CN103305417A - 进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产量反应器及其生产方法和应用，该高产量反应器包括：生物反应器，与该生物反应器连接的ATF灌流设备；利用高产量反应器进行蛋白的生产方法，包括：1)将生物反应器与ATF灌流设备连接，完成离线灭菌或在位灭菌程序；2)将种子细胞按照密度接种生物反应器至工作体积，每24小时取样检测细胞数与生化指标；3)当活细胞密度增长至一定密度，启动ATF设备程序进入灌流培养；4)收集生物反应器内或从ATF灌流设备中的中空纤维柱滤出的培养液，纯化，得到所需蛋白产品。本发明极大地缩短单抗或融合蛋白表达的工艺开发时间，降低生产成本，利于项目的注册申报、缩短项目周期，加快生物制药行业的成果应用速度。

Description

进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白(包括单抗或类单抗蛋白)生产的高产量反应器，特别是涉及一种进行蛋白生产的全新式高产量反应器及其生产方法和应用。

背景技术

现阶段，国内外生物制药行业使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白，主要采用大规模的批式流加培养方式。

其中，哺乳动物细胞的批式流加作为常规方法，在研发上需要长时间的工艺摸索与大量的条件验证与重复，在cGMP(Current Good Manufacture Practices)生产上往往需要经过反复验证的、体积巨大的细胞培养设备与复杂的配套系统。即传统的哺乳动物细胞批式流加培养有一些难以克服的缺点，如最高细胞生长密度不高、单批次蛋白表达量偏低、细胞有害代谢产物无法排除、工艺控制复杂等等。

然而，哺乳动物细胞的灌流培养一直是重要的备选技术解决方案，但该技术在控制上的复杂性一直是制约其广泛应用的瓶颈。因此，长时间以来，灌流培养一般只用于不稳定，容易降解或聚合的蛋白产品。

普通的细胞截留方法，液体流动方向与截留膜表面垂直，容易造成截留膜表面沉积大量细胞，容易堵塞并对细胞生长造成不利影响。使用中空纤维柱、采用切向流的方式对细胞进行截留可以有效避免上述情况(如图1所示)。而常规使用的中空纤维柱规格为1mm直径、0.2μm孔径，但在截留了细胞的同时，却无法截留目的蛋白。

因此，目前即使使用ATF灌流设备(美国Refine Technology公司)作为技术模块，在产业化方面仍然存在一些显著问题，比如极高的培养基使用量和细胞偏向于生长而不是蛋白表达等问题，即便使用可抛弃型的生产设备，受限于较低的单批次蛋白产量，仍需付出高额的时间以及资金成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用。本发明通过配合使用ATF灌流设备，采用全程灌流培养或灌流培养与批式流加培养相结合的方式，迅速提高最高细胞生长密度，提高单细胞表达量，进而加快蛋白生产工艺研发进程。

为解决上述技术问题，本发明的进行蛋白(包括：单抗、类单抗蛋白)生产的高产量反应器，包括：生物反应器，与该生物反应器连接的ATF灌流设备；其中，该生物反应器，包括：能与ATF灌流设备对接配合使用的常规生物反应器或可抛弃型生物反应器。

所述生物反应器，包括：2L～25L的小试规模生物反应器，30～1000L的中试及生产规模生物反应器；其中，该生物反应器的组成包括：加液泵，与该加液泵关联控制的液面控制器。

所述ATF灌流设备中的中空纤维柱优选0.2μm孔径的中空纤维柱或截留孔径为50kDa的中空纤维柱。

另外，本发明的利用高产量反应器进行蛋白的生产方法，包括步骤：

(1)将生物反应器与对应型号的ATF灌流设备连接，完成离线灭菌或在位灭菌程序；

(2)使用生长培养基，将种子细胞按照0.3×10⁶～1×10⁶ cells/mL的密度接种生物反应器至工作体积，控制温度、pH、溶解氧浓度、罐压，每24小时取样检测细胞数与生化指标；

