CN111770986A - 用于制备生物分子（如病毒疫苗）的系统和方法 - Google Patents

用于制备生物分子（如病毒疫苗）的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供涉及一种制备生物分子的系统，包括生物反应器(1)，其包括适合接收含细胞和病毒颗粒的液体的腔室；和浓缩器(2)，其中所述浓缩器配备适合收集渗余物的渗余物管道(300，303)，方便将所述渗余物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器(4)的输入口。在第二方面和第三方面，本发明涉及一种制备生物分子的方法及所公开系统用于制备生物分子的用途。

Description

用于制备生物分子（如病毒疫苗）的系统和方法
技术领域
本发明涉及制备病毒疫苗的技术领域，并且描述了制备病毒疫苗的系统和方法。
背景技术
由于许多疾病是由致病菌和病毒引发的，因此，对于高效制备生物分子(如抗体和病毒) 的需求巨大。
从培养细胞纯化生物分子(特别是病毒)的传统方法工作量大，耗时长，导致生物分子的制备成本太高。为了获得适合临床施用的产品，需要快速有效的从培养细胞制备生物分子 (例如，病毒或病毒蛋白质)的方法。
本公开的目的是解决上面提到的至少一些问题。本公开提供一种适合纯化生物分子的系统，可以最大限度地减少生物分子的损耗，确保在有限的空间内实现较高的生物分子质量。其次，本公开还有一个目的是提供一种操作步骤有限、生物分子收率较高、运行费用(OPEX) 显著降低且防护水平较高的方法。
发明内容
本公开提供根据权利要求1所述制备生物分子的系统。更具体地说，本公开提供一种制备生物分子的系统，其包括生物反应器，该生物反应器包括适合接收含细胞和病毒颗粒的液体的腔室；以及浓缩器，其中所述浓缩器配备适合收集渗余物的渗余物管道，使所述渗余物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器的输入口。
第二方面，本公开提供根据权利要求18所述的方法。更具体地说，本公开提供一种生物分子的制备方法，其中所述生物分子是在生物反应器中制备的，该生物反应器包含含细胞的液体，所述方法包括浓缩步骤，其中来自所述生物反应器的输出物在浓缩器内进行浓缩并且其中来自所述浓缩器的输出物被再循环到所述生物反应器或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器。
另一方面，本公开提供根据权利要求31所述的用于纯化生物分子的系统的用途。更具体地说，本公开提供根据权利要求1至17任一项所述的用于制备病毒和/或病毒疫苗的系统的用途。
定义
除非特别规定，本发明使用的所有术语(包括技术名词和科学术语)的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。通过进一步指导，所包括的术语定义是为了更好地理解本发明的教导。
如本文所使用的，所述下述术语具有以下含义：
除非上下文清楚表明，否则本文所使用的所述“一”、“一个”及“所述”指单数和复数指代。举例来说，“一腔室”指一个或多个腔室。
针对可测量值(例如参数、数量、时距等)本文所使用的“大约”指包括规定值的以及自规定值起+/-20％或以下的变化，优选地+/-10％或以下，更优选地+/-5％或以下，甚至更优选地+/-1％或以下，以及进一步更优选地+/-0.1％或以下，这些范围内的所述变化适合在本发明中执行。但是，应该理解的是，修饰语“大约”所指的数值本身也是具体公开的。
如本文所使用的，“包括”(“comprise”,“comprising”,and“comprises”and“comprised of”) 与“包含”(“include”,“including”,“includes”)或含有(“contain”,“containing”,“contains”)是同义词，是包含式或开放式术语，其规定存在该词语后的内容(例如，组分)的存在且并不排除或排斥本领域已知或公开的其它的、未引用组分、特征、元素、构件、步骤的存在。
通过端点引用的数值范围包括所述范围内的所有数值和分数，以及所引用的端点。
除非另外声明，本文及整个说明中所使用的表达“％重量”、“重量百分数”、“％wt”或“wt％”指各组分占配方总重量的相对重量。
“生物分子”指在生物反应器中制备的任何目标生物材料。生物分子包括，例如，病毒、病毒类颗粒、病毒产品、蛋白质(如抗体)、碳水化合物、脂质、核酸、代谢物和肽。
“抗体”指来源于人类或其它动物细胞系的任何单克隆或多克隆免疫球蛋白分子、抗原- 结合免疫球蛋白片段或免疫球蛋白融合蛋白，包括天然或基因修饰形式，如人源化抗体、人源性抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂种抗体、突变抗体、移植抗体及体外产生的抗体。人们通常熟悉的天然免疫球蛋白抗体包括IgA(双价抗体)、IgG、IgE、IgG和IgM(五聚抗体)。
“病毒”或“病毒粒子”指仅在活宿主(主要是细菌、植物和动物)细胞内复制的超显微(直径大约20至300nm)的感染原(infectious agent)：由RNA或DNA核、蛋白质外壳组成，在更复杂的类型中，还包括包裹的包膜。
“生物反应器”指支持生物活性环境的任何装置或系统，例如，用于培养制备生物产品的细胞或生物体。生物反应器包括多层细胞培养器(cell stack)、滚瓶、摇瓶、烧瓶、搅拌槽悬浮生物反应器、高细胞密度固定床灌注式生物反应器等。
“纯化”指相对于目标生物分子浓度，大幅降低一种或多种目标杂质或污染物的浓度。
“切向流过滤(TFF)”指一种膜过滤方法，其中流体被强制通过由一层或多层多孔膜限制的空间，其中滤液或“渗透液”中足够小的分子通过孔被脱除，而足够大的分子无法通过孔而留在“渗余物”内。切向流特别指流体流动方向与膜大体上平行，与此相反的是其中流动与膜大体上垂直的所谓死端式过滤(dead-end filtration)。
如本文所使用的，所述“病毒感染”指病毒侵入到细胞内，然后病毒在细胞内复制。
“细胞培养收获液”、“培养收获液”和“收获液”是同义词，指从生物反应器内的培养细胞得到的未澄清的细胞培养液。培养细胞或生长细胞亦称为宿主细胞。
“串联、顺序连接”指装置或设备的连接方式为：一个单元或装置的流出物不经中间储存直接送入到后面的单元或装置中。
本文所使用的“隔离器”或“柜”指用于安全操作生物材料的通风实验室工作空间。“隔离器”包括用于封闭被(或可能被)病原体污染的材料的密闭隔离器，用于封闭被(或可能被)病原体污染的材料和防止产品(例如，纯化的目标生物分子)被污染的密闭生物安全柜，及防止产品(例如，纯化的目标生物分子)被污染的层流柜。
附图说明
图1示出了本公开一实施例的制备生物分子的系统的示意图。
图2A示出了本公开另一实施例的制备生物分子的系统的示意图。
图2B示出了能够执行图2A所示方案的系统的实施例。
图3示出了本公开另一实施例的制备和纯化生物分子的系统的示意图。
图4示出了本公开另一实施例的制备和纯化生物分子的系统的示意图。
