CN114058599A

CN114058599A - 交替切向流快速收获

Info

Publication number: CN114058599A
Application number: CN202111280689.4A
Authority: CN
Inventors: S·K·库杜冈蒂; W·R·林; J·博纳姆-卡特; J·R·鲁舍
Original assignee: Ripley Gold
Current assignee: Ripley Gold
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2022-02-18
Also published as: EP3487609A4; EP3487609A1; US20180148677A1; KR102539167B1; KR20230080504A; KR20220110865A; KR20190034241A; US20220325708A1; AU2017301691A1; AU2017301691B2; JP2022125250A; JP7102391B2; KR102427715B1; JP2019523002A; CN109689191A; CN109689191B; CA3032099A1; WO2018022661A1; US11339775B2

Abstract

本发明涉及交替切向流快速收获。本发明公开了通过在流体培养基中培养细胞直到细胞已经产生收获浓度的细胞产物来从细胞培养物中收获细胞产物的方法和系统。细胞在细胞培养系统中培养，所述细胞培养系统包括连接到ATF装置的生物反应器。方法包括通过出口和ATF装置从生物反应器排出流体培养基直到生物反应器体积达到预定的体积，并且ATF柱在ATF出口处产生含有细胞产物的液体并且使具有低于收获浓度的浓度的细胞产物的流体培养基回到生物反应器中，从ATF出口抽取含有细胞产物的液体，用无菌磷酸盐缓冲盐水或不含任何细胞产物的流体培养基再填充生物反应器，并重复步骤直到移出所需量的细胞产物。

Description

交替切向流快速收获

本申请是CN201780056128.1的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月25日提交的美国临时申请No.62/366,557 的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及交替切向流过滤单元用于从生物反应器中收获产物、例如用于从补料分批生物反应器培养物中收获产物的用途。

背景

微生物、植物或动物细胞的培养物用于产生具有重要商业价值的生物和化学物质。特别是对于商业生产，这些培养物能够以三种操作模式运行：分批、连续、补料分批或浓缩补料分批。应用包括发酵、生物技术和化学品，用于生产特种化学品和产物，以及废物处理。产物通常是高价值产物，包括任何所需的细胞产物，例如内源和重组产物，包括蛋白质、肽、核酸、病毒、氨基酸、抗生素、特种化学品和其他有价值的分子。所需的蛋白质可包括但不限于单克隆抗体、酶和其他重组抗体、酶、肽、病毒。即使产量和生产率的微小改善也会提高收益率。因此，存在改进分批、补料分批或浓缩补料分批反应器操作的动机。

使用现有技术从补料分批生物反应器中收获产物通常采用分离方法，例如离心和深度过滤，这可能是耗时的并且能够产生比期望的更低的产物回收率。离心成为细胞收获的一部分已经有一段时间了，但是这个方法导致高剪切，导致低活力和可能受到改变的蛋白质质量。深度过滤具有优于离心的优点，但是具有其自身的局限性，例如需要监测压差，过滤器的处理，大的空间占用和按比例扩展的问题。此外，离心和深度过滤都需要第二次澄清步骤以产生适用于色谱分离方法的流体。

概述

本公开内容中描述的方法和系统至少部分地基于以下发现：交替切向流(ATF)过滤能够适于进行从细胞培养物(例如补料分批培养物或浓缩补料分批培养物)的快速收获以实现细胞产物的快速、高产率收获的有益结果。使用ATF收获补料分批和其他类型的细胞培养物允许以最少的步骤进行快速收获程序，因为新方法简化了收获程序 (其通常需要两个或更多个步骤，例如离心和深度过滤)。ATF收获产生具有高澄清度的适合于下一阶段(例如色谱柱)的进料流，因此避免了下游系统的结垢。因此，本公开内容描述了使用ATF收获补料分批和浓缩补料分批培养物的一系列方法。

使用离心或深度过滤器从补料分批生物反应器中收获蛋白质是常用的。然而，使用这些常用技术的蛋白质回收率很低，并且是耗时的过程。根据本文所述的新方法和系统，在补料分批生物反应器上使用ATF作为快速收获设备能够将收获时间减少到小于8或10小时。新方法还维持蛋白质质量，因为在整个收获过程中细胞活力仍然很高。

在第一方面，本公开内容包括从细胞培养物例如补料分批或浓缩补料分批细胞培养物中收获细胞产物的方法。细胞产物包括任何所需的内源和重组蛋白质、核酸、病毒和其他有价值的分子。所需的蛋白质可包括但不限于单克隆抗体、酶和其他重组或天然存在的蛋白质。这些方法包括在起始体积的培养基中培养细胞直到细胞在培养基中已经产生收获浓度的细胞产物，其中细胞在包括连接到交替切向流 (ATF)装置的生物反应器的细胞培养系统中培养；通过ATF装置从生物反应器排出培养基直到培养基体积达到预定的体积，其中所述 ATF装置在ATF出口处提供含有细胞产物的液体，并将具有比收获浓度低的细胞产物浓度的培养基返回至所述生物反应器；从ATF出口抽取含有细胞产物的液体；用流体培养基再填充生物反应器至等于、高于或低于起始体积的体积；和重复排出、抽取和再填充步骤中的一个或多个步骤，直到从生物反应器中移出所需量的细胞产物。

在这些方法中，预定的体积能够低于或高于起始体积，或者与起始体积大致相同。用于再填充生物反应器的实施流体培养基能够是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或细胞培养基，或能够用于维持细胞存活的任何其他液体。

在一些实施方案中，再填充包括以等于从所述生物反应器排出所述培养基的速率的速率或以从ATF出口抽取液体的速率同时再填充所述生物反应器。在某些实施方案中，排出步骤和再填充步骤顺序进行，和/或再填充步骤和排出步骤进行两次或更多次。

在新方法中，对于500升到2000升的体积，收获能够花费少于 18小时，例如，少于24、20、18、16、14、12、10小时或更少，例如，少于9、8、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5或5.0小时或更少。例如，在一些实施方案中，重复排出步骤(直到生物反应器体积达到预定的体积)和抽取步骤这两个步骤能够花费少于2.5小时。在某些实施方案中，培养基以约2至30升/米²/小时(LMH)的过滤通量排出，例如约2、4、5、6、7、8、9或10至30升/米²/小时(LMH)，例如 3至25、4至20或5至15LMH。