其中，该生化指标，包括：pH、O₂溶解分压、CO₂溶解分压、谷氨酰胺含量、谷氨酸含量、葡萄糖含量、乳酸含量、NH₄ ⁺水平、Na⁺水平、K⁺水平、Ca⁺水平、渗透压等；

(3)当活细胞密度增长至3×10⁶～4×10⁶ cells/mL的密度时，启动ATF设备程序进入灌流培养；

(4)收集生物反应器内或从ATF灌流设备中的中空纤维柱滤出的培养液，纯化，得到所需蛋白产品(包括：单抗及类单抗蛋白)。

所述步骤(2)中，控制温度为36～37℃、pH为pH 6.8～7.2、溶解氧浓度为40％～60％、罐压为2～8psi。

所述步骤(3)中，初期生长培养基交换速率为0.5个培养体积/24小时；其中，灌流培养中：

1)当每24～48小时或活细胞密度倍增一次时，将生长培养基交换速度提高0.5个培养体积/24小时，最高为3个培养体积/24小时，直至最高细胞生长密度达到最高水平；

2)当在培养过程中需要控制最高活细胞生长密度，则在细胞数达标后，维持生长培养基交换速率不变，并降低控制温度为32～35℃；

3)若在细胞扩增过程中，某一时段出现存活率下降的情况，则立即扩大生长培养基交换体积，或提前进入降温至32～35℃的过程，以维持存活率，或每24小时排出部分培养细胞(10～50％)，并用生长培养基补齐要求培养体积的方式补救；

4)当在细胞增长至要求密度，存活率符合要求(例如≥90％)的情况下，可更换营养组分更为丰富的生长培养基，进行灌流，以提高细胞的蛋白表达水平；也可以不更换生长培养基，采用灌流结合补料的方式实现。

所述步骤(4)中，当ATF灌流设备中，使用0.2μm孔径的中空纤维柱时，在培养过程中持续收获中空纤维柱透过液，交由下游纯化，其中，最长细胞培养周期为3个月；

当ATF灌流设备中，使用50kDa中空纤维柱时，则在蛋白表达水平达标后(视实际生产需求，如10g/L)，结束培养，将生物反应器内的培养液收获，交由下游纯化。

因此，本发明的高产量反应器可应用于单抗及类单抗蛋白及其相应药物的生产或制备。

本发明中，通过在生物反应器上连接ATF灌流设备，可以做到对培养体积不改变或改变很小的情况下对培养体系进行连续流加培养基，补充新鲜营养成分。

另外，通过对生物反应器中培养的细胞进行截留，连续排出细胞上清液，把代谢废物和对细胞生长有害的物质排出，达到细胞长期保持高存活率(≥90％)，同时使细胞密度增长到一个很高的水平(如60×10⁶ cells/mL)。

再者，采用不同孔径的中空纤维柱进行细胞培养液截留，达到目标蛋白和细胞留在反应器内，使产品不断增加(50 kDa孔径的中空纤维柱)；或使细胞留在反应器内，目标蛋白连续收获，减少复杂目标蛋白的结构异常变化(0.2μm孔径的中空纤维柱)，提高产品收获率与纯度。