图5和图6示出了本公开实施例的制备生物分子的系统的代表。
具体实施方式
本发明涉及一种纯化生物分子(如蛋白质或病毒)的系统和方法。
第一方面，本公开提供一种制备生物分子的系统，包括生物反应器，其包括适合接收含细胞和病毒颗粒的液体的腔室；和浓缩器，其中所述浓缩器配备渗余物输出管，其收集浓缩器输出物并使所述输出物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器的输入口。
另一方面，本发明提供一种制备生物分子的系统，包括生物反应器、浓缩器和中间容器，其中生物反应器包括适合接收含目标生物分子的液体的腔室，中间容器包括含浓度高于生物反应器中目标生物分子浓度的目标生物分子细胞培养收获液。
该系统集成了强化技术，从而显著缩小了每个腔室的规格，从而使生产和纯化系统占用空间较少。生物分子的生产和纯化可以作为基于此系统的连续自动化工艺执行：从细胞培养到最终产品纯化，最大限度地减少了人为干预。所述工艺强化和集成将所有腔室容纳在一隔离器内，确保了工艺操作人员和环境的安全。所述系统占用空间较少。在一些实施例中，系统的占用空间小于大约50m2、40m2、30m2、20m2、10m2、5m2或更小。在一些实施例中，系统的占用空间是大约5m2至10m2、5m2至20m2、5至30m2、5至40m2、5至50m2。在一示例中，所述占用空间小于10m2。例如，7m2系统每批可以制备至少50万剂病毒疫苗，或每年大约107剂。因此，这种自动工艺通过大幅降低产品成本及资本支出，对生物分子制备的经济效益具有显著影响。
本公开制备生物分子的系统可以缩小工业级生物分子制备所需基础设施的规模，从而还可以降低易耗品的用量。所述系统易耗品降低量大于或等于大约10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或更多。所述系统易耗品降低量是大约10％至20％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％。所述系统进一步能够以安全、高效、经济的方式纯化生物分子。
本发明系统能够采用规格比现有技术系统相比明显更小的设备快速制备和纯化生物分子，如重组蛋白、病毒或病毒产品。此外，采用所述系统能够实现生物分子的高收率，从而降低最终产品的成本。目标生物分子的回收率大于或等于65％、70％、75％、80％、85％、90％。这一点最终降低了投资和生产成本，这是一个相当大的优势。
所述系统包括至少一个用于细胞培养和/或细胞产品制备的生物反应器。在一个实施例中，所述生物反应器是单用途生物反应器。在另一个实施例中，所述生物反应器是可以高压蒸汽处理的。所述系统设计用于培养粘附细胞以及非粘附细胞。在一个实施例中，所述生物反应器是间歇生物反应器。在另一个实施例中，所述生物反应器是灌注式生物反应器。在一个灌注式生物反应器中，向生物反应器同时加入和移出等量培养基，而细胞被留在生物反应器内。这样提供了稳定的新鲜营养物质来源，且稳定移出细胞(废)产品。与传统生物反应器相比，灌注式生物反应器可以实现高得多的细胞密度，从而提高体积生产能力。此外，灌注式生物反应器能够在脱除培养基过程期间连续收获分泌产品。所述生物反应器优选是固定床灌注式生物反应器。固定床配置能够在系统中实现更高的细胞密度培养，可以使用比传统生物反应器更小的生物反应器。所述生物反应器很容易实现至少5000万个细胞/ml的细胞密度。因此，所述系统采用比传统生物反应器小的生物反应器，且不会影响生物反应器的高密度细胞培养能力。因此，采用所述生物反应器能够减少系统所需空间。由于采用这种类型的生物反应器，细胞培养增强，因此，所述系统配备的是高细胞密度生物反应器，其体积足够小，能够放置在隔离器内。在另一个实施例中，所述系统配备适合按间歇模式和灌注模式都可以操作的生物反应器。由于这种系统中的生物反应器适合制备和纯化工艺的特定步骤，例如，所述生物反应器在接种期间可以采用间歇模式操作，在细胞生长期间采用灌注模式操作，因此非常有利。在另一个实施例中，所述系统包括至少2、3、4、5、6、8、10或更多个生物反应器。
在另一个实施例中，本公开的系统包括生物反应器和浓缩器。所述浓缩器通过减少系统中液体的总体积但并不减少液体中目标分子的含量，从而提高液体中目标生物分子的含量。因此，由于本公开系统中安装的浓缩器能够减少液体体积，因而进一步减少了所述系统占据的空间。所述浓缩器优选包括过滤装置或体积排阻色谱装置。
在本公开系统中，所述浓缩器配备渗余物管道，适合用于收集含有最大分数目标生物分子的渗余物，并将渗余物再循环到生物反应器的输入口或位于浓缩器和生物反应器之间的中间容器的输入口。因此，本公开系统能够将浓缩的渗余物再循环，通过将渗余物再循环通过同一浓缩器而进一步浓缩生物分子。在一个实施例中，所述液体再循环通过所述浓缩器至少 5次，优选至少10次，更优选至少15次，最优选直到达到期望的细胞培养收获液减少量。由于渗余物再循环，得到了高度浓缩的生物分子产品，因此，这种配置使所述系统能够减少需要的下游工艺数量。在一个实施例中，所述系统的管道包括泵、阀门及流量计或传感器，用于控制和监测，例如，浓缩器至生物反应器和/或中间容器的液体流量。在一个实施例中，所述系统的管道，例如，渗余物管道，包括检测器(例如，光学检测器)。在一个实施例中，所述检测器可以监测管道中输送的细胞、目标生物分子和/或污染物的量。
中间容器的体积优选适合生物反应器的体积。包含浓缩目标生物分子的渗余物最终在中间容器中收获。例如，当所述系统配备容积大约10L的生物反应器，在灌注模式中，使用300 L培养基，则所述系统优选配备体积大约10L的中间容器。
在一个实施例中，所述生物反应器和浓缩器通过管道连接，方便将液体从所述生物反应器输送至所述浓缩器。或者，当系统中包含中间容器时，所述生物反应器和中间容器通过管道连接，方便将液体从所述生物反应器输送到所述中间容器。此外，所述中间容器和浓缩器也通过管道连接，将液体从中间容器输送到浓缩器。最后，还配备方便将液体从浓缩器输送到生物反应器的管道。在一个实施例中，所述中间容器可以是单用途一次性容器或可以是可高压蒸汽处理的容器。
所述系统的浓缩器可以从本领域技术人员熟悉，并且适合减少含目标生物分子的液体体积的多种设备中选择。在一些实施例中，所述浓缩器包括一种类型的浓缩设备(例如，切向流过滤器)。在一些实施例中，所述浓缩器包括不止一种类型的浓缩设备(例如，切向流过滤器和死端过滤器)。这些设备中的大多数设备都是基于过滤和/或体积排阻色谱。在一个实施例中，所述浓缩器是过滤设备，更优选是微滤设备，或超滤设备或微滤和超滤设备的组合。当所述系统配备超滤设备，减少含目标生物分子的液体的体积时，所述设备的膜适合让水和低分子量溶质(通常称为渗透液)通过，而大分子，如生物分子被截留在膜上面的渗余物中。在另一个实施例中，所述系统配备切向流过滤设备(TFF)。在一个实施例中，所述TFF配备至少一个有孔中空纤维，孔隙度足够基本上截留所有目标生物分子，同时允许更小的污染物，如生长培养基和溶质，通过所述膜的孔。与液体通过膜或床，固体被截留在过滤器上的死端过滤相反，TFF设备在过滤器表面允许切向流，而不是直接通过过滤器。因此，避免了在TFF 内形成滤饼。在另一个实施例中，所述TFF可以配备一个允许切向流过滤的盒子。在另一个实施例中，所述TFF是单程切向流过滤(SP-TFF)。该设备在纯化蛋白质(如抗体)时特别有优势。