在各种实施方案中，预定的体积能够是起始体积的约5％至约 30％或起始体积的约10％至约20％。在这些方法中，细胞培养物能够是浓缩补料分批培养物，并且预定的体积能够是起始体积的约 50％或起始体积的100％。在一些实施方案中，基于培养基中的细胞浓度确定预定的体积。

在一些实施方案中，ATF装置能够包括中空纤维过滤器，例如，具有约0.1至5.0微米，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9微米或1、2、3或4微米、或约500至1000kD，例如550、600、 650、700、750、800、850、900或950kD的孔径。

在这些方法中，排出步骤、抽取步骤和再填充步骤中的任何两个或更多个能够同时并以第一流速进行。例如，能够在细胞已经产生待在细胞培养过程结束时收获的所有细胞产物之前开始排出步骤、抽取步骤和再填充步骤中的任何一个或多个。在一些实施方案中，在细胞在流体培养基中已经产生收获浓度的细胞产物之前1至8天(例如2 至7天或3至6天)开始排出步骤、抽取步骤和再填充步骤。

在一些实施方案中，抽取和再填充体积小于约1.0(例如，约0.9、 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)的每天交换的容器体积(VVD)。

在一些实施方案中，最终收获步骤以不同于第一流速的第二流速进行。在一些实施方案中，最终排出步骤能够导致生物反应器中剩余小于约20％(例如小于10％)的起始体积。

在所有这些方法中，细胞培养物能够为补料分批细胞培养物或浓缩补料分批细胞培养物，并且方法能够用于产生细胞产物，例如单克隆抗体、酶和/或病毒。

在另一方面，本公开内容提供了用于从细胞培养物中收获细胞产物的系统。这些系统包括包含入口和出口的生物反应器；连接到生物反应器入口的不含细胞产物的细胞培养基源；连接到生物反应器出口的交替切向流(ATF)装置；连接到ATF装置的出口并配置成从ATF 装置移出流体的泵；和被布置和编程以单独地或以各种组合和子组合执行本文所述的一种或多种方法的控制器。

本公开内容中描述的方法和系统提供了若干优点，包括因为在补料分批培养物的收获期间的低剪切而在使用本文所述的新方法收获的产物中维持高细胞活力和更好的蛋白质质量。细胞死亡或应力经常导致降解或修饰蛋白质的酶的释放，这可能损害产物质量。新方法和系统导致更高的产率和增加的生产力并具有改善的蛋白质质量。新方法和系统允许回收其中细胞基本上完整且未掺杂的形式的细胞培养液，并且不损害随后的培养的细胞从其液体培养基的分离性能或不增加在培养的细胞从其液体培养基的收获和分离期间增加不需要的生物制剂的风险。蛋白质通过膜的速率对于快速完成分离步骤是重要的。使用新方法和系统的生产时间代表了经济优势，并且还可能需要这样的生产时间来快速获得不稳定的蛋白质以避免不希望的产物改性，例如降解。

“补料分批培养”是指用于生物技术工艺的操作技术，其中细胞生长和产物形成所必需的一种或多种营养物通过在另外的分批操作过程期间的一种或多种进料流在培养期间间歇地或连续地进料或供应给生物反应器。在操作过程中没有流出物料流，因此生物反应器产物保留在生物反应器中直到收获它们时的运行结束。如果细胞完全存活且具有生产力，则该过程可以重复多次。补料分批培养是有利的，因为补料分批操作能够提供调节控制关键反应速率的化合物的浓度的独特方法，因此能够通过操纵一种或多种进料速率提供优于分批操作的明确优势。由于其操作简单性和作为发酵的转移(carryover) 过程的熟悉性，补料分批培养对于大规模生产也是有利的。

术语“深度过滤”是指使用多孔过滤介质将颗粒保留在整个介质中而不是仅在介质表面上的过滤。当待过滤的流体含有高负载的颗粒时，通常使用这种过滤器，因为与其他类型的过滤器相比，它们在堵塞之前能够保留大量的颗粒。深度过滤的典型特征是多个多孔层，其深度用于从液相中捕获固体污染物。

术语“渗滤”是指稀释过程，其涉及通过使用微分子可渗透的过滤器基于其分子大小除去或分离溶液的组分(例如，可溶性分子例如盐、小蛋白质、溶剂等)以产生纯溶液。这通常通过以与向待过滤的溶液中添加液体相同的速率除去过滤器渗透物来进行(称为恒定体积渗滤)。

术语“细胞培养液”是指在培养期间细胞悬浮于其中的液体。在补料分批过程中，这包括补料培养基和营养物，以及细胞产物(例如蛋白质和废料)。

术语“浓缩补料分批”(CFB)是指使用具有超滤膜(例如，50kDa 或30kDa标称MW截断值)的灌注系统(交替切向流(ATF)/切向流过滤(TFF))，其将蛋白质产物保留在生物反应器中同时除去废料产物并将另外的培养基进料到反应器容器中。该过程获得更高的细胞浓度并且像传统的补料分批方法一样将产物保留在反应器中。

术语“连续进料”是指在收获期的某些部分将培养基或培养基组分连续添加到生物反应器中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的而不是限制性的。

