CN102329897A - 生物发酵中pH值的调控方法 - Google Patents
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Abstract
生物发酵中pH值的调控方法,涉及微生物发酵领域。当发酵液pH值降至5.9时开始添加补氨水,全程控制pH5.7-6.1。本发明的有益效果是:可以使菌体生长及产物分泌可以在最适pH环境下进行,对发酵水平具有促进作用或无影响,同时能消除了钙离子对纳滤膜的影响,可应用膜分离工艺,大大提高了工作效率,使提炼收率提高,提炼生产成本降低,产品质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物发酵领域,具体涉及一种生物发酵中pH值的调控方法。
背景技术
许多生物发酵产品在发酵生产过程中都有将pH值调控在某一范围的工艺要求,菌体才能正常生长代谢和产素分泌。传统的发酵工艺是在发酵培养基中加入碳酸钙来对pH进行控制,这个方法存在着以下两个弊端:一是加入碳酸钙会使得料液中含有较多的钙离子,当放罐到提炼工段进行提炼工作时,易生成硫酸钙等微溶性钙盐,堵塞超滤膜、纳滤膜的膜孔,使得生物发酵产品难以应用膜分离工艺浓缩。只能沿用薄膜浓缩方法来进行浓缩,但仍然存在着硫酸钙等微溶性钙盐结垢堵塞薄膜浓缩器列管,需要经常清洗列管等问题。不仅清洗次数增加、列管使用寿命缩短、工作效率降低,而且料液在薄膜浓缩过程中温度高时间长,对产品有效组份破坏大。造成提炼收率低,提炼生产成本高,产品质量不稳定。二是基础料中加入碳酸钙,虽然能使发酵pH全程控制在6.0左右,发酵过程中不用再去调pH,但不能根据工艺要求来精确与即时调控pH,如工艺要求pH控制在5.8以下或高于6.2时,用碳酸钙无法调控做到。
发明内容
本发明的目的是针对上面所述缺陷,提供一种对生物发酵产品的发酵过程具有促进作用,同时能消除钙离子对膜分离工艺中堵塞膜孔的影响,调控生物发酵中pH值的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种生物发酵中pH值的调节方法,其特征在于:当发酵液pH值降至5.9时开始添加补氨水,全程控制pH 5.7-6.1。
本发明的有益效果是:本发明在发酵产品的发酵生产中用流加补氨水代替碳酸钙工艺,氨水显碱性可以中和菌体新陈代谢所生成的酸性物质,从而达到严格控制pH的目的,使菌体生长及产物分泌可以在最适pH环境下进行,对发酵水平具有促进作用或无影响,能提高赤霉酸A4A7发酵水平6%以上,同时因消除了钙离子对纳滤膜的影响,可应用膜分离工艺代替薄膜浓缩工艺,膜分离与薄膜浓缩相比具有效率高、收率高、生产成本低的优点,可提高后提取工艺收率4%以上,大大提高了工作效率,使提炼收率提高,提炼生产成本降低,产品质量稳定。
附图说明
图1为赤霉酸A4A7试验罐与对照罐——发酵过程中的pH值变化曲线。
图2为赤霉酸A4A7试验罐与对照罐——发酵过程中的氨基氮变化曲线。
图3为赤霉酸A4A7试验罐与对照罐——发酵过程中的残糖变化曲线。
图4为赤霉酸A4A7试验罐与对照罐——发酵过程中的固形物变化曲线。
具体实施方式
下面以赤霉酸A4A7与井冈霉素为例,对本发明做进一步的描述。
(1)材料与方法。
(1.1)材料。
(1.1.1)菌株:藤仓赤霉菌A4A7生产菌株和吸水链霉菌井冈霉素生产菌株。
(1.1.2)培养基。
种子培养基:碳源、有机氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁等。
发酵培养基:碳源、有机氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁等。
(1.1.3)供试试验材料。