如上所述，所述系统配备渗余物管道，调节渗余物再循环到所述生物反应器的输入口或中间容器的输入口。将TFF设备作为系统浓缩器的另一个优点是TFF设备适合连续灌注工艺操作。这样可以大量浓缩培养液。例如，当从内部生长面积(指用于细胞生长的表面积)500m2的固定床灌注式生物反应器开始时，所述系统能够将所述体积的培养液浓缩到50L的最终体积。这相当于经典1000L微载体培养或6000个滚瓶培养，与现有技术相比，不止减少了系统的占用空间，而且实现了显著改进。系统规模缩小，能够在高度密闭的消毒环境中开展生物分子生产，确保操作无菌。
在一个实施例中，所述系统的管道配备一台或多台泵，用于提供定向液体流动，控制或引起系统不同部分之间压差。在另一个实施例中，所述泵可以正向操作和反向操作。在另一个实施例中，所述系统的管道优选配备一台或多台泵，使液体以交叉流方式通过浓缩器。
此处公开的所述系统的管道，可以配备传感器，用于测定对细胞生长和纯化工艺非常重要的参数，这些参数包括但不限于液体流量、温度、pH、氧饱和度和压力。此外，所述系统的管道可以配备阀门，用于控制流量分布。所述阀门进一步能够连接或断开特定系统段或管道。在一些实施例中，所述阀门是计量阀或离散阀(例如，开或关阀)。在一个实施例中，所述阀门是离散阀。在一些实施例中，所述阀门允许从各管道中采取液体样品，例如，用于质量控制目的。
在一个实施例中，所述系统在生物反应器和浓缩器之间配备预过滤器。在一些实施例中，所述系统包括至少1、2、3、4、5、6、8、10个或更多个预过滤器。在一些实施例中，所述这些预过滤器具有相同的孔隙度或不同的孔隙度。在一个实例中，所述系统具有至少2个不同孔隙度的预过滤器。所述预过滤器防止浓缩器堵塞。所述预过滤器的孔径优选是至少50um，至少75um，至少100um，至少125um，以及至多250um，至多200um，至多175um，至多150um。在一个优选的实施例中，所述过滤器的孔径是125um。孔径小于50um将无法达到足够的液体流速，而孔径大于250um将存在让含颗粒液体通过而可能堵塞系统的风险。在一个实施例中，预过滤器的孔径明显大于生物分子，其尺寸设计为可以截留细胞碎片和聚集体。在一个实施例中，所述预过滤器可以是TFF，其中比所述目标生物分子大的颗粒被截留，而更小的颗粒，包括生物分子，将通过所述TFF。在另一个实施例中，所述预过滤器可以是吸附系统，例如，基于色谱的吸附系统。
当所述系统中包括中间容器时，上述预过滤器优选位于所述生物反应器和所述中间容器之间。因此，所述系统使位于中间容器和浓缩器之间的管道不含颗粒，这些颗粒因其尺寸可能堵塞浓缩器。
系统中产生的不期望的材料或工艺副产品可以临时储存在除污容器中。所述系统可以包括一个或多个除污容器，可配备合适的管道，例如，从浓缩器至除污容器的输出管道线，从而用于排出渗透液。在一些实施例中，所述系统包括至少1、2、3、4、5、6、8、10个或更多个除污容器。另一个实例是从生物反应器至除污容器配备输出管道线，在开始制备生物分子之前(例如，细胞病毒感染之前)排出液体。
除生物分子制备和纯化之外(例如，上游制备工艺)，所述系统可进一步包括适合执行下游制备工艺的设备。另外，本发明所述系统可以包括澄清室。所述澄清室不需要与上述设备 (例如，生物反应器和浓缩器)物理隔开，并将与后者流体连接。澄清可视为下游处理的第一个步骤，确保来自前面收获的渗余物中脱除细胞碎片和其它污染物。在一些实施例中，所述澄清室包括至少1、2、3、4、5、6、8、10个或更多个过滤器。在一些实施例中，所述澄清室包括一种类型的过滤器。在一些实施例中，所述澄清室包括多种类型的过滤器。在其它实施例中，所述澄清室包括一个或多个过滤器，选自深层过滤器、以硅藻土为助滤剂的过滤器、微滤器和功能性过滤器，如基于阴离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水作用色谱和混合模式色谱的过滤器。在一个实例中，所述澄清室包括阴离子交换深层过滤器和微滤设备。澄清用于脱除残留的细胞培养杂质，如宿主细胞DNA和蛋白质残留。因此，这种装置能够脱除产品中残留的固体污染物，从而确保后续纯化室正确发挥功能。由于采用其中渗余物从浓缩器再循环到生物反应器或中间容器的上述浓缩步骤，澄清室规格将更小(与现有技术相比)，澄清室操作紧凑，处理时间缩短，从而有益于生物分子制备和纯化工艺的总经济效益。在一些实施例中，与不含浓缩器的系统相比，所述澄清室缩小至少50％、75％、80％、85％。因此，采用包含浓缩器的系统，能够将澄清室的规格缩小至无浓缩器系统所需规格的至多80％、 60％、50％、40％、30％、20％。
在另一个或其它实施例中，当前公开的系统包括色谱室，其中所述色谱室和澄清室通过管道连接，方便将液体从澄清室输送至色谱室。所述色谱室进一步纯化目标生物分子，并包括至少一台色谱装置。在一个实施例中，所述色谱室包括具有较高结合能力且能够在数量有限的周期内处理大量输入体积的单台色谱装置。在一些实施例中，所述色谱装置比无浓缩器系统中的色谱装置小至少50％、75％、80％、85％。因此，采用含浓缩器的系统，能够将色谱装置的规格缩小至无浓缩器系统所需规格的至多80％、60％、50％、40％、30％、20％。在一个实施例中，所述色谱室包括吸收器系统和/或一台或多台串联的切向流过滤设备。在另一个实施例中，所述色谱室包括适合连续模式操作的混合模式色谱膜。由于所公开的系统第一部分所确保的体积缩小，与现有技术的系统相比，色谱室内所需色谱膜的体积更小。因此，所述系统能够削减与昂贵的大型色谱装置有关的费用。此外，在现有技术中，生物分子的制备和纯化系统通常需要两台串联的色谱装置，与此相比，本发明的系统在色谱室内仅需单步色谱装置即可确保相当的生物分子纯度和收率。这样大幅减少了生物分子制备所占用的空间、明显降低了生产成本及显著缩短了生产时间，从而提高了生产能力，同时，可以在整个系统内维持较低的工艺体积(process volume)。例如，本领域占用空间5000m2的传统的脊髓灰质炎疫苗生产系统，其生产能力是6000万剂/年，生产成本是1.2-1.5美元/剂，处理时间是至少 5周。根据本发明的一个实施例，生产脊髓灰质炎疫苗的系统占用空间1500m2，其生产能力是4000万剂/年，生产成本是0.22美元/剂，处理时间是大约3周。
在一个实施例中，本发明系统制备和纯化的生物分子是纯化的灭活病毒。因此，所述系统还配备病毒灭活室，其中所述病毒灭活室和色谱室通过管道连接，方便将液体从色谱室输送到病毒灭活室。在一个实施例中，所述目标生物分子是病毒颗粒，病毒灭活是通过将色谱纯化后的病毒采用甲醛稀释后实现的。