本发明有益效果如下：

1)降低生产成本

通过本发明，可以使小的反应器可以达到大反应器的产量(10倍以上)，从而降低厂房建造和运作费用；

同时，较小的反应器设备也可以大大增加生产厂房的运作灵活性；

2)在生物工程工艺研究阶段采用本发明的方法，可以大大缩短工艺研发时间，灵活采用灌流培养技术可以低产量细胞株“变成”高产量细胞株，减轻需要挑选高产量压细胞株的力；

3)本发明工艺可用在种子培养步骤中，大大提高种子细胞的密度，这样能够使生产罐的接种密度提高，有利于提高细胞培养密度以及蛋白表达量；

同时，高密度种子还可以用来接种多个生物反应器，达到一个种子罐接种多个生产罐的作用，大大提高车间的蛋白生产量；

4)本发明工艺还可以用来代替反应器下罐后的深层过滤操作，通过更换一个中空纤维柱的简单操作即可把目标蛋白和细胞分开，达到初步分离作用。

综上所述，本发明涉及的对哺乳动物细胞灌流培养技术标准化、灵活高效地运用，可以极大地缩短单抗或融合蛋白表达的工艺开发时间，在技术上具有极高的通用性，进而可以降低生产成本、缩小生产规模、利于项目的注册申报、缩短项目周期，加快生物制药行业的成果应用速度。

本发明除采用了常规规格的中空纤维柱之外，还采用了具有改进截留孔径(50kDa)的中空纤维柱，可以同时截留细胞和目的蛋白，降低下游纯化工作的工作压力。

因此，本发明利用改进的ATF工艺可以顺利解决灌流培养技术的标准化问题，在此基础之上对灌流培养技术进行灵活运用，就可以突破很多生物制药工艺研发以及生产上的技术关口。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是普通细胞截留与切向流方式截留的示意图；

图2是本发明所涉及的ATF灌流设备中的中空纤维柱微观结构与ATF设备中空纤维柱单元示图；

图3是本发明中使用的设备图；其中，1为生物反应器，11为加液泵，12为液面控制器，13为搅拌器，14为液体入口，2为ATF灌流设备，21为过滤泵，22为滤液，23为中空纤维柱，24为外壳，25为膜，26为ATF泵，27为控制器；

图4是实施例1中使用本发明方法与传统流加工艺方法后的对比效果图，其中，A为活细胞密度图，B为单抗蛋白表达量图，C为细胞存活率图；

图5是实施例2中使用本发明方法与一种现有工艺方法后的对比效果图，其中，A为活细胞密度图，B为单抗蛋白表达量图，C为细胞存活率图；

图6是实施例3中使用本发明方法的效果图，其中，A为细胞生长情况随培养时间变化图，B为单抗蛋白表达量图。

以上附图中的活细胞密度1E6 cells/mL，指的是活细胞密度1×10⁶ cells/mL。

具体实施方式

本发明的进行单抗及类单抗蛋白生产的高产量反应器，如图3所示，包括：生物反应器1(图3中的实线框部分)，以及与该生物反应器1连接的对应型号的商业化ATF灌流设备2(图3中的虚线框部分)。其中，生物反应器1的组成包括：加液泵11，与该加液泵11关联控制的液面控制器12(如液位电极或重量控制单元)，以及搅拌器13；商业化ATF灌流设备2(美国Refine Technology公司)，包括：过滤泵21，中空纤维柱23，外壳24，膜25，ATF泵26，控制器27。

生物反应器1，包括：能与ATF灌流设备2对接配合使用的常规生物反应器和可抛弃型生物反应器，且其应用体积包括：2L～25L的小试规模生物反应器，30～1000L的中试及生产规模生物反应器。

所述生物反应器1，与对应型号的ATF灌流设备2连接中，其对应形式见表1。

表1

生物反应器1体积	0-4L	4-25L	25-150L	150-400L	400-1000L
						ATF灌流设备2型号	ATF2	ATF4	ATF6	ATF8	ATF10

其中，ATF灌流设备2中的中空纤维柱23，优选0.2μm孔径的中空纤维柱23或截留孔径为50kDa的中空纤维柱23。

利用上述高产量反应器，进行单抗药物的生产工艺研究与样品制备，现举例说明如下：

实施例1

利用上述高产量反应器，进行单抗的生产方法，包括步骤：

(1)将生物反应器1与对应型号的ATF灌流设备2连接，完成离线灭菌或在位灭菌程序；

(2)使用生长培养基，将种子细胞按照0.3×10⁶～1×10⁶ cells/mL的密度接种生物反应器1至工作体积，控制温度(36～37℃)、pH(6.8～7.2)、溶解氧浓度(40％～60％)、罐压(2～8psi)，每24小时取样检测细胞数与生化指标；