从以下详细描述和权利要求中，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图说明

图1是用于进行快速ATF补料分批收获的装置和方法的示意图。

图2是用于执行图1的快速ATF补料分批收获的方法的流程图。

图3是使用图1的方法的活细胞密度(VCD)和活力随着培养时间变化的图。

图4是使用图1的方法的蛋白质浓度随着培养时间变化的图。

图5是使用图1的方法，基于累积蛋白质的细胞比生产力随着活细胞计数的积分(IVC)变化的图。

图6是用于进行快速ATF补料分批收获的整体系统图。

图7是用于使用连续渗滤进行快速ATF补料分批收获的装置和方法的示意图。

图8是用于执行图7的快速ATF补料分批收获的方法的流程图。

图9是使用图7的方法的活细胞密度和活力随着培养时间变化的图。

图10是使用图7的方法的蛋白质浓度随着培养时间变化的图。

图11是使用图7的方法，基于累积蛋白质的细胞比生产力随着活细胞计数的积分变化的图。

图12是用于使用连续渗滤进行快速ATF浓缩补料分批收获的实施方案和装置和方法的示意图。

图13是用于使用连续渗滤进行快速ATF浓缩补料分批收获的装置和方法的实施方案的示意图。

图14是用于使用连续进料然后快速收获进行快速ATF补料分批收获的装置和方法的实施方案的示意图。

图15是与传统的补料分批方法相比，使用图14的方法的活细胞密度和活力随着培养时间变化的图。

图16是与传统的补料分批方法相比，使用图14的方法的基于累积蛋白质的细胞比生产力随着活细胞计数的积分变化的图。

图17是与传统的补料分批方法相比，使用图14的方法的蛋白质浓度随着培养时间变化的图。

图18是使用超滤器连续进料进行ATF快速收获的装置和方法的实施方案的示意图。

详细描述

本公开内容描述了交替切向流(ATF)过滤用于进行补料分批收获的用途。ATF用于收获补料分批培养物的使用允许在单个工艺步骤中进行快速收获程序，用单组设备加工批次，其中单一产物作为经加工的材料。与其他切向流过滤方法相比，由于能够使用ATF在更高的过滤器通量下进行产物收获，这些方法在使用ATF时是成功的。

交替切向流(ATF)已经用于在单一步骤中进行过滤和从产物中分离细胞，但通常限于1.3-5.7LMH的过滤通量，其太慢而不能用于商业培养物收获环境。出乎意料的是，当如本文所述在更高的通量(例如，大于10LMH)下进行ATF过滤时，过滤器没有结垢并且在短的处理时间内从培养物中快速回收产物。用ATF快速收获培养物在商业方法中作为在单一步骤中获得适于进一步加工的澄清的进料流的经济上有利的方式具有实用性。

新方法还简化了收获程序，迄今为止其通常需要两个或更多个步骤，例如离心然后深度过滤。如本文所述的ATF收获产生具有高澄清度的能够在下一阶段(例如，至色谱柱)直接使用的进料流，因此避免了例如色谱柱的下游结垢，而无需任何其他过滤或其他澄清步骤。

在补料分批培养期间，利用生物技术方法来产生所需产物。在培养期间，细胞生长和产物形成所必需的一种或多种营养素(这可包括，例如，任何所需的细胞产物，包括内源和重组产物，包括蛋白质、核酸、病毒和其他有价值的分子)在培养期间被进料或供应到生物反应器。在操作过程中，通过一个或多个进料流连续或间歇地进行该进料。在操作过程中没有流出物料流，因此在操作期间生物反应器内的液体和细胞的体积增加。生物反应器产物保留在生物反应器中直到收获它们时的运行结束，通常在培养5至30天，例如7至25天或10至21 天之后。补料分批培养物的收获被执行得最好而对发酵液中的细胞几乎没有损害，快速执行以提供有效的加工而无产物改性，并且具有通过色谱法进一步加工产物所需的澄清。ATF能够独特地支持这些要求。

历史上，ATF已用于灌注培养系统，其中细胞培养基连续供应至含有细胞的生物反应器，并且ATF连续过滤培养物，使用微滤膜除去培养物废料和蛋白质产物。该方法允许连续或频繁间歇地并且对于持续30天或甚至更长的培养期在低过滤通量(1.3-5.7LMH)下收获蛋白质。该方法在高细胞密度(例如，50-150E6细胞/mL或更高) 下进行。这些ATF辅助的灌注培养也能够用含有超滤器(例如，标称孔径50kD或更小)的ATF进行，在此期间除去废料但产物保留在培养液中。这些培养在低过滤通量下操作。这些有时被称为浓缩补料分批(CFB)，因为所需的细胞产物保留在细胞培养液中，因为废料的去除允许浓度高得多的细胞并因此允许更高浓度的所需产物。

在本方法中，不是在低通量连续细胞培养中使用ATF，而是将 ATF方法适应于用作补料分批培养有关的快速收获设备(代替深度过滤和离心)。在新方法中，在收获细胞密度通常为7-20E6细胞/ml 的补料分批培养物或细胞密度范围为50-200E6细胞/ml(例如， 75-120E6细胞/ml)的CFB培养物当天ATF不同地以高过滤通量使用。与传统的灌注系统不同，在新方法中，产物(例如蛋白质)以高过滤通量收获。使用ATF系统作为补料分批或CFB生物反应器上的快速收获设备能够克服上述问题，因为整个收获过程保持高细胞活力和更好的产物质量。

这些方法体现在用于补料分批和浓缩补料分批生物反应器的四种不同的快速收获技术中，包括：

(1)使用逐步渗滤的ATF快速收获(用于传统的补料分批培养物)，

(2)使用连续渗滤的ATF快速收获(用于传统的补料分批培养物；比逐步渗滤更有效，耗时更少)，

(3)使用连续渗滤的ATF快速收获(用于浓缩的补料分批培养物；更有效和耗时更少)，和

(4)使用连续补料的ATF快速收获(更有效，耗时更少，蛋白质产率增加)。下面更详细地描述这四种不同方法的程序。

使用逐步渗滤的快速收获

具有中空纤维多孔膜的ATF系统(例如，微滤孔径例如0.1-5.0 微米或超滤膜例如750kDa MWCO)非常适合于收获补料分批培养物，因为它保留细胞以及其他小颗粒，其必须在下游工艺之前被除去。与离心或深度过滤不同，使用ATF还可以减少交叉污染，因为收获能够以无菌方式进行。

如图1所示，ATF收获生物反应器系统200包括生物反应器210，其可为例如搅拌釜反应器。生物反应器210通过引流管212连接到ATF 220。ATF是诸如用于使用交替切向流利用中空纤维过滤来灌注生物反应器培养物的系统。ATF 220包括控制隔膜泵222以通过中空纤维过滤器224(参见例如美国专利No.6,544,424)执行ATF的装置，两者都装在可消毒的壳体226中。