在一个实施例中，所述从生物反应器至浓缩器的工艺流程通过过程控制器或过程控制装置控制。所述控制器控制和操作生物反应器参数以及工艺流程参数，监测和记录上述一个或多个传感器的数据(pH、温度和/或DO)。此外，所述控制器控制浓缩器的功能及渗余物在浓缩器至中间容器的往复再循环。为此，所述控制器配备能够监测、控制和记录工艺流程和系统参数的软件。所述控制器能够管理通过所述系统后面部件的液体流量，从而控制目标生物分子的制备和纯化。液体流量优选由系统中的控制器控制其中泵和/或阀门的运行进行管理。在一个实施例中，所述过程控制装置自动控制系统的工艺流程。
通过与控制器连接的计算机，用户可以访问控制器。所述控制器能够通过一个或多个数据传输装置输出数据，这些数据传输装置可以是无线的，如Wifi或蓝牙连接，或者有线的，如所述控制器上的USB连接。在另一个或其它实施例中，控制器的数据连接允许访问IT网络。在另一个实施例中，屏幕与控制器连接，使系统用户或操作人员能够跟踪工艺流程和测定的参数，以及例如，通过启动或停止某些子过程，手动操作系统。
在另一个或其它实施例中，所述控制器可以集成在坞站内，坞站内包括上述生物反应器 (1)、浓缩器(2)和中间容器(4)。当系统包含控制器时，在坞站内集成控制器可以保持系统紧凑。
由于本发明系统中每个腔室的优化，每个腔室结构紧凑，使系统的所有腔室都可以集成在单个柜、隔离器或密闭罩内。当采用这种系统时，这一点不仅减少了所需空间，而且还增强了安全性。此外，各腔室之间的连接使制备和纯化步骤无需离开密闭罩，从而确保最大限度地降低了安全风险。
在另一个或其它实施例中，这种系统的紧凑结构进一步使系统可作为便携式系统，用于生物分子制备和纯化系统，例如，放在容器内或拖车内。因此，本发明的系统可以是移动系统。在另一个或其它实施例中，平台的各腔室也可以移动，例如，将每个腔室或隔离器放在移动撬上。在另一个实施例中，所述系统可以按模块方式组装。
在另一个或其它实施例中，所述系统进一步包括密闭罩，其中本文公开的一个或多个腔室、隔离器和/或系统都被容纳在所述密闭罩内。在一些实施例中，这种密闭罩配备至少一个入口及至少一个出口，使用者和/或材料通过所述入口进入所述密闭罩内，通过所述出口离开所述密闭罩。所述密闭罩的入口和出口通过收集、监测和/或记录有关所述系统各腔室所执行行动数据的过程控制装置或过程控制器自动打开或关闭。所述过程控制器根据过程产生的输入信号，例如，终止某项任务(例如，病毒灭活)来锁定或解锁入口或出口。密闭罩进出口出入的自动控制保证了仅在安全条件下打开密闭罩。在一个实施例中，所述系统包括多台控制装置。在另一个或其它实施例中，所述系统的各腔室放在密闭罩内的隔离器中。这些被隔开的各腔室可以通过这些隔离器之间的隔断彼此连接或隔开，当采用这些隔断时，它们可以处于打开配置或关闭配置。在打开配置中，可以从一个隔离器进入另一个隔离器。通过打开和关闭所述隔断，从而调控在这些隔离器内和/或隔离器之间的出入。在另一个实施例中，所述各腔室放在单个隔离器中，并通过隔断彼此隔开，隔断可以处于打开和关闭配置，从而允许或阻隔材料或流体从一个隔离器至其它隔离器的进出和输送。所述隔断的打开和关闭也可以通过过程产生的输入信号，例如，终止某项任务(例如，病毒灭活)，由过程控制装置或过程控制器自动控制，从而进一步确保系统的安全使用。所述隔断可以配备允许管道(如管道或管线)穿过的开孔。
所述隔断和/或入口和/或出口可以采用高强度材料制造，例如，采用铝、不锈钢、玻璃纤维或任何其它合适的材料制造。所述隔断和/或入口和/或出口可以包括升降门、摇摆门、百叶门或滑动门，且可以包括玻璃板或Plexiglas板。隔离器和密闭罩系统按照欧洲和美国标准制造和装配，将内部环境与外部环境隔开。
可以提供合适的访问机制来打开隔断和/或入口和/或出口，例如，锁和钥匙机制、密码、凸模压板、刷卡机、应答器阅读器、指纹扫描仪、视网膜扫描仪、传感器、自动识别和数据采集方法，如射频识别(RFID)、生物测量方法(如虹膜和面部识别系统)、磁条、光学字符识别(OCR)、智能卡和声音识别，或任何其它访问机制。
进入系统的使用者最好是留在隔离的各腔室外面。为了采集用于质量控制程序的样品，在一个实施例中，被隔离的各腔室配备软套，使用者通过软套，可以限制性间接进入腔室内，腔室内内容物与使用者仍然是相隔的。这些进一步的封闭和隔离措施使系统能够用于制备和纯化对使用者构成高风险的生物分子。例如，所述系统适合用于纯化制备由灭活纯化病毒组成的疫苗所需的大量活病毒。对于后者，需要采用BSL-3高级别防护。
将隔离器和密闭罩作为系统的一部分集成，能够以更简单且成本更低的方式满足生物安全规则要求，降低了污染环境和操作人员的风险。
在一个实施例中，所述制备生物分子的系统包括：
-上游工艺室，包括固定床灌注式生物反应器，所述生物反应器包括适合接收含细胞液体的腔室；及浓缩器，优选TFF，其中所述浓缩器配备渗余物管道，适合用于收集液体输出物，如来自所述浓缩器的渗余物，并将所述液体输出物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器的输入口；
-澄清室；
-色谱室；及
-任选地病毒灭活室；
其中所述各腔室位于一个或多个隔离器内。在一些实施例中，所述各腔室位于至少1、2、 3、4、5、6、8、10个或更多个隔离器内。在一些实施例中，所述隔离器可能包含单个腔室或不止一个腔室。
在一个实例中，所述系统至少包括第一隔离器，其包括上游工艺；及第二隔离器，其包括下游工艺，其中所述第二隔离器包括澄清室和色谱室。
优选地，所述系统包括至少三个隔离器：第一隔离器将包括所述上游工艺；第二隔离器包括所述澄清室和色谱室，第三隔离器包括所述灭活室。所述第一隔离器优选与所述第二隔离器流体连接，所述第二隔离器优选与所述第三隔离器流体连接。
此外，所述隔离器可以通过隔断与另一个隔离器连接或分开，其中所述隔断可以处于打开或关闭配置。这一点在上文中已经进行了广泛讨论。
在最后的实施例中，所述隔离器将放在上文所述密闭罩内。
在一个实施例中，本发明提供一种制备病毒的系统，包括：固定床灌注式生物反应器，包含适合接收含细胞和病毒颗粒的液体的腔室；中空纤维切向流过滤(TFF)装置，其中所述TFF配备渗余物管道，适合用于收集所述渗余物，且方便将渗余物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述TFF和所述生物反应器之间的中间容器的输入口。
第二方面，本发明提供制备生物分子的方法，其中所述生物分子是在装有含细胞的液体的生物反应器中制备，所述方法包括浓缩步骤，其中所述生物反应器的输出物在浓缩器内进行浓缩，其中所述浓缩器的输出物再循环到所述生物反应器或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器。对熟悉本领域的技术人员来说，实施例中描述的所述系统适合执行所述方法是显而易见的。