碳酸钙:轻质碳酸钙,建德巿云峰碳酸钙有限公司生产。
氨水:25%以上的工业浓氨水,提前抽入贮氨罐内,静置一周后备用。
(1.1.4)发酵罐。
700L不锈钢种子罐,5M3不锈钢发酵罐,20M3发酵罐。
(1.2)方法。
(1.2.1)试验工艺流程。
(1.2.2)氨水的中途流加。
当发酵液pH值降至5.9时开始流加补氨水,全程控制pH5.7-6.1(流补设置pH5.9)。
(1.2.3)检测方法。
1) pH的测定:采用pH探头在线检测与显示。
2) 氨基氮含量的测定——甲醛测定法, 单位为μg/mL。
3)发酵液糖含量的测定——裴林试剂测定法, 单位为g/100mL。
4)固含量(菌丝浓度)的测定——离心沉淀法。3000转/分,离心沉淀10分钟。固含量(%)=沉淀物体积/发酵液体积*100%。
5)赤霉酸A4A7的效价测定——HPLC法。
检测条件:色谱柱:150mm×4.6mm,ODS-C18(5μ);流动相为甲醇+水+甲酸 67+33+0.05(v/v)使用前超声波脱气;流速0.7mL/min;检测波长210nm;进样体积:20μL。
含量计算:将测的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中GA4和GA7的峰面积分别平均,GA4和GA7的效价X1按下式计算。
赤霉酸A4A7的效价X2 = XGA4 + XGA7,单位为μg/mL。
(2)结果与分析。
(2.1)赤霉酸A
4
A
7
发酵流加补氨水在5M
3
罐上试验结果。
(2.1.1)赤霉酸A
4
A
7
发酵流加补氨水在5M
3
罐上发酵过程工艺参数分析结果。
利用中试二个5M3发酵罐,共进行了二批次流加补氨水试验罐与二批次碳酸钙对照罐,对其发酵过程工艺控制的五项生化检测数据见表1。
表1赤霉酸A4A7发酵流加补氨水发酵过程工艺参数比较分析结果。
根据表1试验结果绘制代谢曲线见图1至图4。
从图1可知:赤霉酸A4A7发酵采用流加补氨水调控pH值比用碳酸钙调控更精确更平稳,试验罐pH值控制曲线均在5.7-6.1受控范围内,而对照罐pH值控制曲线起伏程度明显较大;从图2至图4可知:流加补氨水试验罐由于补入了较多的无机氮源(氨水),使氨基氮控制在较高的数值范围内,但对菌丝体不仅不会产生毒害作用,而且对菌丝体的生长还具有促进作用,加大了对碳源的利用,不仅试验罐发酵过程中的总糖与还原糖检测数据均比对照罐低,而且增加了补饴糖的总量,试验罐中后期的固含量(菌丝浓度)也明显高于对照罐。碳源利用的加大,中后期固含量的提高,有利于赤霉酸A4A7发酵生产水平的提高。
从上图1至图4可知:赤霉酸A4A7发酵流加补氨水试验罐与碳酸钙对照罐相比,发酵过程控制的五项生化检测数据除氨基氮明显高于碳酸钙对照罐外,其他四项生化检测控制参数基本保持在相近水平内。证明赤霉酸A4A7发酵采用流加补氨水替代碳酸钙用于赤霉酸A4A7发酵生物发酵调控pH,工艺可行。
(2.1.2)赤霉酸A
4
A
7
发酵流加补氨水在5M
3
罐上发酵单位分析结果。
将上述赤霉酸A4A7发酵二批次的流加补氨试验罐与碳酸钙对照罐,进行发酵放罐水平结果比较见表2。
表2赤霉酸A4A7发酵流加补氨在5M3罐上发酵单位分析结果比较。
从表2的试验数据可以分析:流加补氨水代替碳酸钙调控pH在赤霉酸A4A7发酵过程中有比较明显的促进效果,平均提高了发酵水平11.9%。
(2.2)赤霉酸A
4
A
7
发酵流加补氨水在20 M
3
罐上发酵单位分析结果。
采用流加补氨水在5M3罐上的赤霉酸A4A7发酵工艺,在20M3罐内进行了赤霉酸A4A7发酵生产大罐的穿插对比试验,其中流加补氨水代替碳酸钙共生产试验了7批,仍用碳酸钙调控pH的对照罐7批,试验结果见表3。
表3流加补氨水在20 M3罐上赤霉酸A4A7发酵单位分析结果。