其中，该生化指标，包括：pH、O₂溶解分压、CO₂溶解分压、谷氨酰胺含量、谷氨酸含量、葡萄糖含量、乳酸含量、NH₄ ⁺水平、Na⁺水平、K⁺水平、Ca⁺水平、渗透压等；

(3)当活细胞密度增长至3×10⁶～4×10⁶ cells/mL的密度时，启动ATF设备程序进入灌流培养，初期生长培养基交换速率为0.5个培养体积/24小时；

其中，灌流培养中：

1)当每24～48小时或活细胞密度倍增一次时，将生长培养基交换速度提高0.5个培养体积/24小时，最高为3个培养体积/24小时，直至最高细胞生长密度达到最高水平；

2)当在培养过程中需要控制最高活细胞生长密度，则在细胞数达标后，维持生长培养基交换速率不变，并降低控制温度为32～35℃；

3)若在细胞扩增过程中，某一时段出现存活率下降的情况，则立即扩大生长培养基交换体积，或提前进入降温至32～35℃的过程，以维持存活率，或每24小时排出部分培养细胞(10～50％)，并用生长培养基补齐要求培养体积的方式补救；

4)当在细胞增长至要求密度，存活率符合要求(例如≥90％)的情况下，可更换营养组分更为丰富的生长培养基，进行灌流，以提高细胞的蛋白表达水平；也可以不更换生长培养基，采用灌流结合补料的方式实现。

(4)收集生物反应器1内或从ATF灌流设备2中的中空纤维柱23滤出的培养液，纯化，得到所需蛋白产品(包括：单抗及类单抗蛋白)；其中，当ATF灌流设备2中，使用0.2μm孔径的中空纤维柱时，在培养过程中持续收获中空纤维柱透过液，交由下游纯化，其中，最长细胞培养周期为3个月；当ATF灌流设备2中，使用50kDa中空纤维柱23时，则在蛋白表达水平达标后(视实际生产需求，如10g/L)，结束培养，将生物反应器1内的培养液收获，交由下游纯化。

按照上述方法，为生产Herceptin单抗的CHO细胞株在一般(传统)流加工艺条件下只能达到4×10⁶ cells/mL细胞密度，蛋白(Herceptin单抗)表达量只有0.5克/升，这样的工艺条件无法满足项目的需求，导致项目无法推进。其中，传统流加工艺条件：即一般的补料流加，以0.3×10⁶～1×10⁶ cells/mL的活细胞密度接种(细胞存活率≥95％)，使用Invitrogen CD Opti CHO培养基和多宁S3培养基混合作为生长培养基，配合多宁AR7、多宁BR7、葡萄糖作为流加试剂。然而，使用本发明工艺，一次实验就达到了一般流加工艺8倍的最高细胞生长密度和5倍的目标蛋白产量，完全解决了该项目的产业化问题(如图4所示)。

实施例2

按照一般补料流加工艺，为生产anti-CD20抗体的CHO细胞虽然能生长到7×10⁶ cells/mL的活细胞密度，但目标蛋白anti-CD20抗体表达量只有0.25克/升。

然而，按照实施例1的生产方法，为生产anti-CD20抗体的CHO细胞达到了一般补料流加工艺近10倍的最高细胞生长密度和8倍的目标蛋白产量(如图5所示)。

实施例3

按照实施例1的生产方法，为生产Humira单抗的CHO细胞在短短的11天里最高细胞生长密度达到了140×10⁶ cells/mL的生长和近9克/L的目标蛋白(Humira单抗)产量(如图6所示)。

Claims (10)