在一个实施例中，本发明制备生物分子的方法采用安装在系统管道上的泵和阀门，引导液体定向流过系统，使系统不同各段可逆地连接和断开。在一些实施例中，本发明方法的浓缩器使用超滤装置。为了避免浓缩器内的超滤装置堵塞，液体首先通过预过滤器，脱除其中较大的固体颗粒，但目标生物分子能够透过。在一些实施例中，预过滤器的孔径是大约125 μm，截留分子量是大约100kDa。在一个所述方法的实施例中，优选将所述再循环的渗余物收集在中间容器内进行收获，从而获得浓缩的细胞培养收获液。在一个实施例中，部分系统，如生物反应器和中间容器，可以配备一个或多个传感器，用于测定，例如，pH、温度和溶解氧，但是并不限于这些。因此，所述生物反应器和中间容器可以控制浓缩细胞培养收获液的 pH和温度。
任选地，将浓缩细胞培养收获液的pH调节到下游工艺要求的数值。此外，还可以任选对浓缩细胞培养收获液执行核酸内切酶处理，降解浓缩细胞培养收获液中的DNA和RNA，同时保持蛋白质完好无损。核酸内切酶处理步骤可以防止浓缩细胞培养收获液聚集，从而为进一步的下游处理提供最佳条件。
在一个实施例中，所述方法进一步包括下游处理步骤，包括澄清浓缩细胞培养收获液，从而得到澄清的细胞培养收获液，和/或后续对澄清的细胞培养收获液执行色谱步骤，纯化所需的生物分子。
如上所述，由于所需设备非常紧凑，从而可以在隔离器内，甚至在密闭罩内执行，因此，本发明公开的方法可以在空间有限的地方执行。因此，本发明方法特别适合纯化生物分子，如蛋白质(抗体)和病毒。在后一种情况中，所述方法进一步包括对纯化病毒产品执行病毒灭活步骤，优选采用灭活组合物处理病毒。灭活组合物选自甲醛、至少一种清洁剂、至少一种酸或它们的任何组合。其它灭活组合物可能包括过硫酸钾溶液(商业上称为
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)、氢氧化钠或漂白剂。病毒灭活优选采用甲醛或福尔马林。因此，在所述方法的其它优选实施例中，纯化的生物分子是用于配制疫苗的纯化灭活病毒，如灭活脊髓灰质炎病毒疫苗。本发明的所述方法特别适合用于制备和纯化病毒或灭活病毒颗粒生物分子。
本发明描述的方法和系统确保实现了非常高的安全级别，使用所述方法和系统时存在的健康或环境风险度非常低。因此，另一方面，本发明涉及使用上述系统用于制备病毒和/或病毒疫苗的用途。
本发明并不限于前面所述设计的任何形式，可以对所示实例进行某些改动，并不需要对所附权利要求重新进行评估。例如，以脊髓灰质炎病毒疫苗为参考对本发明进行了描述，但是，显然，本发明可应用于，例如轮状病毒疫苗或狂犬病疫苗。
附图详细说明
图1示出了根据本发明实施例的用于制备生物分子的系统的示意图。
所述示意图示出了一种用于制备生物分子的系统，包括：生物反应器(1)，其包括细胞培养液，其中细胞培养液可以包括含细胞和病毒颗粒的液体；和浓缩器(2)，其中所述浓缩器配备渗余物输出管(300)，其收集浓缩器输出物并将所述输出物再循环到所述生物反应器 (1)的输入口。所述生物反应器(1)和浓缩器(2)通过管道(301)连接，方便将液体从所述生物反应器(1)输送至所述浓缩器(2)。为了避免浓缩器(2)堵塞，所述液体首先通过预过滤器(7)脱除其中较大的固体颗粒，但目标生物分子能够透过。所述系统的管道配备泵(5)以提供定向液体流动，控制或引起系统不同部分之间的压差，使液体以交叉流方式通过浓缩器(2)。此外，所述系统的管道可以配备阀门(6)控制流量分布。所述阀门进一步能够连接或断开特定系统段或管道。最后，配备从浓缩器(2)至除污容器(8)的输出管道(302) 线路，用于排出渗透液。除污容器(8)包括至少一个废品容器(例如，罐)用于临时储存系统中产生的不需要的材料或过程副产品。
所述浓缩器通过减少液体总体积但并未减少液体中目标分子的含量，从而提高了液体中目标生物分子的含量。因此，所公开系统的当前实施例提供用于对包含目标生物分子的浓缩液体渗余物进行再循环，使所述液体通过同一浓缩器(2)再循环，将所述生物分子进一步浓缩。由于采用液体循环，得到了高度浓缩的生物分子产品，因此，这种配置使总系统的设计能够减少需要的下游工艺数量。
图2A示出了根据本公开另一个实施例的用于制备生物分子的系统的示意图。
所述示意图示出了一种制备生物分子的系统，包括：生物反应器(1)，其包括接收含细胞和病毒颗粒的液体的腔室；和浓缩器(2)，其中所述浓缩器配备渗余物输出管(303)，其收集浓缩器输出物并将渗余物输出物再循环到位于所述浓缩器(2)和所述生物反应器(1) 之间的中间容器(4)或浓缩器瓶的输入口。所述生物反应器(1)和中间容器(4)通过管道连接，方便将液体从所述生物反应器(1)输送至所述中间容器(4)。或者，可以设置直接连接生物反应器(1)和浓缩器(2)的其他管道(图中未示出)，用于将液体从生物反应器(1) 输送至浓缩器(2)。此外，所述中间容器(4)和浓缩器(2)还通过配备泵(5)的管道(306) 连接，方便将液体从中间容器(4)输送到浓缩器(2)。所述浓缩器通过减少液体总体积但并未减少液体中目标分子的含量，从而提高了液体中目标生物分子的含量。
在一个实施例中，提供两处气体连接，一处连接(304)进入生物反应器(1)，一处连接 (305)离开所述生物反应器(1)。所述生物反应器(1)进一步连接接种容器(10)及用于调节生物反应器(1)中pH值的碱(13)进口(inlet)，接种容器(10)包含在生长培养基中的清洗干净的、脱落的和中和的细胞预培养物。
多种类型的浓缩器可以适合用于所述系统，根据此实施例，所述系统配备作为浓缩器使用的切向流过滤装置(TFF)。配备TFF，从而基本上截留所有目标生物分子，同时允许更小的污染物，如生长培养基和溶质，通过膜孔。为了这一目的及在可能的实施例中，所述TFF 可以配备至少一种具有特定孔隙度的中空纤维，例如，孔隙度足够截留渗余物中所有目标生物分子，同时允许更小的污染物，如生长培养基和溶质，留在渗透液中。TFF浓缩器(2)调节包含目标生物分子的渗余物再循环到中间容器(4)的输入口(input)。配备从TFF浓缩器 (2)至除污容器(8)的输出管道(307)线路，用于排出渗透液。除污容器(8)包括至少一个废品容器(例如，罐)用于临时储存系统中产生的不需要的材料或过程副产品。所述系统管道配备泵(5，501)和阀门(6)以提供定向液体流动，控制或引起系统不同部分之间的压差，使液体以交叉流方式通过TFF浓缩器(2)。
所述浓缩器(2)通过减少液体总体积但并未减少液体中目标分子的含量，从而提高了液体中目标生物分子的含量。通过所述系统减少液体体积可以缩小工业级生物分子制备所需基础设施的规模，从而还可以降低易耗品的消耗量。此外，本系统的TFF浓缩器(2)以连续灌注模式自动操作。这样最大限度地减少了人为干预，从而限制了安全风险，并降低了费用。
图2B示出了能够执行图2A所示方案的系统。