通过进料管线214将培养基和添加剂引入生物反应器210中，进料管线214由阀和/或泵216控制。空气供应源和控制器240(图6) 通过空气管228连接到隔膜泵222。从隔膜泵222添加和抽出空气，以增加和减小隔膜泵内容纳的两个腔室的体积，从而改变壳体226 内的压力并引导容纳在壳体226内的流体的流动和通过中空纤维过滤器224的膜抽出流体。通常，中空纤维的内部通过引流管212流体连接到生物反应器，而中空纤维过滤器224的中空纤维外和壳体226 内的腔室流体连接到产物引流管230。产物引流管230具有收获泵/ 阀232，其控制通过中空纤维过滤器过滤并且位于中空纤维过滤器 224和壳体226之间的腔室中的产物的抽出。在图1中，产物引流管 230显示在ATF 220的顶部附近，然而产物引流管230也可位于ATF 220的中部或底部附近。或者，可以有连接到壳体226的多于一个产物引流管230。

为了使用ATF收获生物反应器系统200进行快速收获，使用 ATF以大于10但不大于30升/米²/小时(LMH)(例如12-18LMH、 13-16LMH或15LMH)的快速通量收获产物(例如蛋白质)。能够通过从培养容器中循环移出体积并进行再填充(分批过滤)或通过在培养液中连续补充液体同时通过过滤方法收获液体(恒定体积渗滤)来完成快速收获。下文和在具体实施例中描述了这两种方法。在大多数生物反应器设计中实际上仅能够移出大约80％的体积并且仍然保持足够的搅拌，因此虽然一些反应器可以允许高于80％，但将描述在过滤的分批或循环方法中最通常80％或更少的移出。

对于600L生物反应器(图1中显示为6L)中的500L量的培养基，15LMH通量在本方法中导致约2.1至2.5小时的排出时间(假设ATF过滤器尺寸为11m²)。此蛋白质排出持续直到生物反应器210体积中的剩余体积下降至例如30％，尽管能够使用其他体积减小值(例如，20％)。在该生物反应器体积处，暂停收获泵232。细胞全部保留在生物反应器210中并且在培养液内，培养液随后被填充至与收获开始时大致相同量的流体。在一些情况下，然后，随着收获的开始，将培养液填充至较低量或较高量的流体。流体可以是无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或培养基或与活细胞培养液相容的其他流体。收获排出过程以约15LMH的流量重新开始，直到生物反应器210中的体积再次下降至约30％。如果期望或需要，重复该循环三和四次。来自最初包含在生物反应器210内的补料分批培养物的大约96％的蛋白质被回收并维持细胞活力。

快速收获程序的步骤总结在图2中。在步骤150，当补料分批培养完成时，收获开始。在步骤160，使用ATF以在10-30LMH(例如，15LMH)的通量排出细胞培养液进行收获直到生物反应器110 的体积减少至其初始体积的10-50％或更优选20-30％。在步骤170，在该生物反应器体积处，收获泵232暂停，并且操作者确定是否已达到所需的回收率。这能够通过排出/再填充循环次数(例如，2或3) 或其他方式(例如测定收获产物的总量或浓度)测量。如果要继续收获，则在步骤180再填充生物反应器210，返回至排出步骤160并最终在步骤190收获完成。

使用连续渗滤的快速收获

在另一个实施方案中，使用连续渗滤的快速ATF收获程序示于图7中。在一些情况下，这种恒定体积渗滤方法比分批方法提供更高的产率并具有更小的体积。可以就产率和时间对两种方法进行测试，以选择给定应用的最佳方法。用ATF连续渗滤收获的组件类似于图 1中所示的那些。对于该程序，ATF收获生物反应器系统300包括通过引流管312连接到ATF 320的生物反应器310。ATF 320包括控制隔膜泵322以通过中空纤维过滤器324执行ATF的装置，两者都被装在可消毒的壳体326中。

通过进料管线314将培养基和添加剂引入生物反应器310中，进料管线314由阀和/或泵316控制。空气供应源和控制器(未示出) 通过空气管328流体连接到隔膜泵322。中空纤维的内部部分(渗余物)通过引流管312连接到生物反应器310，而中空纤维过滤器324 的中空纤维外和壳体326内的腔室连接到产物引流管330(渗透物)。产物引流管330具有收获泵/阀332，其控制渗透物内产物的抽出。

在该方法中，还使用ATF 320以10-30LMH(通常12-18或15 LMH)的通量收获蛋白质，直到生物反应器310的体积下降至其中能够通过过滤维持升高的通量高达流体转移的4个生物反应器体积的体积。体积减少的百分比可以为0-100％，例如，对于补料分批培养物为30％或对于CFB培养物为0-50％。在一些情况下，体积减少的百分比为例如10-90％，例如25-75％，例如30-60％，例如5、10、 15、20、25、30、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。对于500L生物反应器310，通过11m²过滤器的15LMH通量导致排出时间达到约2.1小时的30％水平。

一旦达到该减少的生物反应器体积(例如，1.8L)，开始渗滤过程以通过以等于经由产物引流管330(渗透物)的流体收获速率的流速经由进料管线314添加PBS或培养基(或与维持细胞活力相容的其他流体)来维持生物反应器体积。该渗滤过程能够在例如15LMH的通量下进行，直到渗透物中所需产物的产率达到大于90％。因此，通过该方法的快速收获在少于约6-8小时(例如，少于6小时)内完成。

使用具有渗透物的收集的分批洗涤或恒定渗滤，能够实现从补料分批或CFB培养物中快速收获产物。

使用连续渗滤的快速收获程序的步骤总结在图8中。在步骤250，当补料分批培养完成时，收获开始。在步骤260，使用ATF进行收获以在10-30LMH(例如，15LMH)的通量下排出细胞培养液直到生物反应器310的体积为其初始体积的约30％。在步骤270，在该生物反应器体积下，收集泵332的流速降低，而流体通过进料管线214 以大致相同的速率(例如，15LMH)加入生物反应器210中以完成渗滤循环。一旦经由循环通过整个置换体积完成渗滤循环，则确定(在步骤280)是否继续收获(例如，还没有90％或96％回收)和系统返回到步骤270以执行另外的渗滤循环。在步骤290，一旦达到所需的体积，就完成收获操作。

对于浓缩补料分批使用连续渗滤的快速收获

在另一个实施方案中，对于浓缩补料分批系统使用连续渗滤的快速ATF收获程序示于图12中。用于浓缩补料分批(CFB)的ATF 快速收获过程取决于收获当天的活细胞密度。用于使用ATF连续渗滤收获的组件类似于图1中所示的那些。

