生物发酵生产方法，利用大肠杆菌直接发酵葡萄糖培养基生成L－丙氨酸。种子培养基：葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度30±1℃；发酵培养基：葡萄糖10～20％，玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa。本发明工艺过程简单，控制条件粗放。发酵水平达到90－92g/l，大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及L-丙氨酸的生产方法，具体涉及一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法。
背景技术
L-丙氨酸在医药、食品、化工等行业有着十分广泛的用途。L-丙氨酸在医药上用途是VB6的重要原料，是营养增补剂(补糖氨基酸营养输液)的组成部分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-14氨基酸注射液-800是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒，同时L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。例如生产L-氨基丙醇、VB6、S-2-氯乙酸、安尿通等。
L-丙氨酸一般是利用假单胞菌作为生物催化剂采用固定化或细胞悬液酶解L-天门冬氨酸生产，收率大于90％。
国内现有宁波科瑞生物工程公司、北京怡康盛达生物技术有限公司、安徽省科苑(集团)股份有限公司等多家公司均生产L-丙氨酸产品，产品有食品级和工业级，生产的方法大都是利用假单胞菌产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，将L-天冬氨酸转化成L-丙氨酸。南京工业大学(南京化工大学)开展L-丙氨酸酶法合成的研究较早，利用假单胞菌获得高活性的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸为底物，采用游离细胞法转化生产L-丙氨酸，平均收率为90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准；并拥有酶法生产L-丙氨酸的发明专利，该技术可生产得到光学纯度的L-丙氨酸；同时成立了国家生化工程技术中心，中心拥有年产1000吨L-丙氨酸的生产技术。大连轻工业学院对中空纤维膜反应器，利用假单胞菌转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。中国药科大学也对L-丙氨酸酶法生产技术进行了研究，采用循环式生物反应器，利用固定化德阿昆合假单胞菌体的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。
丙氨酸是细胞蛋白质必不可少的组成成分，多数微生物使用葡萄糖丙酮酸转移酶来合成丙氨酸(Hashimoto and Katsumata，1998)，一些生物体如节杆菌(Hashimoto and Katsumata，1993，1998；1999)、球形芽孢杆菌(Ohashima andSoda，1979)、梭状芽孢杆菌(Orlygssony等，1995)使用NADH-脱氢酶从丙酮酸和氨基酸来生产丙氨酸。
质粒转移基因编码NADH-脱氢酶作为实验手段用于促进合成得到不同程度的成功。基因工程菌株发酵单胞菌mobolis CP4在5％葡萄糖厌氧发酵表达了低水平生产消旋丙氨酸的能力(Uhlenbusch等，1991)。一株ldh-标记的含有丙氨酸消旋酶突变基因工程乳酸菌在相似方法下发酵1.8％葡萄糖产生12.6g/l L-丙氨酸(Hols等，1999)。一株双突变大肠杆菌发酵通过好氧和厌氧2个阶段24小时发酵产生32g/l丙氨酸浓度(Lee等，2004)。随着进一步的筛帅选和过程优化，消旋丙氨酸浓度在更加复杂的反应体系达到88g/l，接近了理论最大值(Smith等，2006)。但是，这种菌株志产生一种消旋丙氨酸，利用多类型质粒需要抗生素的选育，并且需要复杂的介质复杂的多阶段发酵过程(Smith等，2006)。
已有的文献及专利有如下报道：
1、L-丙氨酸酶法工业生产的研究
在800升气升式发酵罐上配有假单胞菌Pse.NX-1，获得高L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活。以L-天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产L-丙氨酸，每升培养液可转化L-天冬氨酸2kg，最高达2.5kg，提取得到L-丙氨酸1.2kg，平均收率90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准。(《工业微生物》1997，27(2)，17-20页)；
2、利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸
通过右边筛选得到一株具有高活性L-Asp-β-脱羧酶的菌株PseudomonasNX-1，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细的研究，该株可以高效地转化L-Asp生成L-Ala，转化4-5d，每L培养液可转化L-Asp量高达1400g左右，生成L-Ala浓度高达90％以上，摩尔转化率近100％。(《南京化工学院学报》1995，17(1)，1-6页)；