所示系统设计用于在生物安全柜内或隔离器内使用，可用于生物材料的过程开发工作和中试规模生产，在这种情况下，可用于生产用于临床试验以及小规模商业生产的材料。所述系统设计用于培养粘附细胞，以及非粘附细胞。为此，所述系统包括生物反应器(1)，优选是固定床生物反应器。所述生物反应器的固定床可以配备结构元件，让细胞在所述元件表面生长。所述元件的示例在PCT/EP2017/078775中给出，通过引用，该专利被纳入本发明中，该专利描述了一种螺旋结构，可以让细胞生长，且促进流体分布和湍流。所述元件可以采用聚乙烯制造，优选采用亲水化聚乙烯制造。在一个实施例中，所述生物反应器(1)仅仅是单用途生物反应器。系统中用于液体或气体输送的管道未在图中示出。所述生物反应器(1)具有至少两处流体连接，其中一处连接允许流体输入到所述生物反应器内，第二处连接允许移出流体。后一处连接的设计应最大限度地减少生物反应器(1)排空后的死空间。在另一个实施例中，所述生物反应器(1)配备气体连接，用于气体输入和/或输出。在优选的实施例中，存在三处气体连接，两处连接进入所述生物反应器(1)，一处连接离开所述生物反应器(1)。此外，有利地是，所述生物反应器(1)设计为可以进行取样，用于过程中控制和过程结束分析，优选从所述生物反应器(1)顶部取样。取样可以采用注射器或相当组件完成。
生物反应器(1)内的循环通过利用推进器，优选磁力驱动推进器，实现。可以配备加热元件，用于加热所述生物反应器(1)内的内容物，或将加热介质引入到所述生物反应器(1)。所述生物反应器(1)的盖子配备一个或多个传感器，用于测定所述生物反应器(1)中的温度、pH和/或溶解氧。
所述生物反应器(1)的液体输出物通过管道被输送到中间容器(4)，该中间容器亦称为浓缩器瓶。所述中间容器(4)可以是PET瓶，可以容纳大约500ml至5000mL的容积。该中间容器(4)与浓缩器(2)连接，浓缩器(2)可以是TFF。来自中间容器(4)且包含目标生物分子的液体将通过泵(501)被输送到浓缩器(2)。在一个实施例中，所述泵(501) 能够在浓缩器(2)内提供2000s-1的剪切速率。然后，所述浓缩器(2)的渗余物将被送回到中间容器(4)，而液体废物将被排出(优选输送到废液瓶内，图2B中未示出)。由于渗余物在中间容器(4)和浓缩器(2)之间来回再循环，因此，将得到高度浓缩的生物分子产品，可用于进一步下游处理(如色谱纯化)或用于试验，例如，临床试验。
从生物反应器(1)至浓缩器(2)的工艺流程通过过程控制器控制。为了保持所述系统的紧凑性，特别是考虑其尺寸设计适于在生物安全柜或隔离器内使用，所述控制器集成在坞站(30)内，该坞站设计用于接收上述生物反应器(1)、浓缩器(2)和中间容器(4)。所述控制器控制和操作生物反应器参数以及工艺流程参数，监测和记录上述一个或多个传感器的数据(pH、温度和/或DO)。所述控制器进一步控制浓缩器(2)的功能及渗余物在浓缩器(2)至中间容器(4)之间往复再循环，优选通过控制位于中间容器(4)和浓缩器(2)之间的泵(5，501)完成控制。
为此，所述控制器配备能够监测、控制和记录工艺流程和系统参数的软件。通过可插接到控制器的计算机，用户可以访问控制器。所述控制器可以通过所述坞站上的一个或多个USB 连接输出数据，并允许访问IT网络。坞站上的屏幕(29)(如触摸屏)使用户能够跟踪工艺流程和测定的参数，以及例如，通过启动或停止某些子过程，手动操作系统。
如上所述，所述配备集成控制器的坞站(30)进一步允许配置一个瓶子，用于为所述生物反应器(1)供应碱(13)。所述瓶子可以是PET瓶，容积是500ml至5000ml。所述坞站(30)可以进一步配置为所述生物反应器(1)供应接种体(10)/添加剂的瓶子(未示出)。可以配备用于收集可能的液体溢流的保留盘(retention tray)。
所述坞站(30)将优选采用能够用NaOH(如0.5M NaOH)溶液、醇(如乙醇)或杀病毒剂(如Virkon)清洗的材料制造。同样，所述坞站(30)应能够耐受汽化过氧化氢(VHP) 消毒。在一个优选的实施例中，所述坞站(30)的材料是耐腐蚀金属。所述坞站(30)可以通过电源，如标准110-230V,50-60Hz电源供电。
因此，本公开还涉及一种便携式生物分子制备设施，包括生物反应器和浓缩器(如TFF)，其中所述生物反应器和浓缩器之间设置一中间容器，其中所述中间容器和浓缩器通过渗余物管道连接，使液体从浓缩器输出口至所述中间容器输入口间再循环，其中所述生物反应器、浓缩器和中间容器都存在于便携式坞站内，所述坞站包括能够控制生物分子制备过程的集成控制器。
图3和图4示出了本公开实施例的用于制备和纯化病毒的系统的示意图。
所述系统的上游处理步骤包括在生物反应器(1)内制备病毒颗粒及采用浓缩器(2)浓缩细胞培养收获液。上游处理步骤(USP)的设备优选放置在生物安全柜内或隔离器(14) 内。
得到制备所需生物分子的细胞预培养液，用于在生物反应器(1)中接种。在接种之前，安装所述生物反应器(1)，从生长培养基罐(9)提供生长培养基，所述培养基利用至少一台泵(502)被供应到生物反应器(1)。在输送到所述生物反应器之前，所述培养基最好先预热到25℃至37℃，并进行混合。这样可以确保细胞接触新培养基时不会受到冷冲击(这样将对其生长不利)，以及确保培养基内的所有营养物质都混合均匀，且含量符合要求。培养基可以是液体，所述液体包含定义明确的盐、氨基酸、维生素、碳水化合物、脂质和一种或多种蛋白质生长因子的混合物。所述培养基用于向细胞供应营养物质，并且反之，用于脱除废产品和防止代谢废物积聚中毒。细胞培养参数亦在接种前定义。在图3的实施例中，所述生物反应器(1)进一步通过管道与接种容器(10)和添加剂容器(11)连接，所述接种容器(10) 包含在合适的生长培养基中清洗干净的、脱落的和中和的细胞预培养液，所述添加剂容器(11) 包含本领域技术人员已知的其它添加剂，如生长因子。所述生物反应器(1)可以进一步配备气体进口(未示出)和/或出口(305)以及碱(13)进口，用于调节所述生物反应器(1)的 pH。接种后，所述生物反应器(1)优选以间歇模式操作2至6小时，优选3至4小时。在下一步中，所述细胞生长合适的时间或直到达到期望的细胞密度。在此细胞生长期间，所述生物反应器(1)优选按灌注模式操作。在一个实施例中，系统中正好在所述生物反应器前后配备泵(502和503)，用于控制通过生物反应器(1)的培养基的流量。在用期望病毒感染细胞之前，通过采用适合病毒颗粒制备的生长培养基稀释，对所用生长培养基进行交换。将被排出的生长培养基收集在除污容器(8)内。或者，通过排出生物反应器内的生长培养基，然后向生长反应器供应适合病毒颗粒制备的生长培养基，从而交换生长培养基。向生物反应器(1)供应病毒种，然后，所述生物反应器(1)优选按间歇模式操作1-4小时，更优选2小时，实现细胞感染。
本公开所述制备和纯化生物分子的方法采用安装在系统管道上的泵(5、501、502、503) 和阀门(6)，引导液体定向流过系统，且使系统不同部分可逆连接和断开。
在下一步中，开始制备病毒。其中所述生物反应器(1)是以灌注模式操作，与浓缩顺序连接。其中所述生物反应器(1)、浓缩器(2)和中间容器(4)之间的阀门和泵(当系统中配备时)打开或启动。为了避免浓缩器(2)内超滤装置堵塞，所述液体首先通过预过滤器(7)脱除其中较大的固体颗粒，但目标生物分子能够透过。预过滤器的孔径优选是大约125μm，截留分子量是大约100kDa。按照本文公开的方法，所述液体的浓缩通过使液体穿过浓缩器(2)进行，所述浓缩器(2)是超滤装置，优选是切向流过滤(TFF)装置，更优选是中空纤维TFF。这种TFF在有限的时间内按连续模式操作，将主要是液体和小溶质的渗透液排出到除污容器(8)内，浓缩目标生物分子，同时，将渗余物内包含的大部分目标生物分子再循环到中间容器(4)(图3所示)或生物反应器(1)内(图4所示)。这样，在进一步的下游处理之前，显著降低了包含目标生物分子的液体的体积。