如图12所示，ATF收获生物反应器系统400包括生物反应器 410，其可为例如搅拌釜反应器。生物反应器410通过引流管412连接到ATF 420。ATF是诸如用于使用交替切向流利用中空纤维过滤来灌注生物反应器培养物的系统。ATF 420包括控制隔膜泵422以通过中空纤维过滤器424(参见例如美国专利No.6,544,424)执行ATF 的装置，两者都装在可消毒的壳体426中。

通过进料管线414将培养基和添加剂引入生物反应器410中，进料管线414由阀和/或泵416控制。空气供应源和控制器(未示出) 通过空气管428流体连接到隔膜泵422。从隔膜泵422添加和抽出空气，以增加和减小隔膜泵内容纳的两个腔室的体积，从而改变壳体426内的压力并引导容纳在壳体426内的流体的流动和通过中空纤维过滤器424的膜抽出流体。通常，中空纤维的内部通过引流管412 流体连接到生物反应器，而中空纤维过滤器424的中空纤维外和壳体 426内的腔室流体连接到产物引流管430。产物引流管430具有收获泵/阀432，其控制通过中空纤维过滤器过滤并且位于中空纤维过滤器424和壳体426之间的腔室中的产物的抽出。

在图12中，产物引流管430显示在ATF 420的顶部附近，然而产物引流管430也可位于ATF 420的中部或底部附近。或者，可以有连接到壳体426的多于一个产物引流管430。

如果在浓缩补料分批生物反应器410培养结束时收获当天活细胞密度(VCD)低于100E6细胞/mL，则使用ATF 420以10-30LMH (通常12-18、13-16或15LMH)的通量收获蛋白质直到生物反应器410的体积下降至其中可以通过过滤维持升高的通量高达流体转移的4个生物反应器体积的体积。这可以是0-50％，例如50％，这取决于细胞密度。

一旦达到该减少的生物反应器体积，开始连续渗滤过程以通过以等于经由产物引流管430(渗透物)的流体收获速率的流速经由进料管线414添加PBS或培养基(或与维持细胞活力相容的其他流体) 来维持生物反应器体积。该渗滤过程能够在例如10-30LMH的流量下进行，直到渗透物中所需产物的产率达到大于90％。因此，通过该方法的快速收获在少于约6-8小时(例如，少于6小时)内完成。

当收获当天VCD已经高于100E6细胞/mL时，建议不浓缩细胞密度。参考图13，在这种情况下，在连续渗滤之前生物反应器体积不会减少。开始渗滤过程以通过以等于经由产物引流管430的流体收获速率的流速经由进料管线414添加PBS或培养基(或与维持细胞活力相容的其他流体)来维持生物反应器体积为100％。该渗滤过程能够在例如10-30LMH的通量下进行，直到渗透物中所需产物的产率达到大于90％，例如，在4个生物反应器体积交换之后。在4次体积交换后，将用PBS或新鲜培养基交换收获剩余的培养基。

下表1显示了生物反应器体积的建议减少，这取决于收获当天的细胞密度(其能够通过已知的测量技术确定)。

表1：生物反应器体积管理

这些方法提供了操作细胞生物反应器收获的新方式，其中ATF 仪器在正常操作的增加的通量下操作。这种独特的方法能够实现以前无法实现的快速收获。该方法的特征是：获得无颗粒进料流和产物收获能够发生的速度的单一工艺步骤。由于减少了处理时间并降低了多个处理步骤的设备成本，这些特征在生物制造过程中提供了显著的经济效益。

使用连续进料的ATF快速收获

开发了使用连续进料的补料分批和快速收获的方法以进一步缩短收获时间。该技术既将收获时间缩短了一半，又增加了蛋白质产量，同时保持细胞活力以确保高产物质量。目前存在的商业上可获得的补料分批收获技术无法实现收获期间蛋白质产量的增加。提高的生产率是特别有利的，因为它是在不改变补料分批培养中使用的基本设备例如用于细胞培养的生物反应器或控制系统的情况下完成的。

在培养的最后几天对补料分批生物反应器的连续缓慢进料增加了蛋白质产量，而没有给补料分批培养和收获的方法增加额外的时间。这能够使用微过滤器(渗透物中的产物的收集)或使用超滤器(将产物保留在反应器中，其中将在最终收获阶段期间收集产物)来实现。此外，连续收获方法还提高了补料分批培养物的活力，这有利于蛋白质质量。与离心或深度过滤不同，该方法因为整个过程以无菌方式进行而减少了交叉污染。

图14显示了用于使用ATF方法连续进料和快速收获的补料分批的装置的示意图。用于使用ATF连续渗滤收获的组件类似于图1中所示的那些。

如图14所示，ATF收获生物反应器系统500包括生物反应器 510，其可为搅拌釜反应器。生物反应器510通过引流管512连接到 ATF 520。ATF 520包括控制隔膜泵522以通过中空纤维过滤器524 执行ATF的装置，两者都装在可消毒的壳体526中。通过进料管线514将培养基和添加剂引入生物反应器510中，进料管线514由阀和 /或泵516控制。空气供应源和控制器通过空气管528流体连接到隔膜泵522。从隔膜泵522添加和抽出空气，以增加和减小隔膜泵内容纳的两个腔室的体积，从而改变壳体526内的压力并引导容纳在壳体 526内的流体的流动并通过中空纤维过滤器524的膜抽出流体。通常，中空纤维的内部通过引流管512流体连接到生物反应器，而中空纤维过滤器524的中空纤维外和壳体526内的腔室流体连接到产物引流管 530。产物引流管530具有收获泵/阀532，其控制通过中空纤维过滤器过滤并且位于中空纤维过滤器524和壳体526之间的腔室中的产物的抽出。

连续进料能够以低体积(小于1.0的每天交换的容器体积 (VVD)，例如小于0.7VVD)进行，并且在进行快速收获之前进行可变数量的天数(例如2-8天)。在一个优选的实施方案中，从培养的第11天至第14天进行连续的缓慢进料和收获(@0.5VVD)。在 72小时后随着发生快速收获发生同时的进料和收获。使用ATF 520 以10-30LMH(通常12-18、13-16或15LMH)的通量收获蛋白质，直到生物反应器510的体积下降至低于20％(优选<10％)，基本上收获生物反应器的液体部分。对于所示的生物反应器尺寸，该方法的快速收获部分大约需要3小时来完成。