表3结果表明,流加补氨水代替碳酸钙对赤霉酸A4A7发酵调控pH具有明显的促进作用,同期对比,赤霉酸A4A7平均发酵水平提高了6.7%。
(2.3)井冈霉素发酵流加补氨水调控pH值在5M
3
罐上试验结果
利用中试二个5M3发酵罐,共进行了井冈霉素发酵二批次流加补氨水试验罐与二批次碳酸钙对照罐,试验结果如下。
表4流加补氨水在20 M3罐上井冈霉素发酵单位分析结果。
(2.4)井冈霉素发酵流加补氨水在20 M
3
罐上发酵单位分析结果
采用流加补氨水在5M3罐上的井冈霉素发酵工艺,在20M3罐内进行了井冈霉素发酵生产大罐的穿插对比试验,其中流加补氨水代替碳酸钙共生产试验了10批,仍用碳酸钙调控pH的对照罐10批,试验结果见表5。
表5流加补氨水在20 M3罐上井冈霉素发酵单位分析结果。
表5结果表明,流加补氨水代替碳酸钙调控pH对井冈霉素发酵水平无不良影响。
(2.5)流加补氨水发酵对后提取工艺改进的影响。
流加补氨水代替碳酸钙调控发酵pH的最终目的,是为了在后提取过程中能用膜分离工艺代替薄膜浓缩工艺,以达到提高提取收率,降低生产成本,提高产品质量的目的。由于碳酸钙的影响,使得后提取浓缩工艺不能采用膜分离工艺(浓缩过程中不溶性或微溶性钙盐堵塞膜孔),只能采用传统的薄膜浓缩工艺。即使沿用薄膜浓缩工艺,也存在钙盐易结垢堵塞浓缩器列管的现象,导致工作效率低下,料液在薄膜浓缩过程中时间长,不仅耗气增加,提取成本提高,而且对产品有效成分有所影响。
发酵过程用流加补氨水代替碳酸钙后,由于没有钙盐影响,可以采用膜分离工艺。膜分离具有浓缩效率高,成本低,并且由于是在常温下工作,对产品的有效成分没有破坏作用等优点。
(2.5.1)赤霉酸A
4
A
7
试验罐批与对照罐批在提取工艺改进后对提炼收率的影响结果。
表6流加补氨水发酵对提高赤霉酸A4A7收率影响的统计结果。
注:试验罐批采用发酵流加补氨水、提炼膜分离工艺,对照罐批采用发酵加碳酸钙、提炼薄膜浓缩工艺。
由上表可知,赤霉酸A4A7试验罐批采用膜分离工艺比对照罐批采用薄膜浓缩老工艺的收率提高了83.8%-74.8%=9%,母液收率提高了5.9%,总收率提高了4.7%,原药产品赤霉酸A4A7含量提高了1.9%,达到92.7%,远高于出口产品赤霉酸A4A7含量≥90.0%的企业标准效果非常显著。
(2.5.2)井冈霉素试验罐批与对照罐批在提取工艺改进后对提炼收率的影响结果。
表7流加补氨水发酵对提高井冈霉素收率影响的统计结果。
注:试验罐批采用发酵流加补氨水、提炼膜分离工艺,对照罐批采用发酵加碳酸钙、提炼薄膜浓缩工艺。
由上表可知:井冈霉素试验罐批采用膜分离工艺总收率提高了6.2%,效果比较显著。另外,在生产上需要做高浓度井冈霉素水剂时(10%和20%水剂),由于薄膜浓缩只能蒸发水分,往往最后导致高浓度水剂沉淀物超标,造成产品质量不合格。而膜分离具有除盐效果,能在浓缩过程中除去料液中约25%的无机盐,这可以有效提高我们高浓度水剂的产品质量,提高产品合格率。
(3)结论。
本发明针对生物发酵产品的生产工艺,通过流加补氨水代替碳酸钙用于生物发酵调控pH,我们得出以下几点结论:一是氨水对赤霉酸A4A7发酵菌体生长及产物分泌具有促进作用,对井冈霉素发酵无不良影响;二是通过补氨水可以严格控制pH,使得菌体生长及产物分泌可以在最适pH环境下进行;三是因消除了钙离子对膜分离的影响,可应用膜分离工艺代替薄膜浓缩工艺,且膜分离与薄膜浓缩相比具有效率高、收率高、生产成本低等优点。
Claims (1)
1. 一种生物发酵中pH值的调控方法,其特征在于:当发酵液pH值降至5.9时开始流加补氨水,全程控制pH 5.7-6.1。
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