当病毒制备阶段达到峰值后，将在浓缩器(2)和中间容器(4)或生物反应器(1)之间再循环的渗余物收集在中间容器(4)内进行收获。然后，运行系统，但不向生物反应器(1)供应新的生长培养基。一旦生物反应器(1)被清空，在一个实施例中，在其内再次装满干净的培养基，并清洗要求的一段时间，然后，将所剩液体通过浓缩器再次浓缩，并再循环到中间容器(4)，直到实现所要求的体积缩减。最后，在所述中间容器(4)中收获所述浓缩器(2)的再循环输出物，从而得到浓缩的细胞培养收获液。或者，如图4所示，在缺少中间容器(4)的情况下，通过将在浓缩器(2)和生物反应器(1)之间再循环的渗余物收集在生物反应器(1)内进行收获。如上所述，如图3所示存在中间容器(4)作为系统的一部分时，其优点是可以清洗生物反应器(1)以收获剩余的液体，同时，仍然可以在进一步下游处理之前，通过浓缩器减少这种清洗液体的体积。
任选地，利用pH调节溶液(35)将浓缩细胞培养收获液的pH调节到下游工艺期望的数值，其中pH调节溶液(35)如图3所示，与中间容器(4)连接，或如图4所示，与生物反应器(1)连接，其中pH调节溶液未示出。此外，还可以任选地对浓缩细胞培养收获液执行核酸内切酶处理，降解浓缩细胞培养收获液中的DNA和RNA，同时保持蛋白质完好无损。核酸内切酶处理步骤可以防止浓缩细胞培养收获液聚集，从而为进一步的下游处理(DSP) 提供最佳条件。
根据图3和图4，系统中描述的用于DSP步骤的设备包括澄清室(19)、色谱室(21)及病毒灭活室(24)。
优选地，澄清室(19)和色谱室(21)都放置在单个生物安全柜或隔离器(141)内。澄清可视为DSP的第一个步骤，确保脱除来自前面收获的渗余物或细胞培养收获液中的细胞碎片和其它污染物。澄清室(19)可以包括，例如，多个阴离子交换深层过滤器(15)，脱除产品中残余的固体污染物，确保后续DSP步骤功能正常。在输送到系统色谱室(21)之前，将澄清的细胞培养收获液或澄清的渗余物收集在澄清收获液容器(20)内。色谱室(21)和澄清室(19)通过管道(22)连接，方便将液体从澄清室(19)输送到色谱室(21)。
色谱室(21)进一步纯化目标生物分子。色谱室(21)包括具有较高结合能力、能够在数量有限的周期内处理大量输入体积且适合连续模式操作的单台混合模式色谱装置(16)。色谱室(21)可以进一步包括色谱收获液容器(23)。由于通过系统第一部分所确保的体积减少，所述公开系统色谱室(21)内所需色谱装置(16)的规格相比现有技术更小。因此，所述系统能够削减与昂贵的大型色谱设备有关的费用。
第三隔离器(142)包括病毒灭活室(24)，其中所述病毒灭活室(24)和色谱室(21)通过管道(25)连接，方便将液体从色谱室(21)输送到病毒灭活室(24)。通过将色谱纯化后得到的纯化病毒在灭活容器(26)内用甲醛稀释，实现病毒灭活。病毒灭活后，可以在配制容器(27)中调节含灭活病毒颗粒的溶液的性质。调节包括，例如，调节溶液的盐浓度或 pH。
最后，包含大量纯化灭活病毒颗粒的溶液可以安全收集或输送到隔离器外面的散装容器内(28)。
图5和图6示出了根据本公开实施例的用于制备生物分子(例如，配制疫苗的抗体或病毒颗粒)的代表系统。
图5示出了根据本公开一个实施例的用于制备和纯化灭活脊髓灰质炎病毒的集成代表系统。该系统包括若干腔室，这些腔室位于在密闭罩(图6中示出)内三个不同的生物安全柜或隔离器(14、141和142)中。
第一隔离器(14)包括上游制备和纯化室，包括生物反应器(1)，其包括适合接收含细胞和病毒颗粒液体的腔室；以及浓缩器(2)，其中所述浓缩器(2)配备渗余物输出管(303)，收集浓缩器(2)的输出物，并将所述输出物(渗余物)再循环到位于所述浓缩器(2)和所述生物反应器(1)之间的中间容器(4)的输入口。
第二隔离器(141)包括澄清室(19)和色谱室(20)。上游制备和纯化室及澄清室(19) 通过管道连接，方便将液体从上游制备和纯化室输送到澄清室(19)。澄清可视为下游处理的第一个步骤，确保脱除来自前面收获的渗余物中的细胞碎片和其它污染物。澄清室(19)包括多个阴离子交换深层过滤器(15)，脱除产品中残余的固体污染物，确保后续下游处理步骤功能正常。在被输送到系统色谱室(21)之前，澄清的细胞培养收获液或澄清的渗余物被收集在澄清收获液容器(20)内。系统中安装澄清室允许紧凑的腔室操作，缩短了处理时间，从而有益于生物分子生产和纯化过程的总经济效益。
色谱室(21)进一步纯化目标生物分子。色谱室(21)和澄清室(19)通过管道(22)连接，方便将液体从澄清室(19)输送到色谱室(21)。色谱室(21)包括具有较高结合能力、能够在数量有限的周期内处理大量输入体积且适合连续模式操作的单台混合模式色谱装置(16)。色谱室(21)可以进一步包括一个或多个色谱收获液容器(23)。由于通过系统第一部分所确保的体积减少，所述公开系统色谱室(21)内所需色谱装置(16)的规格相比现有技术更小。例如，本公开系统色谱柱可以缩小100倍。因此，所述系统能够削减与昂贵的大型色谱设备有关的费用。此外，在现有技术中，生物分子的制备和纯化系统通常需要两台串联的色谱装置，与此相比，本发明的系统在色谱室(21)内仅需配备单步色谱装置(16)即可确保相当的生物分子纯度和收率。这样大幅减少了生物分子制备所占用的空间、明显降低了生产成本及显著缩短了生产时间，从而提高了生产能力，同时，可以在整个系统内维持较低的工艺体积。
第三隔离器(142)包括病毒灭活室(24)，其中所述病毒灭活室(24)和色谱室(21)通过管道(25)连接，方便将液体从色谱室(21)输送到病毒灭活室(24)。通过将色谱纯化后得到的纯化病毒在灭活容器(26)内用甲醛稀释，实现病毒灭活。病毒灭活后，可以在配制容器(27)中调节含灭活病毒颗粒的溶液的性质。
不同的隔离器或安全柜(14、141、142)可以采用这些分隔器之间的隔断(31)彼此连接或隔开，隔断(31)可以处于打开或关闭配置。图5所示隔断(31)可以采用透明材料制造。所述隔断的打开和关闭也可以通过过程产生的输入信号，例如，终止某项任务(例如，病毒灭活)，由过程控制装置(图5未示出)自动控制，从而进一步确保系统的安全使用。所述隔断可以配备允许管道穿过的开孔。
由于系统中每个腔室的优化，每个腔室结构紧凑，可以将属于系统的所有腔室都集成在包含若干隔离器(14、141、142)的单个密闭罩(32)内，如图6所示。根据图6所示实施例，密闭罩(32)进一步包括多个除污容器(未示出)、除污室、高压灭菌器(34)及用于样品等分的隔离器或生物安全柜(143)，除污容器包含至少一个废品罐，用于临时储存系统中产生的不要的材料或过程副产品。采用这种系统时，系统中每个腔室的优化不仅减少了所需空间，而且还增强了安全性。此外，各腔室之间的连接使生产和纯化步骤可以在产品不离开隔离器(14、141、142)的情况下执行，从而确保最大限度地降低了安全风险。