连续进料和快速收获方法具有显著的优点。本公开内容中早先描述的方法需要培养14天和约6小时的额外收获时间，从而产生最终量的回收蛋白质。在使用ATF的连续进料和快速收获方法中，有11 天的常规培养，然后3天的连续进料/收获(相同的总共14天)，然后仅3小时的快速收获。该方法导致在与补料分批培养生产中使用的相同生物反应器设备基本相同的时间内回收增加量的蛋白质。此外，在快速收获之前的低体积收获期间的连续进料比目前可用的工艺技术更好地维持或改善细胞活力和产物质量。

在所描述的用于快速收获的所有实施方案中，能够通过使用具有超滤器的ATF进一步浓缩最终产物合并物(pool)以减少体积，用于产物的后续额外处理或储存。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中记载的本发明的范围。

1)使用逐步渗滤的ATF快速收获-传统的补料分批

需要各种测试和实验程序来改进使用ATF逐步渗滤的补料分批快速收获系统。实施例包括6L补料分批生物反应器(使用来自 Repligen Corp.，Waltham MA的ATF2系统)用于快速收获。ATF2 数据用于外推至1000L补料分批生物反应器(使用来自Repligen Corp.，Waltham MA的ATF10系统，用于500L和1000L生物反应器的市售灌注产品)。

还进行了测试以确定该方法的回收百分比和总收获时间。对于该测试，将冷冻小瓶

R3IGF-1适应的CHO DP12细胞解冻并在含有CD

培养基的125mL摇瓶(工作体积40mL)中生长，所述培养基含有100ng/mL

R3IGF-1、200nM氨甲蝶呤和4mM

4-6天后，将细胞再次传代/亚培养到1L(工作体积200mL)摇瓶中，以产生足够数量的细胞用于接种到生物反应器中。一旦密度达到5-7E6细胞/mL，将细胞接种到与SS-ATF2 组装的3L生物反应器(工作体积1.5L)中。补料分批生物反应器的进料策略和生物反应器条件描述于表2和3中。

表2：补料分批条件

表3：生物反应器条件

在第14天，在补料分批培养结束时，以0.9LPM的ATF速率和 15LMH的通量开始收获过程。在每个循环后(如图1所示)，将生物反应器用无菌PBS填充回至100％，并在相同的通量下开始第二个收获循环以回收剩余量的IgG。类似地，以类似的方式重复另一个循环(总共3个循环)。

图3显示了活细胞密度(VCD)和活力随着培养时间变化的结果图。这些是补料分批培养中的典型曲线，并且通常收获当天的活力在60-85％之间变化。最大VCD为约14E6细胞/mL，收获当天的 VCD为9-10E6细胞/mL。

图4是从第1天到第14天的补料分批培养中蛋白质浓度的图。收获当天蛋白质的最终浓度为约600mg/L，并且其在开始快速收获过程之前用作初始浓度。

图5是细胞比生产力或累积蛋白质随着随时间的细胞生长(即活细胞的积分(IVC))变化的图。IVC和累积蛋白质之间的线性图表明，在整个补料分批过程中，细胞比生产率保持大致相同。

通常在补料分批中，通过离心然后深度过滤来实现收获澄清。这是一个两步过程，因为单独使用深度过滤器目前无法处理高固体进料流(特别是当细胞密度高时)并且通常必须与离心串联使用。此外，深度过滤在按比例扩展和监测压差方面具有局限性。

另一方面，通过使用ATF逐步渗滤，整个过程能够组合成具有较短持续时间的单一步骤。具有0.2μm微过滤器的ATF非常适合于收获补料分批培养物，因为它保留了细胞以及有利于下游工艺的其他小颗粒。使用ATF还可以减少交叉污染，因为收获能够以无菌方式进行。市售的ATF10系统能够为500L和1000L生物反应器提供 ATF灌注，并且能够多次使用以轻松扩展至2000L生物反应器。基于本文所述的数据，使用逐步渗滤的快速收获，蛋白质回收率能够超过95％。

使用ATF逐步渗滤的收获过程的总时间少于8小时。活力没有显著下降表明蛋白质质量在收获过程中没有改变。每次收获循环后得到的活力和IgG浓度显示在下表4中。在每个循环后，从生物反应器收集样品以测量活力和蛋白质浓度。在第一个循环后没有收集样品 (ND＝未测定)。

表4：活力和IgG浓度

两个ATF10生物反应器能够同时运行。每个ATF10的表面积为 11m²，并且当它们同时使用时，总组合面积为22m²。通过将ATF10 设备的数量从2个增加到3个或更多，能够进一步缩短总收获时间。

基于从ATF2到中等尺寸(2.5m²表面积)ATF6到ATF10的表面积，制得下表5。

表5：按比例扩展计算

在这些实验中，成功地证明了使用15LMH通量的6L补料分批生物反应器的ATF2在不到8小时内收获蛋白质，回收96％的产物。将表面积从ATF2(0.13m²)外推至ATF10(11m²)，允许预测，根据本文所述的方法，使用ATF10能够在8小时内快速收获500L 补料分批生物反应器。类似地，使用两个ATF10(总过滤器表面积 (SA)：22m²)能够在8小时内收获1000L补料分批生物反应器。此外，在收获过程中活力损失最小。

2)使用连续渗滤的ATF快速收获-传统的补料分批

为了评估快速收获技术，使用按比例缩小模型(SDM)、再循环方法，使用连接到ATF2的2L补料分批生物反应器来模拟6L补料分批生物反应器。使用利用ATF2的6L生物反应器的数据来外推至使用ATF10的500L和1000L补料分批生物反应器。

类似于先前描述的方法，还进行测试以确定该方法的回收百分比和总收获时间。

图9显示了活细胞密度(VCD)和活力随着培养时间变化的结果图。这些是补料分批培养中的典型曲线，并且通常收获当天的活力在60-85％之间变化。最大VCD为约14E6细胞/mL，收获当天的 VCD为9-10E6细胞/mL。

图10是蛋白质或滴度含量的图，是从第1天到第14天的补料分批培养物中蛋白质浓度的图。收获当天蛋白质的最终浓度是约 600mg/L，并且其在开始快速收获过程之前用作初始浓度。

图11是细胞比生产力或累积蛋白质随着随时间的细胞生长(即活细胞的积分(IVC))变化的图。IVC和累积蛋白质之间的线性图表明，在整个补料分批过程中，细胞比生产率保持相同。