3、游离细胞法与固定化细胞法生产L-丙氨酸的比较利用假单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶从L-天冬氨酸为底物生产L-丙氨酸，具有2种方法，一种为游离细胞法，另一种为固定化细胞法。该文比较这2种方法的生产工艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论：采用游离细胞法生产L-丙氨酸优于固定化细胞法。(《工业微生物》1998，28(1)，38-39，44页)；
4、D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备方法(《中国专利》申请(专利)号：02138553.X；公开(公告)号：CN1405317；公开(公告)日：2003.03.26)
该制备方法是培养假单胞菌属微生物，产生高活力的L-天冬氨酸β-脱羧酶，采用游离细胞法，将含酶细胞或培养液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸盐的溶液混合，32℃-45℃下进行酶反应，然后用等电点结晶结合离子交换树脂法分离反应生成物，得到高化学纯度和光学纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
5、中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸
采用中空纤维膜反应器，利用假单胞菌P.dacunhaeDQ-pl转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，最适Ph6.0，最适温度30℃，EDTA和Tween-80对细胞产酶有促进作用，游离细胞半衰期为93h。采用对流扩散式中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。(《食品与发酵工业》2003，29(1)，32-35页)；
6、用循环式生物反应器酶法生产L-丙氨酸
用固定化德阿昆合假单胞(Pseudomonas dacunhae)菌体的L-天冬氨酸β-脱羧酶，在新设计的生物反应器中转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。该反应器能不断缓慢溶解固体L-天冬氨酸，使反应系统的pH和底物浓度维持恒定。用80g固定化菌体为酶源，在69h内能将4.2kgL-天冬氨酸全部转化生成L-丙氨酸，且仅消耗较少的PLP和氨水。(《药物生物技术》1997，4(4)，212-215页)。
7、丙氨酸发酵法有效生产的原料与方法
UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDTION，INC的Xueli Zhang，JantamaKaemwich，Moore Jonathan等人在《丙氨酸有效生产的原料与方法》(国际申请号：PCT/US2008/058410)中利用获得的基因工程菌株进行常规发酵糖生产L-丙氨酸。戊糖例如木糖、己糖例如葡萄糖可以用于有效地发酵生产L-丙氨酸。这里描述的菌株具有代谢各种木质纤维生物质能和各种不同糖分的能力，包括乳糖、麦芽糖和蔗糖。利用大肠杆菌采用一种新颖的生物催化剂，在D-乳酸(周等，2006)产生菌大肠杆菌(菌株SZ194)衍生的基础上，在没有质粒、抗生素和其他复杂营养成份的条件下，通过一批简单的发酵产生纯的手性L-丙氨酸。菌株SZ194自身染色体ldhA基因从热源被简单的完整染色体拷贝的脱氢酶基因取代，经过另外的筛选和代谢处理，菌株利用金属盐培养基通过简单的发酵能够产出较高产质量和高浓度的L-丙氨酸。
由上可知，现有的酶法生产L-丙氨酸的研究及生产报道，一般是利用假单胞菌产生L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，此法生产的产品光学纯度较低，一般≤95％，且生产环节多，成本高。
现有的发酵研究，其菌株只产生一种消旋丙氨酸(旋光度为0)，利用多类型质粒需要抗生素的选育，并且需要复杂的介质复杂的多阶段发酵过程，不适于大规模的国内工业化生产。
现有酶法生产技术，固定化技术还不成熟，游离酶法一般采用L-天门冬氨酸为原料，生产成本很高，现有的生产厂家很多处于停产状态，存活的也在处于微利或亏损状态，如果能够利用单糖如葡萄糖为原料进行规模化生产，将是丙氨酸行业发展的唯一出路。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法，即用微生物直接发酵法生产L-丙氨酸，采用该方法生产的L-丙氨酸，其光学纯度及收率高、生产环节简化，成本低。
本发明为实现其目的所采取的技术方案包括摇瓶种子培养和发酵。本发明利用大肠杆菌以葡萄糖培养基，直接生成L-丙氨酸。
种子培养基和培养条件(质量百分比，以下同)：葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度30±1℃；
发酵培养基：葡萄糖10～20％，玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；
发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa。
技术参数：