1.一种进行蛋白生产的高产量反应器，其特征在于，包括：生物反应器，与该生物反应器连接的ATF灌流设备；

其中，该生物反应器，包括：能与ATF灌流设备对接配合使用的常规生物反应器或可抛弃型生物反应器。

2.如权利要求1所述的高产量反应器，其特征在于：所述生物反应器，包括：2L～25L的小试规模生物反应器，30～1000L的中试及生产规模生物反应器；

其中，所述生物反应器的组成包括：加液泵，与该加液泵关联控制的液面控制器。

3.如权利要求1所述的高产量反应器，其特征在于：所述生物反应器，与对应型号的ATF灌流设备连接中，其对应形式如下：

当生物反应器的体积为0-4L，ATF灌流设备的型号为ATF2；

当生物反应器的体积为4-25L，ATF灌流设备的型号为ATF4；

当生物反应器的体积为25-150L，ATF灌流设备的型号为ATF6；

当生物反应器的体积为150-400L，ATF灌流设备的型号为ATF8；

当生物反应器的体积为400-1000L，ATF灌流设备的型号为ATF10。

4.如权利要求1所述的高产量反应器，其特征在于：所述ATF灌流设备中的中空纤维柱是0.2μm孔径的中空纤维柱或截留孔径为50kDa的中空纤维柱。

5.如权利要求1所述的利用高产量反应器进行蛋白的生产方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将生物反应器与对应型号的ATF灌流设备连接，完成离线灭菌或在位灭菌程序；

(2)使用生长培养基，将种子细胞按照0.3×10⁶～1×10⁶ cells/mL的密度接种生物反应器至工作体积，控制温度、pH、溶解氧浓度、罐压，每24小时取样检测细胞数与生化指标；

(3)当活细胞密度增长至3×10⁶～4×10⁶ cells/mL的密度时，启动ATF灌流设备程序进入灌流培养；

(4)收集生物反应器内或从ATF灌流设备中的中空纤维柱滤出的培养液，纯化，得到所需蛋白产品。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，控制温度为36～37℃、pH为pH 6.8～7.2、溶解氧浓度为40％～60％、罐压为2～8psi；

所述生化指标，包括：pH、O₂溶解分压、CO₂溶解分压、谷氨酰胺含量、谷氨酸含量、葡萄糖含量、乳酸含量、NH₄ ⁺水平、Na⁺水平、K⁺水平、Ca⁺水平、渗透压。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，初期生长培养基交换速率为0.5个培养体积/24小时。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，灌流培养中：

1)当每24～48小时或活细胞密度倍增一次时，将生长培养基交换速度提高0.5个培养体积/24小时，最高为3个培养体积/24小时，直至最高细胞生长密度达到最高水平；

2)当在培养过程中需要控制最高活细胞生长密度，则在细胞数达标后，维持生长培养基交换速率不变，并降低控制温度为32～35℃；

3)若在细胞扩增过程中，某一时段出现存活率下降的情况，则立即扩大生长培养基交换体积，或提前进入降温至32～35℃的过程，以维持存活率，或每24小时排出10～50％培养细胞，并用生长培养基补齐要求培养体积的方式补救；

4)当在细胞增长至要求密度，存活率符合要求的情况下，能更换营养组分更为丰富的生长培养基，进行灌流，以提高细胞的蛋白表达水平；也能不更换生长培养基，采用灌流结合补料的方式实现。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，当ATF灌流设备中，使用0.2μm孔径的中空纤维柱时，在培养过程中持续收获中空纤维柱透过液，交由下游纯化，其中，最长细胞培养周期为3个月；

当ATF灌流设备中，使用50kDa中空纤维柱时，则在蛋白表达水平达标后，结束培养，将生物反应器内的培养液收获，交由下游纯化；

所述蛋白产品，包括：单抗及类单抗蛋白。

10.如权利要求1所述的高产量反应器的应用，其特征在于：应用于单抗及类单抗蛋白及其相应药物的生产或制备。

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