另一方面，通过使用ATF连续渗滤，整个过程能够组合成单一步骤，其持续时间甚至比ATF步骤-渗滤过程更短。具有0.2μm微过滤器的ATF非常适合于收获补料分批培养物，因为它保留了细胞以及其他小颗粒，其的去除对下游工艺是有益的。使用ATF还可以减少交叉污染，因为收获能够以无菌方式进行。本文描述的系统能够例如使用两种或更多种ATF10灌注产品(Repligen，Waltham MA) 按比例扩展至500、1000、1500或2000L。基于本文所述的数据，使用逐步渗滤的快速收获，蛋白质回收率能够优于95％。

使用ATF连续渗滤的收获过程的总时间少于6小时。活力没有显著下降表明蛋白质质量在收获过程中没有改变。

每次收获循环后得到的回收率和IgG浓度显示在下表6中。

表6：回收率和IgG浓度

使用连续渗滤快速收获后蛋白质的回收率示于下表7中。

表7：蛋白质回收率

使用ATF2和ATF6结果的数据外推到更大的ATF10。确定能够使用ATF10在不到6小时内收获500L补料分批生物反应器，并且能够用两个ATF10(总过滤器表面积(SA):22m²)收获1000L补料分批生物反应器。基于从ATF2至ATF6至ATF10的表面积制得表8。

表8：按比例扩展

成功地证明在15LMH通量下使用6L补料分批生物反应器的 ATF2在不到6小时内收获蛋白质，回收率为95％。将表面积从ATF2 (0.13m²)外推至ATF10(11m²)，预测能够使用ATF10可在6 小时内快速收获500L补料分批生物反应器。类似地，能够使用两个 ATF10在6小时内收获1000L补料分批生物反应器。此外，在收获过程中没有显著的活力损失。

3)使用连续渗滤的ATF快速收获-浓缩补料分批

在CFB中，建议仅在VCD小于100E6细胞/mL时降低生物反应器体积。基于从ATF2到ATF6到ATF10的表面积，制成以下两个表格。第一个表格(表9)是在开始连续渗滤过程之前将生物反应器体积减少到50％。第二个表格(表10)没有减少生物反应器体积，即，渗滤从一开始就开始。

表9：利用50％减少的按比例扩展

表10：利用0％减少的按比例扩展

4)使用连续进料的ATF快速收获

开发了具有连续进料和快速收获方法的FB，以使收获时间进一步缩短一半并增加蛋白质产量。这是通过在快速收获之前的低体积连续进料连同高通量快速收获来实现的。在下面描述的实施例中，与目前市售的补料分批收获技术相比，获得了40％的蛋白质产量增加。在使用ATF的连续进料和快速收获方法的这个实施例中，如其他实施例中所述，有11天的常规培养，接着是3天的连续进料/收获(相同的总共14天)，然后仅3小时的快速收获。其他实施方案可以改变连续进料的时间长度或连续进料的体积，以获得细胞活力和总蛋白质产生的类似改进。对于这些测试，使用再循环方法的2L生物反应器用于模拟6L补料分批生物反应器，并且使用再循环方法将通量保持在15LMH。

图15显示了连续进料和传统补料分批的活细胞密度(VCD)和活力随着培养时间变化的结果图。在第11天连续进料和收获开始后， VCD和活力都显示出增加的趋势。图16是两种工艺的细胞比生产力或累积蛋白随着随时间的细胞生长(即活细胞的积分(IVC))变化的图。图17是从第1天到第14天的补料分批培养物中的蛋白质的图，显示与传统的补料分批相比，在第11天开始连续进料和收获后增加的总积累。

表11显示了用于补料分批收获培养的条件。

表11：补料分批条件

每次收获0至3小时后得到的活力显示在下表12中。VCD和活力测量在大约2.7小时进行。

表12：VCD和活力

根据过滤器的表面积(SA)，将以下扩展数据外推ATF2至 ATF10：

表13：利用0％减少的按比例扩展

连续进料和快速收获方法显示出显著的优势。对于此实施例，11 天的常规培养、然后3天的连续进料/收获、然后仅3小时的快速收获，获得通过常规补料分批方法所回收的1.4倍的量的蛋白质。与现有技术相比，能够保持更高细胞活力并产生更高蛋白质产量的方法是显著且有意义的工艺改进。

如图18所示，系统600能够在使用配备有超滤器的ATF的同时执行使用连续进料的方法。系统600的其他元件与先前实施方案中的相同。将产物保留在生物反应器中，并在快速收获阶段收获所有产物。这进一步减少了最终产物合并物的体积，同时仍然获得了增加的产物产率。

外推得到以下按比例扩展数据：

表14：按比例扩展

其他实施方案

应该理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

本发明还包括以下实施方案：

1.一种从细胞培养物中收获细胞产物的方法，所述方法包括：

在起始体积的培养基中培养细胞直到细胞在培养基中已经产生收获浓度的细胞产物，其中所述细胞在包括连接到交替切向流(ATF) 装置的生物反应器的细胞培养系统中培养；

通过ATF装置从生物反应器排出培养基直到培养基体积达到预定的体积，其中所述ATF装置在ATF出口处提供含有细胞产物的液体，并将具有比收获浓度低的细胞产物浓度的培养基返回至所述生物反应器；

从ATF出口抽取含有细胞产物的液体；

用流体培养基再填充生物反应器至等于、高于或低于起始体积的体积；和

重复排出、抽取和再填充步骤中的一个或多个步骤，直到从生物反应器中移出所需量的细胞产物。

2.实施方案1的方法，其中所述预定的体积低于所述起始体积。

3.实施方案1的方法，其中所述预定的体积高于所述起始体积。

4.实施方案1至3中任一项的方法，其中用于再填充所述生物反应器的所述流体培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