①种子培养基和培养条件：葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度30±1℃；用氨水调pH值至7.0。在1000ml三角瓶中分装200ML培养基，接种后用摇床在30±1℃条件下培养18小时。
②发酵培养基：葡萄糖10～20％，玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。
③发酵培养条件：定容后，121℃灭菌15分钟，冷却后将培养好的种子液按1％接种量接种培养，培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa，培养过程测定菌体生长OD值、pH值和酶活力。
④离心条件：
离心温度30℃，离心pH值7.5。
⑤提取条件：
脱色温度85℃。
⑥干燥条件：
干燥温度90℃，干燥时间15分钟。
本发明的有益效果：L-丙氨酸是一种具有光学活性的氨基酸，主要用于生产L-氨基丙醇、(S)-2-二氯乙酸。本发明以葡萄糖为发酵底物，通过菌体自身代谢直接发酵生产L-丙氨酸，L-丙氨酸收率高，光学纯度≥99.99％，满足工业化生产的需求，生产成本在8000元以下。
具体实施方式
本发明先进行无菌培养得到一级种子，再到发酵罐进行扩大培养，然后离心、脱色、过滤、浓缩、结晶、离心、干燥，产品化验合格后入库。
实施例1
配种子液1000ml，种子液配比(质量百分比，以下同)：葡萄糖15％，蛋白胨0.4％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养18h，摇床转速为100r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为葡萄糖15％，玉米浆3％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01％，氯化钠0.2％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa，培养28h。OD值净增长到0.6，pH达到7.5后离心，离心温度30℃，85℃脱色，90℃干燥。得到产品8.9kg，产品纯度≥99.5％.
实施例2
配种子液1000ml，种子液配比(质量百分比，以下同)：葡萄糖20％，蛋白胨0.6％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.02％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养18h，摇床转速为105r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为葡萄糖20％，玉米浆4％，硫酸镁0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.02％，氯化钠0.3％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa，培养28h。OD值净增长到0.6，pH达到7.5后离心，离心温度30℃，85℃脱色，90℃干燥。得到产品9.2kg，产品纯度≥99.5％.
实施例3
配种子液800ml，种子液配比(质量百分比，以下同)：葡萄糖18％，蛋白胨0.5％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.03％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。分装在4只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养18h，摇床转速为100r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为葡萄糖18％，玉米浆4％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.02％，氯化钠0.3％，余量为水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa，培养28h。OD值净增长到0.6，pH达到7.5后离心，离心温度30℃，85℃脱色，90℃干燥。得到产品9.1kg，产品纯度≥99.5％.
本发明的优点如下：
(1)利用一种微生物直接发酵葡萄糖生产L-丙氨酸。
(2)工艺过程简单，控制条件粗放。
(3)产品总生产成本降低40％。
本发明与国内外同类技术主要区别在于：
(1)本技术只需要培养一种微生物直接发酵葡萄糖生产L-丙氨酸。而国内外同类技术大多利用L-天门冬氨酸作为原料。
(2)现有的发酵法研究工艺首先得到的是无旋光性丙氨酸，然后需要进一步消旋处理才能得到L-丙氨酸。
(3)本技术发酵水平能够达到90-92g/l，比其他发酵水平明显提高。
(4)其它：本技术工艺大大降低了生产成本。
Claims (1)
1、一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法，包括利用大肠杆菌直接发酵葡萄糖培养基，其特征在于：
a、种子培养基和培养条件(质量百分比)：葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度30±1℃；
b、发酵培养基：葡萄糖10～20％，玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；
发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100310 |