所述系统包括控制和操作生物反应器参数及工艺流程参数的过程控制装置或控制器。控制器进一步监测和记录整个系统中测定例如pH、温度和/或DO的一个或多个传感器的数据。此外，过程控制装置或控制器控制密闭罩(32)入口和/或出口(33)的打开和关闭，以及不同腔室或隔离器(14、141、142)之间可再密封的分隔或隔断(31)的锁定和解锁。在此实施例中，各腔室通过可再密封的玻璃门(31)可逆地隔开。控制器配备屏幕(29)，使用户能够跟踪工艺流程和测定的参数，以及例如，通过启动或停止某些子过程，手动操作系统。
进入系统密闭罩(32)的操作人员(17)保持在隔开的各腔室外面(14、141、142、143)。为了实现采集供质量控制程序使用的样品，被隔开的各腔室配备软套(18)，操作人员(17) 通过软套(18)，实现限制性间接进入各腔室内，但各腔室内的内容物与操作人员(17)仍然保持隔离。将隔离器(14、141、142、143)和密闭罩(32)作为系统一部分集成，能够以更简单且成本更低的方式满足生物安全规则要求，降低了污染环境和操作人员的风险。
该系统适合生物分子(如纯化和灭活病毒)的自动化监控性大规模GMP生产。

Claims (34)

1.用于制备生物分子的系统，包括：
-生物反应器，其包括适合接收含目标生物分子的液体的腔室；以及
-浓缩器，其中所述浓缩器配备适合收集渗余物的渗余物管道，方便将所述渗余物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器的输入口。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物反应器和所述浓缩器通过管道连接，方便将液体从所述生物反应器输送至所述浓缩器。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物反应器和中间容器通过管道连接，方便将液体从所述生物反应器输送至所述中间容器，并且其中所述中间容器和所述浓缩器通过管道连接，方便将液体从所述中间容器输送至所述浓缩器。
4.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述生物反应器是灌注式生物反应器。
5.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述生物反应器是间歇式生物反应器。
6.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述管道配备一台或多台泵，使所述液体以交叉流方式通过所述浓缩器。
7.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述浓缩器是超滤或微滤装置。
8.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述浓缩器是切向流过滤装置。
9.根据权利要求2所述的系统，其中所述生物反应器和所述浓缩器之间设置一过滤器。
10.根据权利要求3所述的系统，其中所述生物反应器和所述中间容器之间设置一过滤器。
11.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括除污容器。
12.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统包括澄清室。
13.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统包括色谱室。
14.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统包括病毒灭活室。
15.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统包括密闭罩。
16.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述各腔室通过隔断彼此连接或隔开，其中所述隔断可以处于打开或关闭配置。
17.根据前述权利要求任一项所述的系统，其中所述系统包括用于自动控制系统的过程控制装置。
18.用于纯化生物分子(如病毒)的系统，包括：
-上游工艺室，包括固定床灌注式生物反应器，所述生物反应器包括适合接收含目标分子的液体的腔室；和浓缩器，优选TFF，其中所述浓缩器配备渗余物管道，适合用于收集液体输出物，如来自所述浓缩器的渗余物，并将所述液体输出物再循环到所述生物反应器的输入口或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器的输入口；
-澄清室；
-色谱室；以及
-任选地病毒灭活室；
其中所述各腔室位于一个或多个隔离器内。
19.用于制备生物分子的方法，其中所述生物分子在含有液体的生物反应器中制备，所述方法包括浓缩步骤，其中所述生物反应器的输出物在浓缩器内进行浓缩，其中所述浓缩器的输出物被再循环到所述生物反应器或位于所述浓缩器和所述生物反应器之间的中间容器。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物反应器以灌注模式和/或间歇模式操作。
21.根据权利要求19-20所述的方法，其中所述泵用于引导所述液体的定向流动。
22.根据权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述浓缩器是超滤或微滤装置。
23.根据权利要求19-22任一项所述的方法，其中所述浓缩器是切向流过滤装置。
24.根据权利要求19-23任一项所述的方法，其中所述液体在被输送到所述浓缩器之前先通过过滤器。
25.根据权利要求19-24任一项所述的方法，其中所述液体在被输送到所述中间容器之前先通过过滤器。
26.根据权利要求19-25任一项所述的方法，其中从所述中间容器收获所述浓缩器的再循环输出物，从而得到浓缩的细胞培养收获液。
27.根据权利要求19-26任一项所述的方法，其中对所述浓缩的细胞培养收获液进行澄清，从而得到澄清的细胞培养收获液。
28.根据权利要求19-27任一项所述的方法，其中通过对所述澄清的细胞培养收获液执行色谱步骤，从而对所述的生物分子进一步纯化。
29.根据权利要求19-28任一项所述的方法，其中所述生物分子是病毒。
30.根据权利要求19-29任一项所述的方法，其中所述病毒采用甲醛灭活。
31.根据权利要求19-30任一项所述的方法，其中所述生物分子是纯化的灭活病毒。
32.权利要求1至18任一项所述的系统用于制备生物分子的用途，所述生物分子为例如蛋白质、病毒和/或病毒疫苗。
33.根据权利要求32所述的系统的用途，其中所述生物分子用于配制病毒疫苗，优选灭活脊髓灰质炎疫苗。
34.一种集成生物反应器平台，包括坞站和集成控制器，其中所述坞站适于接收生物反应器和中间容器。
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