5.实施方案1至3中任一项的方法，其中用于再填充所述生物反应器的所述流体培养基包含细胞培养基。

6.实施方案1至5中任一项的方法，其中所述再填充包括同时以等于从所述生物反应器排出所述培养基的速率的速率再填充所述生物反应器。

7.实施方案1至5中任一项的方法，其中所述再填充包括同时以等于从所述ATF出口抽取所述液体的速率的速率再填充所述生物反应器。

8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述排出步骤和所述再填充步骤是顺序进行的。

9.实施方案1至7中任一项的从细胞培养物中收获细胞产物的方法，其中所述再填充步骤和排出步骤进行两次或更多次。

10.实施方案1至9中任一项的方法，其中对于500升至2000升的体积，所述收获花费少于18小时。

11.实施方案10的方法，其中所述收获花费少于6.0小时。

12.实施方案1至11中任一项的方法，其中重复该两个排出步骤直到生物反应器体积达到预定的体积并且所述抽取步骤花费少于2.5 小时。

13.实施方案1至12中任一项的方法，其中所述流体培养基以约2至30升/米²/小时(LMH)的过滤通量排出。

14.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述预定的体积是所述起始体积的5％至30％。

15.实施方案14的方法，其中所述预定的体积是所述起始体积的 10％-20％。

16.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述细胞培养物包含浓缩的补料分批培养物，并且其中所述预定的体积为所述起始体积的约50％。

17.实施方案1-13中任一项的方法，其中所述细胞培养物包含浓缩的补料分批培养物，并且其中所述预定的体积为所述起始体积的约 100％。

18.实施方案1至13中任一项的方法，其中基于所述培养基中的细胞浓度确定所述预定的体积。

19.实施方案1至18中任一项的方法，其中所述ATF装置包括中空纤维过滤器。

20.实施方案19的方法，其中所述过滤器的孔径为约0.1至5.0 微米或约500至1000kD。

21.实施方案1至20中任一项的方法，其中所述排出步骤、抽取步骤和再填充步骤同时并以第一流速进行。

22.实施方案1至21中任一项的方法，其中所述排出步骤、抽取步骤和再填充步骤在所述细胞已经产生待在细胞培养过程结束时收获的所有细胞产物之前开始。

23.实施方案22的方法，其中所述排出步骤、抽取步骤和再填充步骤在细胞在流体培养基中已经产生收获浓度的细胞产物之前1至8 天开始。

24.实施方案1至23中任一项的方法，其中抽取和再填充体积小于约1.0的每天交换的容器体积(VVD)。

25.实施方案24的方法，其中所述抽取和再填充体积小于约0.5 VVD。

26.实施方案21至25中任一项的方法，其中最终收获步骤以不同于所述第一流速的第二流速进行。

27.实施方案1至26中任一项的方法，其中最终排出步骤导致在所述生物反应器中剩余小于约20％的起始体积。

28.实施方案1至27中任一项的方法，其中所述细胞培养物是补料分批细胞培养物。

29.实施方案1至27中任一项的方法，其中所述细胞培养物是浓缩的补料分批细胞培养物。

30.实施方案1至29中任一项的方法，其中所述细胞产物是单克隆抗体、酶或病毒。

31.一种系统，其包括：

包括入口和出口的生物反应器；

连接到生物反应器入口的不含细胞产物的流体培养基源；

连接到生物反应器出口的交替切向流(ATF)装置；

连接到ATF装置的出口并配置成从ATF装置移出流体的泵；和

控制器，其被布置和编程为：

在生物反应器的起始体积的培养基中培养细胞直到细胞在培养基中已经产生收获浓度的细胞产物，通过ATF装置从生物反应器排出培养基直到培养基体积达到预定的体积，其中所述ATF装置在 ATF出口处提供含有细胞产物的液体，并将具有比收获浓度低的细胞产物浓度的培养基返回至所述生物反应器，从ATF装置出口抽取含有细胞产物的液体，用流体培养基再填充生物反应器至等于、高于或低于起始体积的体积，并重复排出、抽取和再填充步骤中的一个或多个步骤，直到从生物反应器中移出所需量的细胞产物。

32.实施方案31的系统，其中所述控制器被配置成顺序地排出和再填充所述生物反应器。

33.实施方案31的系统，其中所述ATF装置包括中空纤维过滤器。

34.实施方案33的系统，其中所述过滤器的孔径为约0.1至5.0 微米或约500至1000kD。

35.实施方案31的系统，其中所述控制器被布置和编程为同时以等于从所述ATF出口抽取所述液体的速率的速率再填充所述生物反应器。

36.实施方案31的系统，其中，所述控制器被布置和编程为以大约2至30升/米²/小时(LMH)的过滤器通量排出所述流体培养基。

37.实施方案31的系统，其中，所述控制器被布置和编程为将所述预定的体积设定为所述起始体积的5％至30％。

Claims

在起始体积的培养基中培养细胞直到细胞在培养基中已经产生收获浓度的细胞产物，其中所述细胞在包括连接到交替切向流(ATF)装置的生物反应器的细胞培养系统中培养；

从ATF出口抽取含有细胞产物的液体；

2.权利要求1的方法，其中所述预定的体积低于所述起始体积。

3.权利要求1的方法，其中所述预定的体积高于所述起始体积。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中用于再填充所述生物反应器的所述流体培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中用于再填充所述生物反应器的所述流体培养基包含细胞培养基。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述再填充包括同时以等于从所述生物反应器排出所述培养基的速率的速率再填充所述生物反应器。

7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述再填充包括同时以等于从所述ATF出口抽取所述液体的速率的速率再填充所述生物反应器。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述排出步骤和所述再填充步骤是顺序进行的。

9.权利要求1至7中任一项的从细胞培养物中收获细胞产物的方法，其中所述再填充步骤和排出步骤进行两次或更多次。

10.一种系统，其包括：

包括入口和出口的生物反应器；

连接到生物反应器入口的不含细胞产物的流体培养基源；

连接到生物反应器出口的交替切向流(ATF)装置；

连接到ATF装置的出口并配置成从ATF装置移出流体的泵；和

控制器，其被布置和编程为：

在生物反应器的起始体积的培养基中培养细胞直到细胞在培养基中已经产生收获浓度的细胞产物，通过ATF装置从生物反应器排出培养基直到培养基体积达到预定的体积，其中所述ATF装置在ATF出口处提供含有细胞产物的液体，并将具有比收获浓度低的细胞产物浓度的培养基返回至所述生物反应器，从ATF装置出口抽取含有细胞产物的液体，用流体培养基再填充生物反应器至等于、高于或低于起始体积的体积，并重复排出、抽取和再填充步骤中的一个或多个步骤，直到从生物反应器中移出所需量的细胞产物。